師小函，石云鋒，巴俊慧，羅進(jìn)梅，胡佳佳，吳本權(quán)

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院MICU，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510630）

甲型流感病毒（甲流病毒）引起呼吸道感染，變異株易引起大范圍流感爆發(fā)流行［1-2］，如1918 年西班牙H1N1 大流感，導(dǎo)致將近5 000 萬(wàn)人死亡。人類(lèi)感染甲流病毒后易繼發(fā)耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）感染，導(dǎo)致重癥肺炎［3］。甲流病毒感染1 周是繼發(fā)MRSA 肺炎的高峰期。國(guó)內(nèi)外對(duì)甲流病毒繼發(fā)MRSA 感染的機(jī)制研究多數(shù)關(guān)注上皮細(xì)胞粘附性的增加及局部免疫屏障的破壞等［4-5］。近年研究發(fā)現(xiàn)NLRP3（nucleotide oligomerization and bind?ing domain-like receptor P3，NLRP3）炎癥小體在抗甲流病毒免疫中起重要作用［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)MRSA感染亦能激活NLRP3 炎癥小體［8］。甲流病毒聯(lián)合MRSA 感染降低了NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β的釋放，加劇MRSA 肺炎［9］。但在臨床真實(shí)的病理生理狀況，即甲流病毒感染后繼發(fā)MRSA 感染，NL?RP3 炎癥小體在其中的具體作用如何，未見(jiàn)相關(guān)研究。本研究以MRSA感染經(jīng)甲流病毒H1N1預(yù)感染1 周的小鼠巨噬細(xì)胞，研究NLRP3 炎癥小體在甲流病毒感染繼發(fā)MRSA肺炎中活性及其作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系、病毒株和菌株

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。甲流病毒H1N1/FM1為鼠肺適應(yīng)株，獲贈(zèng)于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室。MRSA 菌株為中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的臨床菌株。實(shí)驗(yàn)均在實(shí)驗(yàn)室同意的情況下在生物安全柜中進(jìn)行操作。

1.2 試劑和材料

MLV 第一鏈合成試劑盒、SYBR? select mas?ter mix 購(gòu) 于美 國(guó)Life Technologies 公司。NLRP3 單克隆兔抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。NLRP3 免疫熒光羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)R&D 公司。Hoechst33342 購(gòu)于中國(guó)谷歌生物科技公司。內(nèi)參抗體GAPDH 兔抗體及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗、凱基全蛋白提取試劑盒及凱基BCA 法蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州杰特偉科技有限公司。ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

以完全培養(yǎng)基在25 mL 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)RAW 264.7 細(xì)胞，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞融合至約70%培養(yǎng)瓶底面積且狀態(tài)良好時(shí)用胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，MTT染色細(xì)胞活力＞98%。

1.4 甲流病毒H1N1復(fù)蘇和毒力測(cè)定

復(fù)蘇液氮罐中凍存的H1N1/FM1 病毒株，于9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2 次擴(kuò)增，以雞紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)測(cè)定擴(kuò)增的病毒效價(jià)。以無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液對(duì)H1N1/FM1 病毒株行連續(xù)10 倍遞次稀釋至10-8。以RAW264.7 細(xì)胞檢測(cè)計(jì)算病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染計(jì)量（median tissue culture infective dose，TCID50）［10］。

1.5 細(xì)菌培養(yǎng)

解凍-80 ℃凍存的MRSA 菌株，接種于血瓊脂培養(yǎng)基并37 ℃溫箱培養(yǎng)，挑取菌落溶于無(wú)菌PBS中，測(cè)定其在600 nm 處吸光度（optical density，OD600），OD600=0.6時(shí)細(xì)菌含量為1×109/mL。

1.6 甲流病毒H1N1、MRSA 感染小鼠巨噬細(xì)胞及分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞按1×106/mL密度接種于6 孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基2 mL，待細(xì)胞擴(kuò)增至2×106時(shí)作為實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)0 h，換液，H1N1預(yù)感染組加入病毒。根據(jù)病毒TC ID50的測(cè)定結(jié)果，每孔加入100 μL 的10 TCID50病毒稀釋液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MRSA 按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10：1 加入培養(yǎng)板中感染細(xì)胞。空白對(duì)照組無(wú)干預(yù)，MRSA 組在常規(guī)培養(yǎng)168 h（1 周）后加MRSA 感染24 h，H1N1+MRSA 組在H1N1 感染168 h（1 周）后加MRSA 序貫感染24 h。細(xì)胞分別于第0、48、96 和144 h 換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)統(tǒng)一收集細(xì)胞。

1.7 RT-qPCR 法檢測(cè)NLRP3、Caspase-1 和IL-1β的mRNA表達(dá)水平

收集上述各組細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度。采用ABI7500系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：50 ℃2 min，95 ℃2 min 預(yù)變性，95 ℃15 s變性、60 ℃1 min退火，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃30 s，60 ℃15 s 延伸。記錄目的基因與內(nèi)參基因的Ct 值，用mRNA=2-ΔΔCT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)引物見(jiàn)表1。

1.8 免疫熒光檢測(cè)NLRP3蛋白強(qiáng)度

根據(jù)操作流程完成如下步驟：40 g/L 多聚甲醛固定細(xì)胞、0.5%TritonX-100 室溫通透、5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉、孵育NL?RP3 一抗、孵熒光二抗、Hoechest33342 復(fù)染、加防熒光淬滅劑，之后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。期間注意磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌及后期避光操作。

1.9 Western Blot法檢測(cè)NLRP3的蛋白表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞后提取總蛋白。按凱基BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定蛋白濃度。按Western Blot 步驟，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，在Chemi Scope 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，用Im?age J 軟件分析NLRP3 的蛋白灰度值，計(jì)算其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 ELISA檢測(cè)血清中IL-1β的濃度

根據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒的操作流程，空白孔及每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-1β的濃度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布，以±s表示。滿足方差齊性的組間比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較采用LSD 法。不符合方差齊性的組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)細(xì)胞貼壁牢固，外形為類(lèi)圓形，折光率均一，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，至鋪滿孔板接觸抑制。甲流病毒感染期間細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化。各組細(xì)胞培養(yǎng)至1 周時(shí)仍生長(zhǎng)良好，實(shí)驗(yàn)組加入MRSA 感染24 h 后可見(jiàn)胞周折光率稍增高（圖1）。各組細(xì)胞均完成實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組巨噬細(xì)胞NLRP3、Caspase-1 及IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量

NLRP3 的mRNA 表達(dá)水平各組總體分布不完全相同（H=6.286，P=0.043），MRSA 組相對(duì)空白對(duì)照組基本未見(jiàn)升高（P=1.00；圖2A），而在H1N1+MRSA 組表達(dá)明顯升高，與空白對(duì)照組、MRSA 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.026；圖2A）。Caspase-1 的mRNA 表達(dá)水平各組總體分布不完全相同（H=7.048，P=0.029），MRSA 組相對(duì)空白對(duì)照組也未見(jiàn)明顯升高（P=0.383；圖2B），但在H1N1+MRSA 組較空白對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009；圖2B）。IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平各組總體分布不完全相同（H=8.535，P=0.014），MRSA組較空白對(duì)照組明顯升高（P=0.004；圖2C），較H1N1+MRSA 組也升高，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.211；圖2C）。IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平在H1N1+MRSA 組較空白對(duì)照組也升高，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.118；圖2C）。

表1 NLRP3蛋白、Caspase-1和IL-1β mRNA的引物序列Table 1 Primer sequences of NLRP3，Caspase-1 and IL-1β mRNA

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 Growth state of cells in each group under light microscope

2.3 各組巨噬細(xì)胞NLRP3蛋白免疫熒光強(qiáng)度

MRSA組巨噬細(xì)胞NLRP3蛋白免疫熒光稍增強(qiáng)，H1N1+MRSA組NLRP3蛋白免疫熒光強(qiáng)度明顯高于空白對(duì)照組及MRSA組，表明H1N1+MRSA組NLRP3蛋白分布密度及范圍高于空白對(duì)照組與MRSA 組，變化趨勢(shì)與其mRNA表達(dá)水平相一致（圖3）。

2.4 各組巨噬細(xì)胞NLRP3的蛋白相對(duì)表達(dá)量

NLRP3 的蛋白表達(dá)水平各組總體分布不完全相同（F=353.524，P=0.000），MRSA組比空白對(duì)照組未見(jiàn)升高（P=0.132；圖4），而在H1N1+MRSA 組表達(dá)明顯升高，與空白對(duì)照組、MRSA 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.000；圖4）。

2.5 各組巨噬細(xì)胞上清液IL-1β濃度

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 mRNA level of NLRP3，Caspase-1 and IL-1β detected by fluorescence RT-PCR

圖3 免疫熒光檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞NLRP3蛋白密度及分布Fig.3 Density and distribution of NLRP3 protein detect?ed by immunofluorescence

細(xì)胞上清液IL-1β 濃度各組總體分布不完全相同（F=160.75，P=0.000），與空白對(duì)照組比，MRSA組細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β 濃度明顯升高，H1N1+MRSA 組上清液中IL-1β 濃度也升高。同時(shí)，H1N1+MRSA 組IL-1β 濃度低于MRSA 組。兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.000、0.001、0.000；圖5）；MRSA 組和空白對(duì)照組相比，IL-1β 上清液濃度與mRNA表達(dá)水平的結(jié)果相一致。

3 討論

甲流病毒致病機(jī)制為感染呼吸道上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引起劇烈的炎癥反應(yīng)。MRSA 可定植于人體鼻咽部，其主要的致病因子包括磷壁酸、肽聚糖及外毒素等，當(dāng)局部或全身免疫力下降時(shí)，引起MRSA 侵襲性肺炎。甲流病毒感染患者繼發(fā)MRSA 肺炎，是導(dǎo)致重癥肺炎甚至臨床死亡的主要原因。臨床發(fā)現(xiàn)甲流病毒感染后約1 周時(shí)間是繼發(fā)MRSA 肺炎的高峰期［8-10］。這些線索提示甲流病毒與MRSA 在致病及免疫應(yīng)答方面存在相關(guān)性。

圖4 Western blot檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞NLRP3的蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Translation of NLRP3 detected by western blot

圖5 ELISA檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β的濃度Fig.5 The concentrations of IL-1β in supernatant mea?sured by ELISA

肺泡巨噬細(xì)胞是抗甲流病毒及MRSA 感染最重要的免疫細(xì)胞，主要由Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）、NOD 樣受體（NOD like receptor，NLR）等模式識(shí)別受體識(shí)別甲流病毒及MRSA 的相應(yīng)成分，介導(dǎo)固有免疫與特異性免疫應(yīng)答［11］。

TLR 在細(xì)菌感染中作用及機(jī)制已有大量研究。如本課題組研究發(fā)現(xiàn)MRSA 可通過(guò)TLR2/TLR4-NF-κB 途徑引起肺泡巨噬細(xì)胞壞死及腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-10 的釋放［12-13］。NLR 在感染中的作用以NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體研究最為深入［6］。NLRP3 炎癥小體主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞，是NLRP3 蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）與半胱天冬酶1（caspase-1）形成的三聚體，誘導(dǎo)白介素（interleukin，IL）-1β、IL-18的釋放，介導(dǎo)下游的炎癥反應(yīng)。NLRP3 炎癥小體途徑的IL-1β 釋放需要雙信號(hào)通道。第一信號(hào)為T(mén)LR 識(shí)別病原微生物及其組成成分，通過(guò)NF-κB 途徑，誘導(dǎo)IL-1β 的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成無(wú)活性的pro-IL-1β。第2 信號(hào)為NLRP3 炎癥小體三聚體形成，自剪切無(wú)活性的caspase-1 為活化的cleaved-caspase-1，cleaved-caspase-1 剪切pro-IL-1β 為活性的IL-1β。NLRP3、caspase-1 及IL-1β 是監(jiān)測(cè)該炎癥小體活性及炎癥反應(yīng)的良好指標(biāo)。

主流研究［7］認(rèn)為，甲流病毒感染巨噬細(xì)胞通過(guò)NLRP3 炎癥小體途徑促進(jìn)IL-1β 的釋放。本課題組前期研究也驗(yàn)證，甲流病毒H1N1 感染巨噬細(xì)胞1周明顯激活NLRP3炎癥小體［8］。雖然也有研究發(fā)現(xiàn)MRSA 可通過(guò)吞噬－溶酶體途徑產(chǎn)生的活性氧激活NLRP3 炎癥小體［9］，但對(duì)NLRP3 炎癥小體在MRSA 感染中的作用及機(jī)制存在較多爭(zhēng)議。Robin?son 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，甲流病毒聯(lián)合MRSA 感染小鼠，NF-κB 信號(hào)途徑受到抑制，Pro-IL-1β 的產(chǎn)生及活性IL-1β 的釋放均降低，加劇MRSA 肺炎，但該研究未進(jìn)一步揭示NLRP3炎癥小體在其中的作用。

分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MRSA 組比空白對(duì)照組IL-1β 的mRNA 表達(dá)及上清液濃度均明顯升高，是MRSA 感染引起嚴(yán)重肺炎的分子機(jī)制。但MRSA組NLRP3、caspase-1 的mRNA 表達(dá)均沒(méi)有增強(qiáng)，NLRP3 蛋白免疫熒光強(qiáng)度也未見(jiàn)明顯增強(qiáng)，west?ern blot 檢測(cè)NLRP3 的蛋白表達(dá)量沒(méi)有增加，表明MRSA感染巨噬細(xì)胞24 h引起IL-1β的轉(zhuǎn)錄及分泌并不依賴NLRP3 炎癥小體途徑。研究［14-15］發(fā)現(xiàn)金葡菌聯(lián)合甲流病毒感染引起肺泡上皮細(xì)胞從凋亡向壞死性改變，并不是NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的焦亡。而我們前期究已發(fā)現(xiàn)MRSA 感染引起巨噬細(xì)胞壞死性改變是由TLR 信號(hào)途徑介導(dǎo)［12-13］。Richa等［16］發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌中樞神經(jīng)感染由ASC 而不是NLRP3 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及保護(hù)作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論相一致。

進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甲流病毒預(yù)感染后繼發(fā)MRSA 感染，NLRP3、caspase-1 的mRNA 表達(dá)均有增強(qiáng)，NLRP3蛋白免疫熒光密度及分布也明顯增加、增多，western blot 檢測(cè)NLRP3 的蛋白表達(dá)量明顯增加，上清液中IL-1β 濃度也升高，表明NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的激活。但甲流病毒預(yù)感染組與單純MRSA感染相比，雖然NLRP3的mRNA表達(dá)量、免疫熒光密度及蛋白表達(dá)量均增強(qiáng)，但I(xiàn)L-1β的mRNA 表達(dá)及上清液濃度均降低。綜上結(jié)果表明，甲流病毒H1N1 預(yù)感染1 周繼發(fā)MRSA 感染雖然激活了NLRP3 炎癥小體通路，但總體上降低了MRSA 感染引起的IL-1β 的表達(dá)。推論可能的機(jī)制為甲流病毒預(yù)感染激活NLRP3 炎癥小體第一信號(hào)通路的TLR17，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了巨噬細(xì)胞抗MRSA免疫的TLR2、TLR4信號(hào)通路，總體上降低了巨噬細(xì)胞對(duì)MRSA 的免疫反應(yīng)。有觀察到類(lèi)似現(xiàn)象的研究，甲流病毒感染抑制吞噬細(xì)胞NADPH 氧化酶依賴的細(xì)菌清除作用，增加了繼發(fā)MRSA 感染的易感性［5］。同時(shí)，因?yàn)镮L-1β 是炎癥反應(yīng)重要的上游促炎癥細(xì)胞因子，IL-1β 表達(dá)及分泌下降削弱了機(jī)體免疫強(qiáng)度及對(duì)MRSA 的清除能力，該效應(yīng)可能是甲流病毒感染易繼發(fā)MRSA 肺炎的機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MRSA 感染肺泡巨噬細(xì)胞引起IL-1β的釋放不依賴NLRP3炎癥小體途徑，甲流病毒預(yù)感染降低了巨噬細(xì)胞抗MRSA 免疫IL-1β 的表達(dá)，該效應(yīng)可能是甲流病毒感染易繼發(fā)MRSA 肺炎的機(jī)制之一。同時(shí)，NLRP3 炎癥小體在機(jī)體發(fā)生甲流病毒感染繼發(fā)MRSA 肺炎時(shí)的具體作用、機(jī)制以及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)如何，關(guān)于TLR17與TLR2、TLR4信號(hào)通路的推論，都將有待于進(jìn)一步的研究明確。