周 暢，陳偉強(qiáng)，王宇恒，楊曉夏，涂 幸，劉 靖，羅 利

（廣東藥科大學(xué)1.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院；2.護(hù)理學(xué)院，廣東廣州 510006）

胃癌是我國(guó)第二大惡性腫瘤，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因［1-2］。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌治療失敗的原因之一，轉(zhuǎn)移不僅與腫瘤自身有關(guān)，更與腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境相關(guān)［3-4］。腫瘤微環(huán)境包括細(xì)胞外基質(zhì)和多種間質(zhì)細(xì)胞。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是間質(zhì)細(xì)胞中最豐富的細(xì)胞類型［5］。臨床數(shù)據(jù)顯示CAFs與胃癌預(yù)后密切相關(guān)［6］。然而CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響及相關(guān)機(jī)制仍未明確。胃癌轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的演變過(guò)程，“上皮-間質(zhì)”轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesen?chymal transition，EMT）是影響轉(zhuǎn)移的重要因素［7］。EMT 指上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力［8-9］。E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志物［10］。E-cadherin 可介導(dǎo)細(xì)胞粘附，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［11］。Vimentin 和N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞中的中間絲蛋白，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)［12-13］。有研究表明肺癌CAFs 內(nèi)高表達(dá)EMT 相關(guān)基因，提示兩者存在相關(guān)性［14］。另有報(bào)道顯示CAFs 可誘導(dǎo)前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞的EMT 進(jìn)程［15-16］。但有關(guān)CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞EMT 影響的研究較少。在本研究將通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)評(píng)估CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響；CAFs 作用于胃癌細(xì)胞后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞形態(tài)變化；通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)胃癌細(xì)胞中EMT 相關(guān)指標(biāo)變化，以此證實(shí)CAFs 的促癌作用與胃癌中EMT 進(jìn)程激活有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材 料

胃癌細(xì)胞株AGS 及MGC803 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；1640 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基、PBS緩沖液、青鏈霉素、胎牛血清及胰酶均購(gòu)自美國(guó)Hycolon 公司；DNA 酶、Ⅳ型膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Vimentin 抗體、Alexa-Fluor 594 結(jié)合山羊抗兔IgG（H+L）二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；DAPI 購(gòu)自北京索萊寶公司；Trizol裂解液購(gòu)自廣州英偉創(chuàng)津公司；qRT-PCR 引物由武漢谷歌生物公司合成；qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司；細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；8.0 μm Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)廣東藥科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，收集3 例胃癌手術(shù)患者的腫瘤組織及相配對(duì)的正常粘膜組織（距離腫瘤組織最近邊緣＞5 cm），分別用于培養(yǎng)CAFs 及NFs。配置含DNA 酶溶液（2 mg/mL）、透明質(zhì)酸酶溶液（20 mg/mL）、IV 型膠原蛋白酶溶液（20 mg/mL）、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基的組織消化液。在超凈臺(tái)內(nèi)用含1%青霉素-鏈霉素雙抗的PBS 溶液清洗組織塊3次，剪碎組織塊至1 mm3大小并加入組織消化液充分進(jìn)行組織裂解。裂解液經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液離心（2 000 r/min，r＝10 cm，10 min），棄上清，用含20% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80%，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。第3 代傳代后細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度達(dá)到90%，棄去培養(yǎng)基，PBS 溶液清洗2 次，加入無(wú)血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，收集兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液并離心（2 000 r/min，r＝10 cm，10 min），吸取上清凍存于-80 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前解凍上述細(xì)胞培養(yǎng)液并加入10%FBS，此時(shí)獲得兩種細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（NFs-CM、CAFs-CM）。胃癌細(xì)胞AGS 和MGC803 采用含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 2×104個(gè)NFs 或CAFs 在24孔板上爬行過(guò)夜，在4 ℃下用40 g/L 多聚甲醛固定30 min。預(yù)冷的100 μL 0.5%TritonX-100 室溫下處理15 min，PBS 洗滌3 次。5% BSA 溶液37 ℃孵箱中封閉1 h，之后加入兔抗人Vimentin 多克隆抗體（1：200）4 ℃孵育過(guò)夜。標(biāo)本中加入Alexa-Fluor 594結(jié)合山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶500）在室溫下避光孵育30 min 中，PBS 清洗后，加入DAPI 染色細(xì)胞核。最后用熒光顯微鏡對(duì)圖像進(jìn)行觀察（放大倍率，200×）。

1.2.3 熒光定量PCR 檢測(cè) 使用Trizol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA，RNA 作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照熒光定量PCR 使用說(shuō)明書檢測(cè)α-SMA、FAP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平，反應(yīng)條件為∶95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃下延伸34 s，40 個(gè)循環(huán)，肌動(dòng)蛋白（Actin）用作內(nèi)參。引物序列如表1 所示。檢測(cè)每個(gè)模板的CT 值（C 代表周期，T 代表閾值）。2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

表1 檢測(cè)基因的引物信息Table 1 The primer information of detected genes

1.2.4 細(xì)胞周期分析 收集1×106個(gè)NFs 和CAFs，PBS 洗2 次后，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇溶液中，4 ℃固定過(guò)夜。PBS 洗2 次后，加入細(xì)胞周期試劑盒中的碘化丙啶染色液（50 ng/mL）/RNase（0.2 mg/mL）/0.1%Triton X-100 混合液重懸細(xì)胞，并在37 ℃水浴箱中，避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.5 劃痕試驗(yàn) 將5×105個(gè)AGS 接種于6 孔板中，用NFs-CM 和CAFs-CM 培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)90%。MGC823 細(xì)胞也進(jìn)行同樣的處理。之后用10 μL 無(wú)菌移液管頭垂直于培養(yǎng)孔底劃3 條平行線，造成傷口。PBS 洗滌脫落細(xì)胞，之后加入無(wú)血清1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，鏡下觀察0、24和48 h劃痕愈合程度（放大倍率，200×）。

1.2.6 Transwell 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 侵襲試驗(yàn)將基質(zhì)膠用預(yù)先冷卻的無(wú)血清1640 培養(yǎng)基稀釋（稀釋比為1∶3），將50 μL 稀釋后的凝膠加入Tran?swell 小室上室面并置入培養(yǎng)箱中2 h，將1×105個(gè)AGS用200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后，接種于8.0 μm Transwell 小室上室，并將600 μL NFs-CM 或CAFs-CM 加入下室。在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，取出Transwell 小室，棄去小室中培養(yǎng)液，PBS 清洗2 遍，在室溫下用100%甲醇固定15 min。用棉簽擦拭未穿Transwell 小室基底膜的細(xì)胞。膜用結(jié)晶紫染色15～20 min。遷移實(shí)驗(yàn)不鋪基質(zhì)膠，4×104個(gè)AGS 加入Transwell 小室上室，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。在光學(xué)顯微鏡下選擇5 個(gè)代表性視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)（放大倍率，200×）。MGC803 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)的操作流程同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NFs與CAFs 的分離培養(yǎng)及鑒定

NFs 和CAFs 分別從胃癌手術(shù)患者的配對(duì)的正常粘膜組織及胃癌組織中分離培養(yǎng)（n=3）。傳代第3 代后的NFs 和CAFs 形狀均為長(zhǎng)梭形；但與NFs 相比，CAFs 多出現(xiàn)胞質(zhì)突起，排列較紊亂，更易發(fā)生融合性生長(zhǎng)（圖1A）。為了檢測(cè)NFs 和CAFs 的純度，我們對(duì)這兩種細(xì)胞株的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物——Vimentin 進(jìn)行檢測(cè)。免疫熒光結(jié)果顯示NFs 和CAFs 均表達(dá)Vimentin（圖1B）。后對(duì)CAFs 的特征性標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）進(jìn)行檢測(cè)，熒光定量PCR 結(jié)果表明：CAFs 中α-SMA 和FAP 的mRNA 表達(dá)水平高于NFs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（α-SMA：t=17.847，P=0.000 058；FAP：t=7.698，P=0.016 456；圖1C）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)常常用來(lái)反映細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示：與NFs 相比，CAFs 的細(xì)胞周期主要分布在S 期，而相應(yīng)的G1 期在細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（G1：t=3.793，P=0.019 218；G2：t=-3.169，P=0.033 903；S：t=4.379，P=0.011 888；圖1D）。這些數(shù)據(jù)表明我們成功地從正常的胃粘膜組織中分離及培養(yǎng)NFs，并成功地從胃癌組織中分離及培養(yǎng)CAFs。

2.2 CAFs-CM促進(jìn)GC細(xì)胞的遷移和侵襲

為了探索CAFs 對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲是否產(chǎn)生影響，我們收集NFs-CM（n=3）及CAFs-CM（n=3）作用于胃癌細(xì)胞并進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論在24 h 還是48 h，CAFs-CM 作用后的AGS 細(xì)胞遷移率高于NFs-CM 組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AGS 24 h：t=10.575，P=0.000 452；AGS 48 h：t=-5.270，P=0.006；圖2A）。之后再利用Tran?swell 小室的方法檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與NFs-CM組相比，CAFs-CM能增加AGS 細(xì)胞的遷移數(shù)量（t=-6.390，P=0.000 211；圖2B）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到與NFs-CM 組相比，當(dāng)CAFs-CM 作為吸引血清時(shí)，AGS 細(xì)胞穿過(guò)基層膠的數(shù)量增加（t=-4.114，P=0.003 372；圖2C）。類似的結(jié)果也在MGC803 細(xì)胞中得到證實(shí)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論在24 h還是48 h，CAFs-CM作用后的MGC803 細(xì)胞遷移率高于NFs-CM 組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MGC803 24 h：t=-7.690，P=0.001 538；MGC803 48 h：t=-8.572，P=0.001 017；圖3A）。之后再利用Transwell 小室的方法檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與NFs-CM 組相比，CAFs-CM 能增加MGC803 細(xì)胞的遷移數(shù)量（t=-10.826，P=0.000 005；圖3B）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到與NFs-CM 組相比，當(dāng)CAFs-CM 作為吸引血清時(shí)，MGC803 細(xì)胞穿過(guò)基層膠的數(shù)量增加（t=-4.273，P=0.006 741；圖3C）?？傊@些數(shù)據(jù)表明CAFs能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲。

圖1 NFs和CAFs的生長(zhǎng)特性與特異標(biāo)記Fig.1 The growth characteristics and special molecular markers of NFs and CAFs

圖2 CAFs體外促進(jìn)AGS細(xì)胞遷移與侵襲Fig.2 CAFs promoted migration and invasion of AGS cells in vitro

2.3 CAFs-CM啟動(dòng)GC細(xì)胞EMT過(guò)程

為進(jìn)一步探討CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移與侵襲的機(jī)制，我們通過(guò)光學(xué)顯微鏡鏡觀察到：與NFs-CM 組相比，CAFs-CM 作用后的AGS 和MGC803 細(xì)胞形態(tài)均由鵝卵石狀的上皮細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮?、紡錘形的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞變細(xì)，突起增多。同時(shí)，細(xì)胞之間的聯(lián)系變得松散（圖4A）。進(jìn)一步熒光定量PCR 結(jié)果NFs-CM 組相比，CAFs-CM 組AGS 和MGC803 細(xì)胞中的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)（AGS：t=2.801，P=0.048 767；MGC803：t=5.933，P=0.004 046；圖4B）均降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志 物Vimentin（AGS：t=3.232，P=0.031 910；MGC803：t=-6.382，P=0.003 094；圖4B）、N-cad?herin（AGS：t=-4.083，P=0.015 060；MGC803：t=-8.073，P=0.001 279；圖4B）表達(dá)上升。結(jié)果表明，CAFs可通過(guò)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程促進(jìn)AGS和MGC803細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

3 討論

圖3 CAFs體外促進(jìn)MGC803細(xì)胞遷移與侵襲Fig.3 CAFs enhanced migration and invasion of MGC803 cells in vitro

我國(guó)是胃癌的高發(fā)高死亡地區(qū)。大部分胃癌患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期，多數(shù)病人易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象［17］。胃癌的轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過(guò)程，其中最重要的一個(gè)因素是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的相互影響。在腫瘤微環(huán)境中，活化的成纖維細(xì)胞被稱CAFs，可通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤發(fā)生生長(zhǎng)、血管的形成［18］。但CAFs影響胃癌進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚。

本研究成功分離并培養(yǎng)NFs 及CAFs，Vimentin在NFs 及CAFs 中的高表達(dá)證實(shí)兩者具有纖維細(xì)胞的特征。盡管CAFs 表現(xiàn)出異質(zhì)性，但是α-SMA 及FAP 常常被認(rèn)為是區(qū)分CAFs 細(xì)胞和NFs 細(xì)胞的重要標(biāo)志物。α-SMA 是肌纖維母細(xì)胞的典型標(biāo)志，也是間質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志。當(dāng)NFs 與腫瘤細(xì)胞接觸后，可以自發(fā)地轉(zhuǎn)化為α-SMA 高表達(dá)的成纖維細(xì)胞，從而獲得CAFs 的表型特征。并且α-SMA 高表達(dá)的CAFs 更容易促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［19］。FAP 屬于絲氨酸蛋白酶，常在CAFs 表面高表達(dá)，具有膠原酶活性，能溶解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［20］。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)α-SMA 和FAP 在所培養(yǎng)的CAFs中呈現(xiàn)高表達(dá)，證明所獲得的CAFs處于腫瘤刺激下的成纖維細(xì)胞活化狀態(tài)。細(xì)胞周期分析表明：CAFs 較NFs的S期分布增加，而G1期分布減少；此結(jié)果表明CAFs的增殖率高于NFs，CAFs細(xì)胞具有異常增殖的特點(diǎn)。

圖4 CAFs調(diào)控AGS、MGC803細(xì)胞中的EMT變化Fig.4 CAFs caused EMT in AGS cells and MGC803 cells

為了探索CAFs 對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。我們采用CAFs-CM 與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這種培養(yǎng)方式可達(dá)到成纖維細(xì)胞與胃癌細(xì)胞非接觸式生長(zhǎng)，并保證了細(xì)胞間正常信號(hào)傳導(dǎo)及相互影響，更接近于人體腫瘤微環(huán)境。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明：與NFs-CM 組相比，CAFs-CM 組創(chuàng)面愈合較快，說(shuō)明CAFs 促進(jìn)了AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞的遷移。同時(shí)我們采用Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究CAFs-CM 對(duì)AGS 和MGC803 細(xì)胞遷移與侵襲的作用。我們發(fā)現(xiàn)CAFs 能促進(jìn)AGS 和MGC803 細(xì)胞的遷移和侵襲。

最后我們對(duì)CAFs促胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行了初步探究。EMT 在刺激許多癌癥的侵襲性方面常發(fā)揮關(guān)鍵作用［8，10，21］。在本研究中，我們觀察到與NFs-CM 組相比，CAFs-CM 處理的AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞逐漸失去細(xì)胞間的連接，細(xì)胞變得松散，呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形外觀。結(jié)果表明，AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化。此外，我們還對(duì)EMT 相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。熒光定量PCR 檢測(cè)表明：與NFs-CM 組相比，CAFs-CM 組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin 和N-cadherin 表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)CAFs 可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程促進(jìn)AGS細(xì)胞和MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)。

在本研究中，我們成功地分離和培養(yǎng)了NFs 和CAFs。我們發(fā)現(xiàn)CAFs 可以通過(guò)誘發(fā)EMT 反應(yīng)，促進(jìn)AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞的遷移和侵襲。今后，我們將繼續(xù)深入探究CAFs通過(guò)哪些具體的分子信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞EMT的進(jìn)程。