繆娜波，黎綺銘，李淑華，聶釗銘，張芬芬，彭挺生

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州 510080）

彌漫大B 細(xì)胞性淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是最常見的成熟B 細(xì)胞性腫瘤，其臨床病理特征、免疫表型具有明顯的異質(zhì)性［1-3］；我國(guó)DLBCL 發(fā)病率約占所有淋巴瘤的35.8%［4］。根據(jù)免疫學(xué)表型DLBCL 分為GCB 型和Non-GCB型［5］，兩種分型對(duì)靶向藥物的化療反應(yīng)及患者的生存期顯著不同［6］。R-CHOP 方案化療可使DLBCL得到緩解，但仍有30%～40%患者對(duì)化療不敏感致其生存率下降［7］；因此，尋找新的提示腫瘤治療反應(yīng)或預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物有重要的臨床意義。受體酪氨酸激酶（Anexelekto，AXL）最早發(fā)現(xiàn)于慢性粒細(xì)胞白血病，AXL 與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為生存率的預(yù)測(cè)因子［8-9］，本課題組也曾證實(shí)AXL在骨肉瘤中高表達(dá)且與預(yù)后不良呈正相關(guān)［10］，但是，目前國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于AXL 與淋巴瘤相關(guān)性的研究。MYC基因可影響細(xì)胞凋亡、增殖和生長(zhǎng)，MYC陽(yáng)性的DLBCL 預(yù)后差［11-14］，c-MYC 蛋白表達(dá)對(duì)DLBCL 患者的預(yù)后評(píng)估基本等同于MYC基因易位［15］。研究表明c-MYC 過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)AXL的表達(dá)［16］，提示AXL 與c-MYC 之間存在調(diào)控機(jī)制。B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）基因可抑制細(xì)胞凋亡，BCL-2 蛋白過(guò)表達(dá)是DLBCL 患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)［17-19］。c-MYC 和BCL2蛋白雙表型的DLBCL 侵襲性增強(qiáng)、預(yù)后更差［1，20-21］。本研究擬通過(guò)檢測(cè)DLBCL 組織中p-AXL、BCL-2、c-MYC 蛋白及MYC斷裂基因的表達(dá)水平，探索p-AXL 在DLBCL 中的表達(dá)情況及其臨床意義，并探討p-AXL/c-MYC、p-AXL/BCL-2、p-AXL/c-MYC/BCL-2 蛋白共表達(dá)的臨床意義，以及p-AXL 與MYC斷裂基因之間的臨床病理聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 選擇入組病例

本研究納入2012年至2017年在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為原發(fā)性DLBCL的病例394例，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)篩選出118 例DLBCL 進(jìn)行研究。入組標(biāo)準(zhǔn)：明確診斷為DLBCL；年齡＞18 歲；送檢組織直徑＞1 cm。剔除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他重大疾病，如惡性腫瘤、艾滋病、移植術(shù)后；由其它類型淋巴瘤轉(zhuǎn)化而來(lái)；既往有淋巴瘤病史者。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。

收集上述患者的一般信息、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查結(jié)果、病理形態(tài)及免疫組化和基因檢測(cè)等結(jié)果、臨床治療信息及放化療方案、療程和療效評(píng)價(jià)等。對(duì)所有病例進(jìn)行病歷記錄或電話隨訪，結(jié)局采用無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）表示。

1.2 組織芯片的免疫組化染色

1.2.1 組織芯片制作 收集118 例DLBCL 患者的HE 和免疫組化切片及蠟塊，由兩位高年資病理醫(yī)師閱片，在HE切片上選擇腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，并在蠟塊上相應(yīng)的位置標(biāo)記。設(shè)計(jì)好組織芯片陣列圖，使用1.0 mm 采樣針在蠟塊標(biāo)記處穿取組織，制作成組織芯片備用。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 將組織芯片切成4 μm薄片，56 ℃，4 h；二甲苯脫蠟3 次×10 min；100%、95%、80%梯度乙醇各10 min；蒸餾水清洗2 次×5 min、PBS 清洗5 min；檸檬酸鈉/EDTA 修復(fù)液高壓處理2.5 min 后，室溫冷卻1 h；PBS 清洗3 次；3%H2O2溶液浸泡10 min；PBS 清洗3 次后封閉1 h；一抗4 ℃孵育過(guò)夜，p-AXL 兔抗人多克隆抗體（美國(guó)R&D 公司）1∶40，c-MYC 濃縮抗體（廣州深達(dá)公司）1∶200，BCL-2 即用型抗體（DAKO，丹麥）；復(fù)溫后PBS 清洗5 次；即用型二抗（CST）室溫孵育40 min；PBS 清洗5 次后DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，沖洗，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。

復(fù)習(xí)所有免疫組化片，由兩名高年資病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲判讀，判讀不一致時(shí)討論后統(tǒng)一意見。CD10、BCL-2以腫瘤細(xì)胞膜著色為陽(yáng)性表達(dá)；BCL-6、Mum-1、c-MYC 以腫瘤細(xì)胞核著色為陽(yáng)性表達(dá)；高倍鏡（×400）隨機(jī)挑選10 個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例。陽(yáng)性細(xì)胞比例≥30%為陽(yáng)性（+）；其中c-MYC以陽(yáng)性細(xì)胞比例≥40%為陽(yáng)性（+）。p-AXL 以細(xì)胞膜或胞漿著色為陽(yáng)性表達(dá)，隨機(jī)選擇10 個(gè)高倍鏡視野判斷陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域及染色強(qiáng)度。＜25%記1分，25%～50%記2 分，51%～75%記3 分，＞75%記4分。染色強(qiáng)度判定：無(wú)染色記0 分，染色稍高于背景記1 分，染色明顯高于背景記2 分，強(qiáng)染色記3分。將兩次得分相乘，得分0～1 分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～6 分為陽(yáng)性（++），7～8 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 熒光原位雜交（FISH）

1.3.1 實(shí)驗(yàn)步驟 將組織芯片切成4 μm 薄片，56 ℃，2 h；脫蠟，梯度100%乙醇脫水；蒸餾水洗3次，用吸水紙吸取多余的水分；雙蒸水煮沸后放入切片煮10～15 min；蛋白酶消化，37 ℃，10～30 min；SSC 清洗2 次；甲醛固定10 min；70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各3 min。放入56 ℃烤箱5 min；滴加10 μL 探針混合物于切片上，蓋上蓋玻片，用封片膠封邊；放入雜交儀器，設(shè)置共變性條件：83 ℃，5 min，雜交條件：42 ℃，16 h；SSC 清洗2 次；70%乙醇3 min；置于暗房自然干燥切片；滴加15 μL 的DAPI 細(xì)胞核復(fù)染劑復(fù)染15 min；在暗房用油鏡（×1 000）觀察切片；閱片結(jié)束后將片子保存在-20 ℃。

1.3.2MYC斷裂基因結(jié)果判讀 參照文獻(xiàn)的判讀方法［22］，光鏡下找到腫瘤區(qū)域后轉(zhuǎn)為油鏡，打開雙通道觀察細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。未發(fā)生基因斷裂的細(xì)胞顯示有2 個(gè)融合的黃色信號(hào)，發(fā)生斷裂的細(xì)胞顯示為1 黃1 紅1 綠3 個(gè)信號(hào)，若細(xì)胞中只能觀察到1 個(gè)信號(hào)、1黃1綠或1黃1紅時(shí)不納入判讀范圍。隨機(jī)觀察至少100 個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞比例≥15%時(shí)記為陽(yáng)性（+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0 軟件，定性資料對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；應(yīng)用Kaplan Meier 法計(jì)算生存率及繪制生存曲線，采用Log Rank 檢驗(yàn)；單因素及多因素分析釆用Cox 回歸；定義P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 本組DLBCL患者的臨床特征

入組的118 例患者中，男性占55.1%（65/118），女性占44.9%（53/118）；中位年齡57.5歲，發(fā)病高峰期集中在50～60 歲之間。27.1%（32/118）的患者起病時(shí)伴隨有B 癥狀，Ann Arbor 分期、淋巴瘤國(guó)際預(yù)后指數(shù)（internationalprognosticindex，IPI）評(píng)分等臨床資料詳見表1。

2.2 本組DLBCL患者的隨訪信息

本組病例隨訪時(shí)間1～85 月，中位隨訪時(shí)間23個(gè)月，共86.4%（102/118）的患者獲得隨訪信息，失訪率13.6%（16/118）。確診后進(jìn)行了手術(shù)或化療，并具有影像學(xué)資料用以評(píng)估病情發(fā)展的有96 人，隨訪結(jié)束時(shí)患者的平均生存時(shí)間（33.9±24.4）月，平均復(fù)發(fā)和（或）死亡時(shí)間（29.2±24.2）月。49%（50/102）的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和（或）死亡，且多在第一年內(nèi)復(fù)發(fā)（32/50）。36.3%（37/102）的患者死亡，且多在第一年內(nèi)死亡（23/37），另外63.7%（65/102）的患者仍存活，最長(zhǎng)生存時(shí)間超過(guò)85個(gè)月。

2.3 本組DLBCL臨床病理分型

本組病例Hans 分型如圖1 所示，Hans 分型根據(jù)腫瘤細(xì)胞CD10，Bcl-6 和MUM-1 免疫組化表達(dá)情況來(lái)劃分DLBCL，CD10 陽(yáng)性診斷為GCB 型；CD10、Bcl-6均為陰性診斷為Non-GCB型，若Bcl-6陽(yáng)性則還需結(jié)合MUM-1 的表達(dá)情況再劃分；本組DLBCL 病例中GCB 型占43.2%（51/118），Non-GCB型占56.8%（67/118）。

2.4 p-AXL表達(dá)與DLBCL的臨床病理聯(lián)系

2.4.1 p-AXL，c-MYC 及BCL-2 蛋白在本組病例中的表達(dá) 本組病例分為GCB 組和non-GCB 組，其HE形態(tài)（HE×400）及p-AXL、c-MYC、BCL-2免疫組化（IHC×200）表達(dá)情況如圖2。GCB 型DLB?CL 腫瘤細(xì)胞p-AXL 蛋白陽(yáng)性表達(dá)量較低（圖2C），non-GCB 型瘤細(xì)胞p-AXL 蛋白表達(dá)量較高（圖2D）；c-MYC在不同組織學(xué)亞型DLBCL中呈核陽(yáng)性（圖2E，F(xiàn)）；不同的DLBCL 組織學(xué)類型中BCL-2陽(yáng)性比例及染色強(qiáng)度不盡相同，但均為陽(yáng)性表達(dá)（圖2G，H）。

2.4.2 p-AXL 表達(dá)與DLBCL 患者臨床特征的相關(guān)性研究 p-AXL在腫瘤細(xì)胞的胞膜或胞質(zhì)中表達(dá)，陽(yáng)性率44.1%（52/118），16 例呈高表達(dá)。c-MYC 蛋白在細(xì)胞核表達(dá)，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)p-AXL 表達(dá)與DLBCL 患者的性別、年齡、B 癥狀、原發(fā)部位、血清中β2-MG、乳酸脫氫酶（LDH）水平、Ann Arbor 分期、IPI 評(píng)分均無(wú)關(guān)（P＞0.05），但與患者化療緩解率顯著相關(guān)（P＜0.01），p-AXL 陽(yáng)性患者的化療緩解率明顯較低。p-AXL 表達(dá)與DLB?CL 組織的Hans 分型顯著性相關(guān)（P＜0.01），陽(yáng)性表達(dá)中73.1%（38/52）為Non-GCB型（表1）。

圖1 本組118例DLBCL的Hans分型Fig.1 Hans classification of 118 cases of DLBCL in this study

圖2 DLBCL的組織學(xué)形態(tài)及免疫組化表達(dá)情況Fig.2 The morphology features of the two sub-styles in this group of DLBCL

表1 p-AXL表達(dá)與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系Table1 The relationship between the expression of P-AXL and the clinic-pathological features ［n（%）］

2.4.3 p-AXL 與BCL-2 或c-MYC 表達(dá) 的相關(guān) 性研究 本組病例組織中MYC斷裂基因陽(yáng)性率9.7%（11/113），發(fā)生斷裂的陽(yáng)性細(xì)胞比例在15%～80%。p-AXL 與c-MYC、BCL-2 蛋白表達(dá)均顯著性相關(guān)（P＜0.01）；與MYC 斷裂基因表達(dá)未見顯著相關(guān)性（P＞0.05；表2）。

2.4.4 p-AXL 表達(dá)與DLBCL 患者預(yù)后的相關(guān)性研究 單變量Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)p-AXL 表達(dá)與性別（P=0.003）、IPI 評(píng)分（P=0.016）及Hans 分型（P=0.029）等因素協(xié)同均是DLBCL 患者PFS 的顯著影響因素；但是，多變量Cox 回歸（backward：LR）分析發(fā)現(xiàn)p-AXL 表達(dá)僅與性別協(xié)同是患者PFS 的獨(dú)立影響因素，而p-AXL 表達(dá)及其與IPI 評(píng)分、Hans 分型均不是獨(dú)立影響因素（表3）。

應(yīng)用多變量Cox 回歸（backward：LR）分析，發(fā)現(xiàn)p-AXL 表達(dá)與性別是患者OS 的獨(dú)立影響因子，而p-AXL 與Hans 分型不是獨(dú)立預(yù)后影響因素（表4）。

Kaplan Meier 分析顯示，DLBCL 患者中p-AXL陽(yáng)性組的PFS 率低于陰性組（Log Rankχ2=6.449，P=0.011），OS率亦低于陰性組，但差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log Rankχ2=3.684，P=0.055）；其中p-AXL陰性組的3 年P(guān)FS 率和OS 率為61.2%和69.9%，而p-AXL 陽(yáng)性組的3 年P(guān)FS 率和OS 率僅41.9%和52.4%。另外，p-AXL 陽(yáng)性的男性患者的PFS 率（Log Rankχ2=7.836，P=0.005）和OS 率（Log Rankχ2=6.215，P=0.013）也均明顯降低，其3 年P(guān)FS 率和OS率僅23.6%和30.0%，而女性或p-AXL陰性患者的3年P(guān)FS率和OS率為62.6%和72.8%（圖3）。

表2 p-AXL與BCL-2或c-MYC表達(dá)的相關(guān)性研究Table 2 Relationship between the expression of PAXL and the expression of BCL-2 or c-MYC

2.4.5 p-AXL/c-MYC/BCL-2 蛋白共表達(dá)與DLB?CL 臨床病理特征的相關(guān)性研究 應(yīng)用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，p-AXL/c-MYC/BCL-2 共表達(dá)者患者的化療緩解顯著性降低（P=0.001）；p-AXL/c-MYC/BCL-2蛋白共表達(dá)者與患者的Hans分型顯著性相關(guān)（P=0.001），其中Non-GCB 型為81.3%（26/32；表5）；3 種蛋白共表達(dá)與其他臨床參數(shù)包括性別、年齡、B 癥狀、原發(fā)部位、血β2-MG、LDH 水平、Ann Arbor分期及IPI評(píng)分均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

2.4.6 p-AXL 與c-MYC 和/或BCL-2 共表達(dá)與DL?BCL 患者預(yù)后的相關(guān)性研究 單變量Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)p-AXL/c-MYC（P=0.000）、p-AXL/BCL-2（P=0.024）、p-AXL/c-MYC/BCL-2（P=0.002）蛋白共表達(dá)都是DLBCL 患者PFS 的危險(xiǎn)因素；多變量Cox回歸分析（backward：LR）顯示只有p-AXL/c-MYC蛋白共表達(dá)是DLBCL 患者PFS 獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.001；表6）。

表3 52例DLBCL患者PFS的多變量Cox回歸結(jié)果（1）Table 3 Multivariate cox analysis of PFS in 52 patients with DLBCL（part 1）

表4 52例DLBCL患者OS的多變量Cox回歸結(jié)果（2）Table 4 Multivariate cox analysis of OS in 52 patients with DLBCL（part 2）

圖3 生存曲線分析Fig.3 Survival curves of the patients

與DLBCL 的PFS 影響因素相類似，單變量Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)p-AXL/c-MYC（P=0.003）、p-AXL/c-MYC/BCL-2（P=0.01）蛋白共表達(dá)是DLBCL 患者OS 的危險(xiǎn)因素，而p-AXL/BCL-2 共表達(dá)不是患者OS 的影響因素；多變量Cox 回歸（backward：LR）分析發(fā)現(xiàn)只有p-AXL/c-MYC 蛋白共表達(dá)是DLBCL患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.002；表7）。

Kaplan Meier 分析顯示，p-AXL/c-MYC 蛋白共表達(dá)組的PFS 率（Log Rankχ2=13.659，P=0.000）和OS 率（Log Rankχ2=10.363，P=0.001）明顯低于非共表達(dá)組，p-AXL/c-MYC 共表達(dá)患者的3年P(guān)FS率和OS 率僅22.5%和28.8%，而非共表達(dá)患者的PFS 率和OS率為66.6%和75.3%，明顯高于共表達(dá)組的生存率（圖4）。

3 討論

圖4 p-AXL/c-MYC 蛋白共表達(dá)與DLBCL患者的生存曲線Fig.4 Survival curves of patients with co-expression of p-AXL/c-MYC proteins

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）更常見于發(fā)達(dá)地區(qū)，發(fā)病率最高的分別是北美洲、澳洲和歐洲，最低的是加勒比地區(qū)和亞洲［3］。盡管淋巴瘤不在我國(guó)最常見的10 種惡性腫瘤之內(nèi)，但其死亡率仍排名第十位［23］。DLBCL 是NHL中最常見的組織學(xué)類型［1-3］，因此，對(duì)DLBCL 進(jìn)行更多的臨床病理研究有助于深入地認(rèn)識(shí)淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制，為臨床預(yù)后評(píng)估提供更多的理論依據(jù)。

表5 p-AXL/c-MYC/BCL-2蛋白共表達(dá)與DLBCL患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 5 Relationship between co-expression of P-AXL/BCL-2/c-MYC and the clinic-pathological features［n，n（%）］

表6 p-AXL和c-MYC與DLBCL患者PFS的多變量Cox回歸分析Table 6 Multiple cox analysis of PFS between P-AXL and the expression of c-MYC ［n（%）］

表7 p-AXL與c-MYC和/或BCL-2影響DLBCL患者OS的多變量Cox回歸分析Table 7 Multiplecox analysis of OS between P-AXL and the expression of c-MYC ［n（%）］

AXL 蛋白陽(yáng)性表達(dá)或與其他抗體聯(lián)合表達(dá)是乳腺癌、肺癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等［24-26］預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志物。AXL 異常表達(dá)亦參與肉瘤的發(fā)生發(fā)展，Gas6 激活的AXL 能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［10］。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)人報(bào)道AXL 與DLBCL之間的相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)活化的p-AXL 蛋白可在DLBCL 中表達(dá)，陽(yáng)性率44.1%（52/118）。p-AXL 與c-MYC 蛋白、BCL-2 蛋白表達(dá)顯著性相關(guān)（P＜0.01）；并發(fā)現(xiàn)p-AXL 與Hans 分型顯著相關(guān)（P＜0.01），陽(yáng)性表達(dá)中73.1%（38/52）為Non-GCB型。此外，還發(fā)現(xiàn)p-AXL 與DLBCL 患者的化療緩解顯著相關(guān)（P＜0.01），陽(yáng)性患者的化療緩解率顯著低于陰性患者。Kaplan Meier生存曲線分析顯示p-AXL 陽(yáng)性患者的PFS 率和OS 率明顯低于陰性患者。Cox 單因素分析得出p-AXL 陽(yáng)性表達(dá)是影響DLBCL 患者PFS 的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），但不是影響患者OS 危險(xiǎn)因素（P＞0.05）。以上結(jié)果表明p-AXL 參與了DLBCL 的發(fā)生發(fā)展，與患者的化療緩解率和PFS呈顯著性負(fù)相關(guān)，因此p-AXL蛋白有望成為評(píng)估DLBCL患者預(yù)后的新指標(biāo)。

既往研究［17-19］表明BCL-2 蛋白過(guò)表達(dá)是DLB?CL 患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)。BCL-2 蛋白阻斷化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，臨床上利妥昔單抗（美羅華）提高BCL-2陽(yáng)性者對(duì)化療藥物的應(yīng)答率，從而抵消BCL-2 蛋白對(duì)DL?BCL 患者生存帶來(lái)的不良影響［20］。BCL-2 在本組DLBCL 中的陽(yáng)性率為79.7%（90/118），其中p-AXL/BCL-2 蛋白共表達(dá)率為41.5%（49/118），p-AXL/BCL-2 共表達(dá)者化療緩解率顯著性降低（P＜0.01），常見于Non-GCB 型且具有顯著性意義（P＜0.01）。Cox單因素分析中顯示，p-AXL/BCL-2蛋白共表達(dá)者患者PFS 顯著性降低（P＜0.05），但對(duì)患者OS 無(wú)明顯影響（P＞0.05）。c-MYC 蛋白表達(dá)和MYC基因易位亦是DLBCL患者的重要預(yù)后指標(biāo)［15］。本組DLBCL 病例中p-AXL 與c-MYC 蛋白表達(dá)具有顯著的相關(guān)性（P＜0.01），118 例中有34 例（28.8%）存在p-AXL/c-MYC 蛋白共表達(dá)且與Hans分型顯著相關(guān)（P＜0.01），其中82.4%（28/34）為預(yù)后較差的Non-GCB 型。此外，p-AXL/c-MYC 蛋白共表達(dá)DLBCL 患者的化療緩解率顯著性降低（P＜0.01）；Kaplan Meier 生存曲線顯示，p-AXL/c-MYC共表達(dá)亦顯著性降低患者的PFS 率和OS 率（P＜0.01）。Cox 多因素回歸分析證實(shí)了p-AXL/c-MYC蛋白共表達(dá)是DLBCL患者顯著的不良預(yù)后因素。

c-MYC/BCL-2蛋白共表達(dá)與DLBCL的侵襲性密切相關(guān)，且是患者預(yù)后不良的因素之一［20-21］。本研究中Cox單因素回歸分析顯示c-MYC/BCL-2、p-AXL/c-MYC、p-AXL/c-MYC/BCL-2 共表達(dá)都是DLBCL 患者PFS 和OS 的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），共表達(dá)組的PFS 率和OS 率均明顯低于非共表達(dá)組（P＜0.05）。將上述指標(biāo)用逐步后退法（backward：LR）進(jìn)行Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示，只有p-AXL/c-MYC 共表達(dá)是患者獨(dú)立的預(yù)后因素（P＜0.01），而c-MYC/BCL-2 和p-AXL/c-MYC/BCL-2 共表達(dá)不是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＞0.05）。我們分析出現(xiàn)此結(jié)果可能是由于引入了p-AXL 變量，這一變量在以往DLBCL 預(yù)后研究中從未被發(fā)現(xiàn)過(guò)，由于p-AXL/c-MYC 共表達(dá)可能對(duì)患者預(yù)后意義影響更大，經(jīng)過(guò)Cox 多因素回歸校正混雜因素后，影響較小的c-MYC/BCL-2共表達(dá)不再具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

AXL 可以通過(guò)激活A(yù)KT 信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的致癌作用或耐藥性［10，27-28］。食管腺癌的癌細(xì)胞中AXL 過(guò)表達(dá)后通過(guò)激活A(yù)KT/β-catenin 蛋白信號(hào)通路，可以上調(diào)c-MYC 的轉(zhuǎn)錄活性、mRNA 和蛋白水平，從而導(dǎo)致患者對(duì)表阿霉素產(chǎn)生耐藥［29］。另有文獻(xiàn)［16］報(bào)道腫瘤細(xì)胞通過(guò)釋放活性氧可以促進(jìn)Gas6 分泌，使其與受體AXL 結(jié)合，通過(guò)激活Ras/PI3K/AKT 信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞中c-MYC 的過(guò)表達(dá)來(lái)正向調(diào)節(jié)精氨基琥珀酸合成酶1（ASS1）的生成，從而合成腫瘤細(xì)胞中所需的ASS1，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)c-MYC 的過(guò)表達(dá)可以反饋增強(qiáng)AXL 的表達(dá)。綜上所述，c-MYC 和AXL 之間并不是簡(jiǎn)單的平行關(guān)系，兩者之間可能存在信號(hào)通路相互調(diào)節(jié)的機(jī)制。我們推測(cè)在DLBCL 細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)的AXL 可能通過(guò)激活A(yù)KT 或其他信號(hào)通路上調(diào)c-MYC 水平，AXL 和c-MYC的同時(shí)過(guò)表達(dá)可能增強(qiáng)DLBCL的侵襲性，或降低了患者對(duì)化療藥物的應(yīng)答率，從而使患者的生存率下降，其詳細(xì)分子機(jī)制需要進(jìn)一步的深入研究。

約10%的DLBCL 中可檢測(cè)到MYC 易位（范圍在4%～14%之間），且更多見于GCB 型患者，此時(shí)GCB 型的預(yù)后明顯差于Non-GCB 型［22］。在本研究中，113例可判讀的組織中有11例MYC基因出現(xiàn)斷裂，陽(yáng)性率9.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。MYC基因斷裂陽(yáng)性組織中GCB 型為63.6%（7/11），而Non-GCB 型僅為36.4%（4/11）；11 例MYC基因斷裂者中9 例有隨訪結(jié)果，5 例GCB 型患者4 例死亡，而4 例Non-GCB型患者僅1例死亡，與文獻(xiàn)所述結(jié)論基本一致，但因例數(shù)所限，本組病例中組織分型及預(yù)后的差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中p-AXL 表達(dá)與MYC斷裂基因共表達(dá)者僅5 例，未能發(fā)現(xiàn)p-AXL 蛋白與MYC基因斷裂之間具有顯著性臨床病理聯(lián)系。

有研究［2，30］顯示，男性DLBCL 患者預(yù)后較女性差，原因之一是由于不同性別體內(nèi)的化療藥物代謝率不同，男性體內(nèi)血漿中的利妥昔單抗（美羅華）清除率明顯快于女性。當(dāng)男性使用強(qiáng)化劑量的美羅華時(shí)，可消除由性別引起的治療差異［2，31］。Kaplan Meier 生存曲線顯示，男性且p-AXL 陽(yáng)性患者的PFS 率和OS 率均明顯低于不同時(shí)具備這兩個(gè)條件的患者。Cox回歸分析顯示，雖然性別并不是DLB?CL 患者預(yù)后的影響因素，但男性和p-AXL 陽(yáng)性兩個(gè)因素并存卻是患者PFS 和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。這一結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道的男性患者預(yù)后較女性差相一致，但還需要更深入的研究以揭示其相關(guān)分子機(jī)制。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)磷酸化受體酪氨酸激酶p-AXL蛋白在彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤中表達(dá)，且與c-MYC、BCL-2 的表達(dá)均顯著性相關(guān)；p-AXL陽(yáng)性表達(dá)與DLBCL 患者Hans 分型、化療緩解率降低、無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期縮短顯著性相關(guān)；p-AXL/c-MYC 協(xié)同表達(dá)、男性且p-AXL 陽(yáng)性均可作為DLBCL的獨(dú)立性預(yù)后指標(biāo)。

致謝：本研究中組織芯片制作得到中山大學(xué)附屬腫瘤防治中心病理科主任云徑平教授、楊霞技師的大力支持，在此表示衷心感謝！