周正，尉露露，杜秋瑤，李昌澤，董素淼，劉懷超，王濤，隋宏書

(1.山東第一醫(yī)科大學臨床醫(yī)學專業(yè)，山東 泰安；2.山東第一醫(yī)科大學生物化學教研室，山東 泰安；3.山東第一醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室，山東 泰安)

0 引言

下肢缺血再灌注損傷(limb ischemiareperfusion，LIR)常見于急性動脈栓塞、腹主動脈瘤等手術治療中長時間使用夾血帶止血后再恢復血流的情況，是外科面臨的常見難題，目前臨床對LIR 尚無有效預防手段，有效的防護措施十分重要。有研究表明，n-3 多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs)具有抗炎、抗損傷的功能，對大鼠LIR 有一定的改善作用[1]。因此，本項目擬以n-3 PUFAs 為切入點，通過建立大鼠LIR 模型，研究n-3 PUFAs 對LIR 的干預作用，通過分子生物學、行為學等多種技術方法深入探討n-3 PUFAs對LIR 預防作用，為臨床診治LIR 提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，白介素8(Interleukin-8，IL-8)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Epoch 型號酶標檢測儀購自BioTeK 公司，Chemeray240型號全自動生化分析儀購自深圳雷杜生命科技公司Neofuge15R 型臺式高速冷凍離心機購自Heal Force 公司。

1.2 動物

48 只健康成年SD 大鼠，由山東第一醫(yī)科大學實驗動物中心提供，雌雄不限，體質量(190±5)g；于室溫20°C，濕度55%的動物實驗室內飼養(yǎng)14d，光照比白天：夜晚=12h：12h，飼養(yǎng)條件為每日更換水和墊料，滿足大鼠的正常飲食需求。

表1 三組大鼠肢體對稱功能評分

表2 n-3PUFAs 對LIR 大鼠氧化應激的影響

1.3 方法

1.3.1 大鼠LIR 模型的建立

SD 大鼠隨機分為假手術組(Sham 組)16 只、下肢缺血再灌注組(LIR 組)16 只、n-3 多不飽和脂肪酸組(n-3 PUFAs組)16 只。n-3 PUFAs 組 給 予n-3 PUFAs(1g/kg/day) 灌 胃，連續(xù)14d。Sham 組、LIR 組每日灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)14d。各組采用Bulldog 無創(chuàng)血管阻斷方法游離股動脈。假手術組不做夾閉股動脈處理。LIR 組、n-3 PUFAs 組鉗夾股動脈將其游離出約10mm，在股動脈遠端測血壓，當測得血壓為0 時說明缺血模型成功，缺血4 小時后去除動脈夾，恢復下肢血流，此時測得血壓升高標志再灌注成功。假手術組、LIR 組、n-3 PUFAs 組完成操作后縫合傷口。

1.3.2 大鼠肢體對稱性功能評分

將3 組大鼠置于大型透明圓筒狀容器之中，正常大鼠表現(xiàn)為不時站立，并使用前肢觸碰容器內壁，而下肢異常則會使大鼠站立頻率降低。實驗人員通過觀察雙側后肢站立情況，并對比正常后肢的使用頻率，可計算肢體使用率來衡量得分，每次評分間隔兩天，每只大鼠重復10 次。肢體不對稱評分=(正常后肢應用數(shù)-術后后肢應用數(shù))/(正常后肢應用數(shù)+術后后肢應用數(shù)+雙側后肢同時應用數(shù))×100%。

1.3.3 樣本采集與檢測

于14 天后處死大鼠，內眥靜脈取血，離心后用于測定血清中MDA、IL-8、SOD 水平的測定。取患側腓腸肌，使用10%中性甲醇固定，石蠟包埋，切片厚度5um，HE 染色，觀察組織學結構及病理變化。

1.3.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據的處理均由SPSS 17.0 軟件分析，計量資料以(mean±sE)表示。兩組數(shù)據比較采用獨立樣本t檢驗；3組或以上的多樣本間的數(shù)據比較采用單因素ANOVA，多重比較使用LSD 方法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠肢體對稱功能評分

結果見表1。根據大鼠肢體不對稱評分公式，得分越高表示大鼠肢體對稱性越差。結合數(shù)據，在Day1 即建模完成時LIR 組和n-3PUFAs 組大鼠肢體對稱性功能與Sham 組產生較大差異，且P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義，表明建模效果良好。隨著缺血再灌注時間的推移，大鼠肢體對稱性功能逐漸恢復；Day4、10、13 可見在再灌注早期LIR 組(對照組)相比較n-3PUFAs 組(實驗組)預后較差，有顯著性差異。

2.2 大鼠腓腸肌組織比較

結果見圖1。HE 染色顯示Sham 組腓腸肌形態(tài)正常；LIR組可見肌纖維明顯受損，出現(xiàn)肌絲不整齊排列，且細胞核數(shù)量明顯減少，細胞出現(xiàn)壞死或凋亡；n-3 PUFAs 組可見肌纖維較LIR 組形態(tài)受損減輕；細胞核數(shù)量有所增多，壞死或凋亡情況減輕。

圖1 三組大鼠腓腸肌樣本的HE 染色(×25)

2.3 血清氧化應激指標比較

見表2。與Sham 組相比，LIR 組和n-3PUFAs 組大鼠血清中MDA 與IL-8 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(n=16，P＜0.05)。與LIR 組相比較，n-3PUFAs組大鼠血清中MDA 與IL-8 水平顯著降低，SOD 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(n=16，P＜0.05)。

3 討論

下肢缺血再灌注損傷是外科手術中常見的病理過程，多見于游離組織轉移，創(chuàng)傷截肢，外科手術耗時較長且手術阻斷血流大于4h 再恢復血供后發(fā)生[2]。目前下肢缺血再灌注損傷的發(fā)生機制尚未完全闡明，但大部分研究發(fā)現(xiàn)血流再灌注過程中誘發(fā)的白介素等細胞因子大量釋放，快速形成級聯(lián)放大反應，導致局部組織能量代謝紊亂，細胞壞死和凋亡，不利于患者的術后康復，甚至造成更嚴重損害，這也是外科開展過程中有待解決的焦點問題[3]。

n-3 多不飽和脂肪酸的主要成分是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)[4]。有大量研究表明EPA 和DHA 對花生四烯酸(AA)的代謝產生了顯著的抑制作用，從而減少了AA 衍生的促炎因子二十烷類物質的釋放[5]。本實驗通過調整大鼠n-3PUFAs 的攝入量，使得n-6/n-3PUFAs 比值降低，減少了LIR 的氧化應激損傷，進一步說明n-3PUFAs具有對下肢缺血再灌注損傷保護作用。同時，也提示臨床適量增加n-3PUFAs 的攝入或可成為一個安全有效的LIR 輔助治療手段。

近年來，Berger MM[6]等研究表明n-3 PUFAs 可顯著改善缺血再灌注后致炎因子白介素的升高[7]、抑制巨噬細胞內NF-κB 信號激活與其下游信號表達及抑制前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2) 誘發(fā)的細胞炎性反應過程[8][9]。MDA 是氧化損傷的最終產物，也是脂質過氧化的標志，可直接反應氧化損傷程度。為了探討n-3PUFAs 對于下肢缺血再灌注引起的氧化應激的作用，我們檢測了大鼠血清中的MDA、SOD 與IL-8 水平。在本實驗LIR 組血清中SOD 活性顯著下降，MDA 與IL-8 含量增加，這可能由大量氧自由基造成的酶活性抑制導致；n-3PUFAs 組SOD 活性較LIR 組明顯升高，MDA 與IL-8 含量降低。提示n-3PUFAs 增強抗氧化能力可能是保護組織的一個重要原因。其具體的機制尚有待進一步明確。