陳 澤，張繼彬，呂 娜，李永輝，周 薇，關(guān) 偉，高曉寧

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心，北京 100853 1血液科；2心血管內(nèi)科

伴t(8；21)染色體易位的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)雖然是AML中預(yù)后較好的一個亞型[1]，但合并C-kit基因突變時(shí)則因復(fù)發(fā)率高而預(yù)后不佳[2]。C-kit是一種原癌基因，在約80%的AML患者中有表達(dá)，其突變頻率為13% ～22%，在t(8；21) AML中其突變頻率高達(dá)40%[3]。C-kit編碼基因位于染色體4q11-12，其蛋白產(chǎn)物屬3型酪氨酸激酶家族。C-kit蛋白通過與其配體，即干細(xì)胞因子結(jié)合，形成同源二聚體化從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化[4]，促進(jìn)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞信號改變，從而達(dá)到對某些造血細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列調(diào)控[5]。C-kit基因突變可引起其下游信號通路異?；罨M(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖及凋亡紊亂，從而引發(fā)白血病。目前臨床上對于攜帶C-kit基因突變的AML尚無有效治療藥物。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1α)，這一介導(dǎo)細(xì)胞缺氧應(yīng)答反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在t(8；21) AML患者中選擇性高表達(dá)，HIF1α特異性抑制劑棘霉素(echinomycin)能抑制t(8；21) AML細(xì)胞的增殖[6]。本研究擬在前期基礎(chǔ)上，探索抑制HIF1α對攜帶C-kit基因突變的AML細(xì)胞中C-kit基因表達(dá)的影響及對細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用。

材料與方法

1 試劑 棘霉素 (MERCK：330175)，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(康寧：10-040-CVR)，胎牛血清(Hyclone：SV30087.03)，100× 青 霉 素 -鏈 霉 素溶液(白鯊：BL505A)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega：A3500)，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(KAPA：KK4601)，人甲基纖維素培養(yǎng)基(R&D Systems：4434)，兔抗人 C-kit抗體(CST：3074S)，兔抗人HIF1α抗體(CST：14179S)，兔抗人β-actin抗體 (CST：4970)，TRIzolTMReagent(Invitrogen：15596018)，BCA 蛋白定量試劑盒(碧云天：P0012S)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Merck Millipore：WBKLS0100)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(CST：7074)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(索萊寶：CA1020)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 攜帶C-kit基因突變的t(8；21) AML細(xì)胞系Kasumi-1和SKNO-1采用RPMI1640培養(yǎng)基(90% RPMI1640、10%胎牛血清、1%雙抗)于37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 ～ 3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)前1 d采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml接種于6孔板，每孔2 ml，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天采用終濃度為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、30 nmol/L的棘霉素以及DMSO分別處理Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞，放置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至24 h收集待測細(xì)胞。

3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測 mRNA表達(dá)收集細(xì)胞，Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá)，引物由博邁德(北京)合成，C-kit前引物序列：5'-CGTTCTGCTCCTACTGCTTCG-3'，后引物序列：5'-CCCACGCGGACTATTAAGTCT-3'；HIF1α 前 引物序列 ：5'-GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG-3'，后引物序列：5'-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3'。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性20 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行40次循環(huán)，最終72℃延伸15 min。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄不同基因的Ct值。目的基因相對表達(dá)量應(yīng)用2-ΔΔCt公式來計(jì)算，ΔΔCt=(Ct加藥組目的基因-Ct加藥組內(nèi)參基因) - (Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因，比較mRNA的相對表達(dá)含量。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

4 Western blot 收集待測細(xì)胞，PBS洗滌后用100μl RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法定量后采用SDS-PAGE凝膠電泳，通過濕轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)到PVDF膜上(300 mA，110 min)，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入C-kit(1∶1 000)、HIF1α抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次15 min。再加入HRP標(biāo)記兔二抗(1∶10 000)，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，然后采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行發(fā)光，經(jīng)軟件成像系統(tǒng)掃描目的條帶后分析。以GAPDH作為內(nèi)參照。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集待測細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌后加入500 μl PBS重懸，每組樣本留取4管分別加入Annexin V 3μl、PI 3μl、Annexin V和PI各3μl、PBS(空白對照)，混勻后室溫避光放置15 min，轉(zhuǎn)移至流式管，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集待測細(xì)胞，在15 ml離心管中加入3 ml人甲基纖維素復(fù)合培養(yǎng)液待用，計(jì)數(shù)1 500個細(xì)胞加入300μl細(xì)胞培養(yǎng)液后，再加入甲基纖維素培養(yǎng)基中，渦旋振蕩器充分混勻并靜置5 min，將細(xì)胞放入兩個3 cm培養(yǎng)皿中，3 d后開始密切觀察克隆數(shù)以及克隆大小，每日拍照記錄，計(jì)算7～14 d后的克隆數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較用Student-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 棘霉素對C-kit突變陽性的t(8；21) AML細(xì)胞系中HIF1α和C-kit的mRNA表達(dá)的影響 采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測棘霉素處理后的Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞內(nèi)HIF1α mRNA、C-kit mRNA表達(dá)變化。如圖1所示，與經(jīng)DMSO處理的對照組相比，HIF1α mRNA、C-kit mRNA表達(dá)均明顯降低，且隨棘霉素濃度增加，這一抑制作用逐漸增強(qiáng)。

2 棘霉素對C-kit突變陽性的t(8；21) AML細(xì)胞系中HIF1α和C-kit蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot檢測棘霉素處理后的Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞內(nèi)HIF1α蛋白、C-kit蛋白表達(dá)變化。如圖2所示，與DMSO對照組相比，HIF1α蛋白、C-kit蛋白表達(dá)明顯降低，且隨棘霉素濃度增加，這一抑制作用逐漸增強(qiáng)。

3 棘霉素對C-kit突變陽性的t(8；21) AML細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響 用不同濃度棘霉素處理Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞24 h，顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上發(fā)生了明顯變化。用DMSO對照處理的Kasumi-1，SKNO-1細(xì)胞，形狀規(guī)則，大小一致，隨著棘霉素濃度的增加細(xì)胞開始變大，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞數(shù)變少，形狀不規(guī)則，且隨著藥物濃度增大細(xì)胞變化越來越明顯。如圖3所示，通過PI與Annexin V雙染后流式細(xì)胞儀檢測Kasumi-1、SKNO-1細(xì)胞凋亡情況可見，棘霉素處理24 h的細(xì)胞，與用DMSO對照處理的細(xì)胞相比，早期凋亡(PI與Annexin V雙陽性)和晚期凋亡(PI陽性)細(xì)胞比例明顯增加；而且隨著棘霉素濃度增加凋亡細(xì)胞所占比例增高。

4 棘霉素對C-Kit突變陽性的t(8；21) AML細(xì)胞系增殖能力的影響 棘霉素處理后的Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞接種到克隆形成培養(yǎng)基中，7 ～ 14 d觀察細(xì)胞增殖情況。如圖4所示，隨藥物濃度增加，細(xì)胞克隆數(shù)明顯下降，提示細(xì)胞增殖能力受抑制。

討 論

原癌基因C-kit通過與其配體干細(xì)胞因子結(jié)合，調(diào)控造血干細(xì)胞早期增殖和分化[6]。C-kit基因突變后C-kit蛋白的活化不需要干細(xì)胞因子參與，即可持續(xù)刺激細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)白血病發(fā)生[6-9]。AML細(xì)胞系Kasumi-1和SKNO-1是攜帶t(8；21)染色體易位和C-kit基因突變的常見AML細(xì)胞系。研究表明，在Kasumi-1細(xì)胞系中存在C-kit基因Ash822Lys的激活突變[10]，Asn822在RTK家族的激活使Kasumi-1細(xì)胞系成為C-kit突變的AML的理想模型[11]，而SKNO-1是t(8；21)AML的第二個C-kit突變模型，兩者的區(qū)別是Kasumi-1細(xì)胞為N822K突變雜合子，而SKNO-1為純合子，所以本研究選擇以上兩種細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[11]。

HIF1α是缺氧條件激活的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)著數(shù)百種影響細(xì)胞增殖凋亡的關(guān)鍵基因，其一旦被激活常提示腫瘤患者預(yù)后較差[11]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HIF1α在t(8；21) AML患者中選擇性高表達(dá)，抑制HIF1α可抑制t(8；21) AML細(xì)胞的增殖[6]。本試驗(yàn)中我們選擇了HIF1α靶向抑制劑棘霉素處理Kasumi-1和SKNO-1兩種細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)棘霉素處理細(xì)胞后，隨著HIF1α表達(dá)水平的下降，C-kit基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，且隨加藥濃度增加，該抑制作用越來越明顯，提示棘霉素可能通過抑制HIF1α表達(dá)進(jìn)而抑制C-kit。當(dāng)然，由于HIF1α與C-kit之間關(guān)系尚無報(bào)道，我們有必要進(jìn)一步研究兩者之間是否存在直接調(diào)控亦或是間接調(diào)控。

我們發(fā)現(xiàn)，伴隨C-kit表達(dá)的降低，Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞系在經(jīng)30 nmol/L的棘霉素處理后，相對于DMSO組早期凋亡和晚期凋亡都增加，且隨藥物濃度增加，凋亡情況加劇。C-kit基因突變是伴t(8；21)AML中的常見突變，發(fā)生率為12.7% ～ 47.2%[12-14]，并且C-kit的功能獲得性突變導(dǎo)致其下游AKT、STAT3和MAPK[14]信號通路的激活，C-kit/PI3K/AKT通路增加了對細(xì)胞凋亡和Survivin表達(dá)的抑制使Survivin表達(dá)增加，降低促凋亡Bak蛋白的表達(dá)[15]。值得注意的是，Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的成員[16]，這種蛋白與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合，阻斷它們的作用，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。

我們還發(fā)現(xiàn)，伴隨C-kit表達(dá)的降低，Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞系的體外細(xì)胞克隆形成數(shù)均明顯減少，且隨藥物濃度增加，細(xì)胞增殖抑制情況越明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道[15]，C-kit下游的MAPK家族主要包括p38、JNK1/2和ERK1/2三類酶，JNK信號已被證實(shí)和凋亡密切相關(guān)，磷酸化激活的JNK可促進(jìn)c-jun的基因轉(zhuǎn)錄從而參與細(xì)胞的增殖，p38通過促進(jìn)Caspase-3和PARP的活性來實(shí)現(xiàn)對凋亡的調(diào)節(jié)，這些信號分子通過磷酸化水平調(diào)節(jié)活性影響細(xì)胞的增殖及凋亡[17]。

圖1 棘霉素對Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞系HIF1α和C-kit mRNA表達(dá)的影響(aP＜0.01, vs DMSO)Fig. 1 Effects of echinomycin on mRNA expression levels of HIF1α and C-kit genes in Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.01, vs DMSO)

圖2 棘霉素對Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞系HIF1α和C-kit蛋白表達(dá)的影響(aP＜0.05, vs DMSO)Fig.2 Effects of echinomycin on protein expression levels of HIF1α and C-kit genes in Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.05, vs DMSO)

圖3 棘霉素對Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響(aP＜0.01, vs DMSO)Fig.3 Effects of echinomycin on apoptosis of Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.01, vs DMSO)

圖4 棘霉素對Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞系增殖能力的影響(aP＜0.05, vs DMSO)Fig.4 Effects of echinomycin on cellular proliferation of Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.05, vs DMSO)

綜上，我們推測棘霉素可能通過抑制HIF1α表達(dá)從而影響C-kit，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。目前臨床對于C-kit突變合并t(8；21) AML尚無有效靶向治療藥物，本研究為進(jìn)一步將棘霉素應(yīng)用于這類AML的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。