彭大穎

(遼寧省盤(pán)錦遼油寶石花醫(yī)院 病理科, 遼寧 盤(pán)錦, 124000)

近年來(lái), 甲狀腺癌的發(fā)病率逐年升高，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是臨床上最為常見(jiàn)的類型，占全部甲狀腺癌病例的85%～90%[1]。絕大多數(shù)PTC患者可通過(guò)有效的治療獲得較好的預(yù)后，總體病死率較低。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[2]顯示，晚期甲狀腺癌的發(fā)病率和死亡率仍呈上升的趨勢(shì)。研究[3]發(fā)現(xiàn)，少數(shù)PTC患者會(huì)出現(xiàn)失分化現(xiàn)象，發(fā)展為失去攝碘能力的難治性PTC, 還有部分病灶直徑小于1 cm的甲狀腺微小乳頭狀癌(PTMC)可表現(xiàn)為早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增大了治療的難度，對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生不良影響。因此，根據(jù)術(shù)前診斷結(jié)果制訂合理的治療方案是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

目前臨床上對(duì)于PTC的篩查主要依靠甲狀腺超聲檢查，而進(jìn)一步的確診一般需要在超聲引導(dǎo)下行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(FNA)。盡管FNA的診斷特異性較好，但仍有40%的FNA結(jié)果不能做出明確的診斷[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，鼠類肉瘤濾過(guò)性毒素菌致癌同源體B1(BRAF)、RAS、轉(zhuǎn)染中重排(RET)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、p53等多種基因結(jié)構(gòu)和功能的變化均與PTC密切相關(guān)，并可用于輔助診斷，但目前這些癌基因的檢測(cè)和診斷手段仍然存在許多不足，檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性也無(wú)法滿足臨床需求。BRAF基因V600E(BRAFV600E)突變是PTC最常見(jiàn)的基因突變類型，一般認(rèn)為約45%的PTC患者存在BRAFV600E基因突變，但臨床病理研究[6]報(bào)道中的突變率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這一數(shù)值，因而B(niǎo)RAFV600E基因常被作為一種特異性基因用于PTC的診斷和預(yù)后評(píng)估。然而，對(duì)術(shù)前穿刺活檢的BRAFV600E基因突變檢測(cè)能否作為PTC的可靠診斷方法仍具有較大爭(zhēng)議?；谏鲜霈F(xiàn)狀，本研究分析BRAFV600E基因突變檢測(cè)在PTC診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2017年12月—2019 年10月盤(pán)錦遼油寶石花醫(yī)院收治的82例PTC患者作為研究組，選取同期80例甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者作為對(duì)照組。2組患者均簽署知情同意書(shū)，自愿參與本研究。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 患者擇期行甲狀腺切除術(shù)，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診; ② PTC及甲狀腺良性結(jié)節(jié)的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)制定的《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]; ③ 患者年齡均大于18歲，臨床資料完整; ④ 患者術(shù)前均在超聲引導(dǎo)下行FNA檢查。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并其他部位惡性腫瘤、肝腎功能不全、心腦血管意外、免疫缺陷病、血液疾病的患者; ② 復(fù)發(fā)或術(shù)前已接受過(guò)抗腫瘤治療的患者; ③ 孕婦或乳母。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 甲狀腺病灶組織BRAFV600E基因突變檢測(cè): 收集FNA檢測(cè)所得活檢組織，采用DNA提取試劑盒提取DNA, 采用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，將符合要求的DNA稀釋至100 ng/μL, 置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。采用7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，引物序列采用BRAFV600E基因第 15 號(hào)外顯子引物。引物序列: 正向引物為5′-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3′, 反向引物為5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′, 反應(yīng)體系為26 μL。反應(yīng)程序: 預(yù)變性95 ℃下5 min, 變性95 ℃下30 s, 退火5 ℃下30 s, 延伸72 ℃下30 s, 長(zhǎng)延伸72℃下8 min, 保存于4 ℃環(huán)境下，共反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。當(dāng)待測(cè)樣品反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定界值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)閾值(Ct)≥28時(shí)，判定為BRAFV600E基因野生型(陰性); 若待測(cè)樣品Ct<28, 判定為BRAFV600E基因突變型(陽(yáng)性)。

1.2.2 PTC患者的臨床病理特征調(diào)查：通過(guò)查閱病歷的方式對(duì)研究組患者的年齡、性別、是否為PTMC、病灶數(shù)、甲狀腺外浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理特征進(jìn)行調(diào)查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示，樣本率和構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法, BRAFV600E基因突變?cè)\斷PTC的價(jià)值采用受試者工作特征(ROC)曲線進(jìn)行分析，將曲線下面積(AUC)作為診斷價(jià)值衡量指標(biāo)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者術(shù)前穿刺活檢組織BRAFV600E基因突變情況比較

研究組和對(duì)照組分別有57例和4例患者的活檢組織中檢出BRAFV600E基因突變，陽(yáng)性率分別為69.51%和5.00%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 研究組不同臨床病理特征PTC患者術(shù)前穿刺活檢組織BRAFV600E基因突變情況比較

研究組中, BRAFV600E基因突變陽(yáng)性患者PTMC比率、出現(xiàn)N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率、TNMⅡ～Ⅳ期比率高于BRAFV600E基因突變陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 研究組不同臨床病理特征PTC患者術(shù)前穿刺活檢組織BRAFV600E基因突變比較[n(%)]

2.3 術(shù)前穿刺活檢組織BRAFV600E基因突變檢測(cè)在PTC診斷中的價(jià)值

術(shù)前穿刺活檢組織BRAFV600E基因突變檢測(cè)在PTC與良性結(jié)節(jié)的鑒別診斷、PTMC診斷及PTC臨床分期診斷中的AUC分別為0.823、0.797、0.759, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 而在N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷中的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 術(shù)前穿刺活檢組織BRAFV600E基因突變檢測(cè)在PTC診斷中的價(jià)值

3 討 論

近年來(lái)，學(xué)術(shù)界對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)FNA樣本BRAFV600E基因突變檢測(cè)進(jìn)行了多項(xiàng)研究，但結(jié)果差異性較大。研究[8-9]結(jié)果顯示, BRAFV600E基團(tuán)突變檢測(cè)可提高甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別診斷準(zhǔn)確率，并與甲狀腺被膜外侵犯相關(guān)，有助于高危病例的術(shù)前篩選，但與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理特征無(wú)關(guān)。針對(duì)合并慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎PTC患者的研究[10]結(jié)果顯示，不同BRAFV600E基因突變狀態(tài)患者的腫瘤大小、癌灶形態(tài)、癌灶數(shù)量存在差異，但癌灶數(shù)量及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E基因突變無(wú)顯著相關(guān)性，提示BRAFV600E基因突變狀態(tài)對(duì)PTC臨床病理特征的影響并不明確。還有研究[11-12]結(jié)果顯示, BRAFV600E基因突變可提示PTC腫瘤組織分化差和高侵襲性病理亞型的出現(xiàn)，也可反映患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的升高，PTC的超聲圖像特征中的病灶數(shù)目、接觸被膜、微鈣化、血流情況均與BRAFV600E基因突變存在相關(guān)性。

針對(duì)PTMC患者的研究[13]顯示，BRAFV600E基因突變與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，能夠反映腫瘤的侵襲性生物學(xué)行為，可為手術(shù)方式選擇和預(yù)后判斷提供參考。本研究結(jié)果支持BRAFV600E基因突變檢測(cè)與PTC的病情和病理類型相關(guān)的結(jié)論，提示BRAFV600E基因突變作為一種促癌機(jī)制，可能反映了PTC的發(fā)生和進(jìn)展程度。BRAFV600E是BRAF基因第15外顯子1 799位點(diǎn)T-A轉(zhuǎn)換，即密碼子600位的纈氨酸被谷氨酸替代。作為PTC最常見(jiàn)的基因變異，BRAFV600E基因突變已被證實(shí)與PTC的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和不良預(yù)后有關(guān)[14-15]，并與腫瘤組織中促甲狀腺激素受體表達(dá)下調(diào)等機(jī)制密切相關(guān)[16]。因此，臨床醫(yī)生可考慮將術(shù)前穿刺活檢組織的BRAFV600E基因檢測(cè)作為診斷的輔助依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，采用超聲引導(dǎo)下穿刺活檢法檢測(cè)病灶組織中的BRAFV600E基因突變情況，發(fā)現(xiàn)PTC患者具有較高的BRAFV600E基因突變陽(yáng)性率，且與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和病理類型有關(guān)，這種檢測(cè)方法在PTC的鑒別診斷、臨床分期評(píng)價(jià)、病理診斷方面均具有價(jià)值，提示了這種檢測(cè)方法能夠用于輔助PTC的診斷和病情評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果提示不同BRAFV600E基因突變情況的PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度具有差異，但ROC曲線分析未支持BRAFV600E基因檢測(cè)對(duì)于N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有輔助診斷價(jià)值的結(jié)論。近年來(lái)相關(guān)研究[17-18]結(jié)果顯示，PTC患者易出現(xiàn)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(CLNM)，BRAFV600E基因突變雖然與腫瘤的超聲影像學(xué)表現(xiàn)缺乏相關(guān)性，但一項(xiàng)針對(duì)35篇文獻(xiàn)的Meta分析[19]結(jié)果顯示，BRAFV600E基因突變與PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，可提高PTC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，這與本研究結(jié)果存在一定差異，其原因可能是本研究將N0～N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者作為對(duì)照，而將N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者作為病例，而非以N0作為對(duì)照。本研究PTC病例中, N0～N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例較多，而N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例較少，抽樣差異導(dǎo)致了診斷價(jià)值不明顯。CLNM對(duì)PTC預(yù)后的影響仍有待于進(jìn)一步明確[20]。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于N0患者可應(yīng)用預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，但在臨床實(shí)際情況中，此類患者的數(shù)量較少，不宜作為對(duì)照病例。因此，針對(duì)術(shù)前檢測(cè)BRAFV600E基因突變陽(yáng)性且腫瘤直徑較大的患者，應(yīng)重視對(duì)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)的清掃。

綜上所述，PTC組織具有較高的BRAFV600E基因突變陽(yáng)性率，術(shù)前通過(guò)穿刺活檢對(duì)病灶組織中BRAFV600E基因突變進(jìn)行檢測(cè)，在PTC的鑒別診斷、臨床分期診斷、病理診斷等方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，可用于PTC的輔助診斷和病情評(píng)價(jià)。