馬 瑩，盧彥平，高志英，謝瀟瀟，游艷琴，周紅輝，馮秀麗，王秀娟，張亞青，姜淑芳解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 婦產(chǎn)科，北京 0085；北京市豐臺(tái)區(qū)婦幼保健院，北京 00069；北京航天總醫(yī)院，北京 00076；北京市門(mén)頭溝區(qū)婦幼保健院，北京 000

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal test，NIPT)狹義上是指通過(guò)高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血內(nèi)游離DNA測(cè)序，檢測(cè)胎兒染色體非整倍[21-三體綜合征(21 trisomy syndrome，T21)、18-三體綜合征(18 trisomy syndrome，T18)、13-三體綜合征(13 trisomy syndrome，T13)及性染色體數(shù)目異常等]異常。自NIPT應(yīng)用于臨床后，胎兒染色體非整倍體篩查模式發(fā)生了改變。從傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)者，高齡者(≥35歲)行產(chǎn)前診斷[1]，到可以選擇NIPT作為高齡孕產(chǎn)婦一線篩查也可作為傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)及臨界風(fēng)險(xiǎn)值樣本的二次篩查。2015年美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)和母胎醫(yī)學(xué) 會(huì) (Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM)推薦所有孕婦都可以選擇NIPT篩查[2-3]。本文回顧性分析解放軍總醫(yī)院產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，按照年齡及篩查適應(yīng)證等條件分組，分別對(duì)比陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、敏感度、特異性等指標(biāo)，評(píng)估NIPT在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

資料和方法

1 資料 收集2016年1月- 2018年6月于解放軍總醫(yī)院進(jìn)行NIPT篩查的孕婦相關(guān)數(shù)據(jù)，共計(jì)8 410例，其中有電話(huà)隨訪結(jié)局或產(chǎn)前診斷結(jié)局的病例7 707例入組，652例失訪及51例NIPT退費(fèi)無(wú)報(bào)告數(shù)據(jù)未入組。7 707例數(shù)據(jù)按年齡≥35歲和＜35歲分為兩組，≥35歲組2 978例，＜35歲組4 729例。7 707例數(shù)據(jù)按照篩查適應(yīng)證進(jìn)行分類(lèi)：1)自愿選擇NIPT篩查者4 586例；2)傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)值者2 071例；3)超聲軟指標(biāo)異常者106例；4)其他(IVF，雙胎，不良孕產(chǎn)史)944例。

2 產(chǎn)前篩查方法 1)傳統(tǒng)血清學(xué)篩查：將病人血清分離，采用PerkinElmer公司試劑盒及AUTODELFIA 1235免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)后數(shù)據(jù)用Lift cycle4.0軟件進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)值評(píng)估。結(jié)果判讀：T21 cut-off值為1∶270，風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶270為高風(fēng)險(xiǎn)，臨界風(fēng)險(xiǎn)值為1∶1 000≤風(fēng)險(xiǎn)值＜1∶270。T18 cut-off值為1∶350，風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶350為高風(fēng)險(xiǎn)，臨界風(fēng)險(xiǎn)值為1∶1 000≤風(fēng)險(xiǎn)值＜1∶350。神經(jīng)管畸形高風(fēng)險(xiǎn)為AFP MOM值≥2.5。2)NIPT檢測(cè)：采集孕婦外周血5 ml用EDTA抗凝管保存，樣本兩次低溫離心后，在冰盒上將所得血漿轉(zhuǎn)入新的2.0 ml離心管內(nèi)，經(jīng)過(guò)DNA提取、測(cè)序文庫(kù)制備、測(cè)序反應(yīng)、富集、上機(jī)等流程后，數(shù)據(jù)分析得到Z值。結(jié)果判讀：初次檢測(cè)結(jié)果Z值≥4判斷為高風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。Z值≤1.96為低風(fēng)險(xiǎn)，4＞Z＞1.96為臨界風(fēng)險(xiǎn)值需進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果Z值≥3為高風(fēng)險(xiǎn)，Z值＜3為低風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)入常規(guī)孕檢流程。檢測(cè)后血漿-80℃儲(chǔ)存2年。

3 產(chǎn)前診斷方法 1)羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析：將20 ml羊水離心，棄上清，加入羊水培養(yǎng)基混勻后接種，經(jīng)培養(yǎng)、換液、收獲、低滲、固定、老化、胰酶消化處理、吉姆薩染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆及染色體形態(tài)，進(jìn)行核型分析。結(jié)果判讀：計(jì)數(shù)10 ～ 15個(gè)克隆的染色體數(shù)目，分析3個(gè)染色體核型，并保存圖像。2)熒光染色體原位雜交檢測(cè)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)：將約10 ml羊水樣本進(jìn)行離心、低滲、反復(fù)固定后根據(jù)細(xì)胞量加入適量固定液，混勻后滴片經(jīng)過(guò)烤片、探針雜交、細(xì)胞膜片洗滌復(fù)染等處理，熒光顯微鏡下閱片計(jì)數(shù)。結(jié)果判讀：熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)代表相應(yīng)染色體數(shù)目，以≥90%的細(xì)胞顯示正常熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)作為未見(jiàn)異常的判斷標(biāo)準(zhǔn)，≥60%異常熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)作為異常的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

4 分析指標(biāo) 以陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(positive predictive value，PPV)、陰性預(yù)測(cè)值 (negative predictive value，NPV)、敏感度(sensitivity)、特異性(specificity)、假陽(yáng)性率(false positive rate，F(xiàn)PR)、假陰性率(false negative rate，F(xiàn)NR)等指標(biāo)評(píng)估各組NIPT數(shù)據(jù)。

5 統(tǒng)計(jì)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究資料主要為計(jì)數(shù)資料，組間比較用χ2或Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)篩查在不同年齡組間比較 有隨訪結(jié)局或產(chǎn)前診斷結(jié)局總例數(shù)為7 707例，總高風(fēng)險(xiǎn)76例，見(jiàn)表1。＜35歲組：4 729例，總高風(fēng)險(xiǎn)48例，高風(fēng)險(xiǎn)率為1.02%(48/4 729)。產(chǎn)前診斷確診陽(yáng)性28例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值60.87%，陰性預(yù)測(cè)值99.96%，敏感度93.33%，特異性99.62%，假陽(yáng)性率0.383%，假陰性率6.67%?！?5歲組：2 978例，總高風(fēng)險(xiǎn)28例，高風(fēng)險(xiǎn)率為0.94%(28/2 978)，產(chǎn)前診斷確診陽(yáng)性21例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75%，陰性預(yù)測(cè)值100%，敏感度100%，特異性99.76%，假陽(yáng)性率0.237%，假陰性率0。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值，敏感度、特異性在年齡組間大致相近。見(jiàn)表2。

表2 兩年齡組NIPT結(jié)果比較Tab. 2 Comparison of NIPT results between the two groups

2 NIPT篩查不同適應(yīng)證組各指標(biāo)比較 不同NIPT篩查適應(yīng)證組間各指標(biāo)比較，超聲軟指標(biāo)組各項(xiàng)數(shù)據(jù)最佳，而自愿選擇組及其他原因選擇NIPT篩查組各出現(xiàn)1例NIPT假陰性結(jié)果。見(jiàn)表3。

3 NIPT作為傳統(tǒng)血清學(xué)篩查的二次篩查結(jié)果2 071例傳統(tǒng)血清學(xué)篩查數(shù)據(jù)中高風(fēng)險(xiǎn)591例，臨界風(fēng)險(xiǎn)值樣本1 480例，選NIPT二次篩查后15例(傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)樣本5例，臨界風(fēng)險(xiǎn)值樣本10例)高風(fēng)險(xiǎn)樣本進(jìn)行產(chǎn)前診斷。其中10例為真陽(yáng)性(傳統(tǒng)血清學(xué)高風(fēng)險(xiǎn)樣本5例，臨界值樣本5例)，5例為假陽(yáng)性。見(jiàn)表4。

討 論

T21的發(fā)病率為1/800 ～ 1/600，是導(dǎo)致新生兒出生缺陷和死亡的主要疾病[4-6]。因其患兒出生后智力低下且多數(shù)生存期較長(zhǎng)給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，因此T21篩查成為產(chǎn)前篩查的重點(diǎn)對(duì)象[7]。本研究中7 707例NIPT篩查樣本中T21高風(fēng)險(xiǎn)26例病例，其中25例為真陽(yáng)性，1例假陽(yáng)性，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、敏感度、特異性高達(dá)96.15%、100%、100%、99.99%，假陽(yáng)性率僅0.013%，假陰性率為0，提示NIPT是目前T21篩查方法中敏感度、特異性最高及假陽(yáng)性率、假陰性率最低的篩查方法[8]。

表1 7 707例孕婦NIPT診斷結(jié)果及診斷性能評(píng)價(jià)Tab. 1 NIPT results in 7 707 pregnant women and its diagnosis performance

表3 不同篩查適應(yīng)證檢測(cè)效能比較Tab. 3 Comparison of diagnositic performance of NIPT by different screen indication

我國(guó)《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》提出了實(shí)驗(yàn)室二代測(cè)序技術(shù)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：T21、T18、T13的敏感度應(yīng)分別達(dá)到95%、85%、70%。3種目標(biāo)疾病的復(fù)合陽(yáng)性預(yù)測(cè)值應(yīng)不低于50%，復(fù)合假陽(yáng)性率不超過(guò)0.5%[9]。本研究中，T21及T13的敏感度都為100%。而3種目標(biāo)檢測(cè)疾病的復(fù)合陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為80%，復(fù)合假陽(yáng)性率為0.104%，達(dá)到規(guī)范要求。且除了T18敏感度外，對(duì)T21、T13篩查均有較高敏感度，與其他文獻(xiàn)相符[3,8]。本研究中T18敏感度為83.33%，是因有1例T18假陰性病例，對(duì)其后續(xù)檢測(cè)(羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析，F(xiàn)ISH，引產(chǎn)后胎盤(pán)、胎兒皮膚組織行高通量基因測(cè)序檢測(cè))證實(shí)此病例為胎盤(pán)嵌合導(dǎo)致T18假陰性。見(jiàn)表1。

PPV反映篩查檢測(cè)結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)者患目標(biāo)疾病的可能性。NIPT篩查檢測(cè)的PPV與非整倍體發(fā)生的流行病學(xué)相關(guān)，且隨年齡增長(zhǎng)而增加[7]。本研究中NIPT篩查結(jié)果≥35歲年齡組的PPV和敏感度分別為75%、100%，＜35歲年齡組為60.87%、93.33%，兩年齡組大致相近，見(jiàn)表2。然而有文獻(xiàn)報(bào)道40歲年齡組NIPT篩查唐氏綜合征的PPV為87%，而在25歲年齡組為33%[2]，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大分析樣本量繼續(xù)觀察。

NPV表示檢測(cè)結(jié)果低風(fēng)險(xiǎn)患者中真正未患病的比例。NPV隨流行病學(xué)改變，但超過(guò)99%的NPV與年齡無(wú)關(guān)[6,10]。因2例假陰性結(jié)果(1例T18，1例胎停流產(chǎn)組織驗(yàn)證為XXX異常)導(dǎo)致本研究分析結(jié)果中＜35歲年齡組NPV低于≥35歲年齡組，見(jiàn)表2。文獻(xiàn)報(bào)道NIPT存在技術(shù)局限性[11-13]，母體惡性腫瘤、雙胎之一消失或胎盤(pán)嵌合等原因可引起假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，胎盤(pán)嵌合導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果較為多見(jiàn)。這是技術(shù)方法的局限性，篩查咨詢(xún)時(shí)應(yīng)充分告知病人。

NIPT應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體檢測(cè)較傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)具有較大優(yōu)勢(shì)，適應(yīng)證范圍廣，雙胎、高齡、IVF等均可使用[14-16]，也可應(yīng)用于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查后的二次篩查[7]。本研究中傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)及風(fēng)險(xiǎn)值在臨界值的樣本共計(jì)2 071例，其中血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)591例，而臨界風(fēng)險(xiǎn)值樣本為1 480例，用NIPT二次篩查后，需進(jìn)行羊膜腔穿刺例數(shù)從591例降至15例(傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)5例，臨界風(fēng)險(xiǎn)值10例)，穿刺人數(shù)明顯減少，極大程度減輕臨床產(chǎn)前診斷科室的壓力和孕婦不必要的痛苦和緊張。15例羊膜腔穿刺中，確診真陽(yáng)性結(jié)果為10例(傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)樣本5例，臨界風(fēng)險(xiǎn)值樣本5例)見(jiàn)表4，所以可以認(rèn)為NIPT二次篩查即可以有效降低高風(fēng)險(xiǎn)人群羊膜腔穿刺數(shù)，又可以避免傳統(tǒng)血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)值人群假陰性結(jié)果出現(xiàn)。但Norton等[17]的研究表明，傳統(tǒng)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果經(jīng)產(chǎn)前診斷確診陽(yáng)性病例中約83.1%染色體異常NIPT能檢測(cè)出來(lái)，而約16.9%的染色體異常NIPT檢測(cè)不出來(lái)，主要為嵌合或稀有染色體異常等。是否可通過(guò)增加測(cè)序深度和改進(jìn)算法等技術(shù)解決此類(lèi)問(wèn)題有待于進(jìn)一步的研究觀察。

表4 二次NIPT篩查結(jié)果陽(yáng)性的15例病人的檢測(cè)結(jié)果比較Tab. 4 Agreement between NIPT and prenatal diagnosis in 15 cases with positive results of repeating NIPT screening

超聲軟指標(biāo)異常主要包括NT增厚、脈絡(luò)叢囊腫、心內(nèi)強(qiáng)回聲等。劉利娜等[18]指出NT增厚特異性較大，而脈絡(luò)叢囊腫、心內(nèi)強(qiáng)回聲等軟指標(biāo)單獨(dú)存在時(shí)無(wú)明顯特異性。孕早期時(shí)檢測(cè)NT值，可與早孕期傳統(tǒng)血清學(xué)篩查結(jié)合使用來(lái)提高非整倍體檢出率。NIPT用于臨床后，因其檢測(cè)項(xiàng)目不能覆蓋所有非整倍體異常，所以超聲輔助檢查仍然很重要。臨床上，將二者有機(jī)結(jié)合，也可進(jìn)一步提高產(chǎn)前篩查效率。本研究數(shù)據(jù)超聲軟指標(biāo)異常的106例樣本選擇NIPT篩查后檢出6例真陽(yáng)性，其PPV、NPV、敏感度、特異性均達(dá)到100%，假陽(yáng)性率和假陰性率為0(表3)，說(shuō)明超聲軟指標(biāo)異常者可以選擇NIPT檢測(cè)，有助于提高非整倍體異常篩查的敏感度，預(yù)防漏診，且產(chǎn)前篩查是需要多種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果綜合評(píng)估的。

2016年頒布的《國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳關(guān)于規(guī)范有序開(kāi)展孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查及診斷工作的通知》中對(duì)NIPT檢測(cè)失敗的要求為＜5%[19]。本研究總數(shù)8 410例NIPT篩查結(jié)果中初次篩查因臨界風(fēng)險(xiǎn)值、GC點(diǎn)偏離、無(wú)下機(jī)數(shù)據(jù)、胎兒濃度低等原因未發(fā)報(bào)告者406例，占總數(shù)的4.83%(406/8 410)，符合要求。但是，在臨床工作中，為了降低假陽(yáng)性率，避免假陰性，對(duì)失敗樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)或重采樣檢測(cè)，成功發(fā)報(bào)告者355例；因多次檢測(cè)無(wú)法發(fā)報(bào)告，或者孕婦孕周大沒(méi)有進(jìn)行二次檢測(cè)直接退費(fèi)者51例，實(shí)際最終檢測(cè)失敗率為0.61%(51/8 410)，有隨訪結(jié)局41例均未見(jiàn)異常。雖然臨床實(shí)驗(yàn)室中對(duì)于二次重復(fù)檢測(cè)存在一定爭(zhēng)議，但從本研究數(shù)據(jù)來(lái)看，重復(fù)檢測(cè)是有必要的。

綜上所述，NIPT是現(xiàn)有胎兒染色體非整倍體篩查技術(shù)的最佳選擇，但要求各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到國(guó)家規(guī)定質(zhì)控要求，需要臨床醫(yī)生嚴(yán)格把控篩查適應(yīng)證及禁忌證。盡管醫(yī)務(wù)人員在各環(huán)節(jié)都有嚴(yán)格的質(zhì)量控制，但NIPT結(jié)果仍然存在假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果，這是其技術(shù)的局限性，應(yīng)充分告知患者，以避免醫(yī)患矛盾。