沈禹辰， 劉苗苗， 李建豪， 夏燕云， 李吉辰， 樸松林

（哈爾濱醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江 哈爾濱 150001）

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）簡稱頭頸部鱗癌，是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤， 且發(fā)病率逐年上升。 Bray 等[1]于2018 年統(tǒng)計的癌癥報告顯示，HNSCC 全球發(fā)病人數(shù)約355 000 例， 死亡人數(shù)約177 000 例， 在美拉尼西亞的發(fā)病率最高。 誘發(fā)HNSCC 的原因眾多，包括遺傳傾向、化學制劑、輻射、吸煙、飲酒等[2]。 在過去的30 年里，盡管HNSCC 的治療有了很大的改善， 但5 年生存率仍然很低，僅為50%~55%[1]。 因此，尋找HNSCC 發(fā)生、發(fā)展的潛在影響因子，幫助預測腫瘤行為和指導治療是亟須解決的難題。

鈣粘蛋白11（CDH11），也稱成骨細胞鈣粘蛋白，是一種Ⅱ型經(jīng)典鈣粘蛋白，其首次在成骨細胞中被發(fā)現(xiàn)， 是一種參與細胞-細胞粘附的完整膜蛋白，可能在骨的發(fā)育和維持中發(fā)揮作用[3]。 有研究表明，CDH11 在前列腺癌和乳腺癌中促進侵襲和轉(zhuǎn)移，尤其是在乳腺癌中， 由于癌細胞對高度表達CDH11的成骨細胞的高親和力， 使CDH11 促進癌細胞的骨轉(zhuǎn)移[4-5]。 然而在食管癌、結直腸癌和胃癌中，CDH11 被甲基化沉默，并具有抑癌作用，能抑制食管癌和鼻咽癌細胞的侵襲和遷移[6-7]。 由于CDH11功能的差異性，在研究其對腫瘤發(fā)展過程中的影響時，需充分考慮細胞環(huán)境因素。 由于CDH11 在口腔鱗癌中的表達與功能尚不明確，所以本研究旨在通過選擇性地對CDH11 進行沉默，檢測HNSCC 行為及分子水平改變，進而揭示其在HNSCC 中的功能，以期為研究HNSCC 的發(fā)病機制并遏制其侵襲轉(zhuǎn)移行為提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細胞來源

UM-SCC-29 和UM-SCC-47 頭頸部鱗癌細胞系均由美國密歇根大學Carey 教授饋贈；HOK16B 永生化角質(zhì)形成細胞由美國加州大學洛杉磯分校的Park 博士饋贈。

1.2 主要試劑

CDH11 兔抗人單克隆抗體購自美國CST 公司（編號：A16652），E-鈣粘蛋白單克隆抗體購自美國BD 公司（編號：610182），Twist-1 單克隆抗體購自美國Proteintech 公司（編號：25465-1-AP）， 肌動蛋白（Actin） 單克隆抗體購自美國BD 公司 （編號：612656），RNAiMAX 轉(zhuǎn) 染 試 劑 購 自 美 國Invitrogen公司， 細胞裂解液購自美國CST 公司，siRNA7 和siRNA78 均購自美國Dharmacon 公司，BCA 試劑盒購自沈陽萬類生物公司。

1.3 Western 印跡法

應用細胞裂解液對細胞進行裂解，離心取得的上清液即為細胞總蛋白。 應用BCA 法測定樣本蛋白濃度。應用Bio-Rad mini 4 分析系統(tǒng)，應用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）快速制膠試劑盒（上海雅酶生物科技公司）進行凝膠的制備，在蛋白質(zhì)樣品中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴，冰上靜置3 min，上樣量20 μL，并加入5 μL標志物，進行電泳。 于電轉(zhuǎn)液中進行轉(zhuǎn)膜。 應用含5%脫脂奶粉的封閉液慢搖1.5 h。TBST 緩沖液洗膜3 次，倒入帶抗體的封閉液，過夜。TBST 緩沖液洗膜3 次，倒入帶有二抗的封閉液。 TBST 緩沖液洗膜3次，應用超敏增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑進行化學發(fā)光，并上機成像。

1.4 轉(zhuǎn)染

為了下調(diào)HNSCC 細胞系中CDH11 的表達，我們用小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）對細胞系進行轉(zhuǎn)染。 選取的空白對照組遵循如下序列：siNT：5′-GUGAUUUCAUAGCGAGUUU-3′； 實驗組選取了2 種siRNA，分別遵循如下序列：siCDH11-7：5′-GGAAAUAGCGCCAAGUUAG-3′，siCDH11-8：5′-CCUUAUGACUCCAUUCAAA-3′。將HNSCC 細胞接種在6 孔板中， 并使用RNAiMAX 試劑盒轉(zhuǎn)染siRNA。

1.5 細胞增殖檢測

細胞轉(zhuǎn)染后24~48 h， 細胞以等密度接種（UMSCC-29 細胞：1×104個，UM-SCC-47 細胞：2×104個）。用Countess 全自動細胞計數(shù)儀 （美國Invitrogen 公司）在第1、3、5 天對活細胞、非活細胞和總細胞進行定量。

1.6 細胞侵襲實驗

細胞轉(zhuǎn)染后24~72 h，將基質(zhì)膠（美國BD 公司）按1∶8 稀釋，包被Transwell 小室底部膜的上室面，置于37 ℃孵箱使基質(zhì)膠聚合；制作細胞懸液，將200 μL 細胞懸液加入Transwell 小室，培養(yǎng)細胞36 h； 取出Transwell 小室， 無鈣磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 遍，將未遷移細胞用甲醇固定， 用0.1%結晶紫染色， PBS 清洗3 遍；400 倍顯微鏡下隨機選取5 個視野觀察細胞，計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用Image J 軟件對Western 印跡法圖像進行分析， 采用GraphPad prism 7.0 軟件對基因間的數(shù)據(jù)進行處理。 統(tǒng)計學方法采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western 印跡法

我們應用Western 印跡法對多組HNSCC 細胞系及非惡性永生化角質(zhì)形成細胞 （HOK16B 細胞）進行檢測。 結果顯示：CDH11 在UM-SCC-29 和UMSCC-47 細胞中表達高于在HOK-16B 細胞中（圖1A）。侵襲是HNSCC 的一個重要特征， 與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞間粘附喪失相關。 由于CDH11 在多種癌癥中對侵襲、轉(zhuǎn)移有不同的調(diào)節(jié)作用，我們研究了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物的表達與CDH11 的相關性[4-8]。應用Western 印跡法對HNSCC 細胞系及角質(zhì)形成細胞中的上皮標志物（E-鈣粘蛋白）和間充質(zhì)標志物（Twist-1）進行檢測，用肌動蛋白（Actin）做對照。結果顯示，與HOK16B 細胞相比，UM-SCC-29 和UM-SCC-47 細胞中E-鈣粘蛋白的表達上調(diào)，而Twist-1 的表達下調(diào)（圖1B）。我們猜測高水平CDH11可能促進E-鈣粘蛋白的表達，抑制Twist-1 的表達。

圖1 CDH11 及上皮和間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物在HNSCC 細胞及HOK16B 細胞中的表達情況Figure 1 Expression of CDH11 and epithelial mesenchymal transformation markers in HNSCC cells and HOK16B cells

2.2 轉(zhuǎn)染

我們選擇了siRNA7、siRNA8，通過Western 印跡法證實其對細胞內(nèi)CDH11 有下調(diào)作用 （圖2A、2B）。 在降低CDH11 表達后，檢測上皮和間充質(zhì)標志物以確定CDH11 是否對其有負調(diào)節(jié)作用。 結果顯示： 在UM-SCC-29 細胞中，Twist-1 與CDH11 表達呈負相關，而與E-鈣粘蛋白表達呈正相關（圖2C）；在UM-SCC-47 細胞中，E-鈣粘蛋白與CDH11 呈正相關，與Twist-1 表達呈顯著負相關（圖2D）。重要的是，在HNSCC 細胞中降低CDH11 表達后，顯微鏡下可以觀察到細胞間粘附降低（圖3）。 因此，CDH11的表達與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化呈負相關關系，其中包括上調(diào)上皮標志物（E-鈣粘蛋白）及下調(diào)間充質(zhì)標志物（Twist-1）。

圖2 CDH11 被沉默后HNSCC 細胞中上皮和間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物表達變化情況Figure 2 Changes in the expression of epithelial and mesenchymal transformation marker in HNSCC cells after CDH11 was knocked down

圖3 轉(zhuǎn)染后HNSCC 細胞形態(tài)的變化（×4）Figure 3 Changes in cell morphology after transfection of HNSCC cells（×4）

2.3 細胞增殖與侵襲實驗

siRNA7、siRNA8 誘導的2 種細胞系（UM-SCC-29、UM-SCC-47）在72 h 時，增殖能力增強；在120 h時，增殖能力顯著增強（圖4）。侵襲是一種促進腫瘤擴散的致癌行為。 如圖5A 所示，轉(zhuǎn)染36 h 時，分別經(jīng)siRNA7、siRNA8 沉默CDH11 后，UM-SCC-29 細胞侵襲能力均增強 （siRNA7:P＜0.001，siRNA8:P＜0.05）； 如圖5B 所示，UM-SCC-47 細胞侵襲能力均增強（siRNA7:P＜0.05，siRNA8:P＜0.01）。 這些發(fā)現(xiàn)與圖2C、2D 中的結果一致， 證實了CDH11 作為HNSCC 中抑癌基因的作用。

圖4 HNSCC 細胞轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力的變化Figure 4 Changes in cell proliferation after transfection of HNSCC cells

圖5 HNSCC 細胞轉(zhuǎn)染36 h 后細胞侵襲能力的變化Figure 5 Changes in cell invasion after transfection for 36 h of HNSCC cells

3 討論

鈣粘蛋白是一種跨膜糖蛋白，通過鈣依賴性相互作用調(diào)節(jié)細胞間的親和力[9]。 鈣粘蛋白含有一個帶負電荷的結構域，它可以與Ca2+結合，而鈣粘蛋白家族成員間的細胞質(zhì)結構域有所差異[3]。 鈣粘蛋白超家族成員超過80 個，而CDH11 是鈣粘蛋白超家族經(jīng)典亞類的成員[3,9]。Ⅰ型經(jīng)典鈣粘蛋白包括：E-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白1，N-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白2，P-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白3，R-鈣粘蛋白/鈣粘蛋白4，CDH11 屬于Ⅱ型經(jīng)典鈣粘蛋白[9]。 其他鈣粘蛋白包括原生鈣粘蛋白、橋粒鈣粘蛋白、七通道跨膜鈣粘蛋白和Ret 酪氨酸激酶[9]。 經(jīng)典的鈣粘蛋白調(diào)節(jié)細胞間的相互作用、組織穩(wěn)態(tài)和組織形態(tài)的形成。 一個細胞上的鈣粘蛋白同型二聚體與另一個細胞上的同型二聚體結合形成轉(zhuǎn)二聚體，促進細胞間的粘附。 鑒于這些重要作用，鈣粘蛋白的破壞會引起細胞正常功能的失調(diào)，進而引發(fā)疾病的產(chǎn)生[10]。

CDH11 基因位于16 號染色體上[11]，其與成骨細胞分化相關， 促進軟骨成骨， 抑制脂肪生成[3,9]。CDH11 可以促進前列腺癌細胞的侵襲和骨轉(zhuǎn)移，在結直腸腫瘤中表達上調(diào)[5,8,12]。 但Mueller 等[13]發(fā)現(xiàn)黑色素瘤組織中CDH11 的表達缺失。Marchong 等[6]發(fā)現(xiàn)CDH11 在視網(wǎng)膜母細胞瘤中發(fā)生基因組缺失，且其缺失與腫瘤侵襲能力增加有關。 在視網(wǎng)膜母細胞瘤和惡性嗜鉻細胞瘤中的研究表明，CDH11 具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[6,14]。 此外，CDH11 的表達升高一定程度上降低了肺癌的轉(zhuǎn)移潛能， 并在骨肉瘤中成為了一種提示預后較好的預測因子[15]。 有關CDH11 與腫瘤關系的研究目前仍存在爭議， 不同類型癌癥的CDH11 致癌或抑癌功能也不盡相同。本研究中，Western 印跡法的結果顯示，上皮標志物（E-鈣粘蛋白） 表達水平較高， 而間充質(zhì)標志物（Twist-1） 表 達 水 平 較 低 的HNSCC 細 胞 系，其CDH11 的表達水平較正常細胞有所提高，即與正常角質(zhì)細胞相比，在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程尚未發(fā)生或在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化水平較低的HNSCC 細胞中，CDH11 呈現(xiàn)較高的表達水平。 在功能研究中，我們發(fā)現(xiàn)降低CDH11 的表達后，HNSCC 細胞上皮標志物 （E-鈣粘蛋白） 的表達降低， 而間充質(zhì)標志物（Twist-1）的表達升高，且出現(xiàn)了細胞間粘附能力降低、增殖能力增強、侵襲能力加強的表現(xiàn)，這充分說明了CDH11 在HNSCC 細胞中具有抑制腫瘤細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的作用。 雖然在本研究中，CDH11 的表達水平升高， 但其對HNSCC 細胞系的功能影響與Mueller 等[13]、Marchong 等[6]的研究結果相一致。

綜上所述， 不同種類HNSCC 細胞系的組織來源各異，如此前提到，對CDH11 的研究應考慮腫瘤細胞的來源。 本實驗中的CDH11 雖在UM-SCC-29、UM-SCC-47 細胞中總體呈現(xiàn)高表達的趨勢，但其在其他來源HNSCC 細胞系的表達情況需進一步研究。 CDH11 在調(diào)控腫瘤細胞的過程中，可能對多種不同的信號通路均有影響。 近期的研究表明，CDH11 通過調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）來調(diào)節(jié)經(jīng)典WNT 信號通路[16]，這為我們發(fā)掘CDH11 調(diào)控腫瘤尤其是HNSCC 的機制，提供了有力依據(jù)。 為了更好地利用CDH11 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，促進腫瘤生物治療的發(fā)展， 有關CDH11 在HNSCC中發(fā)生、發(fā)展的分子機制有待進一步研究。