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癌相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移與侵襲

2020-08-17 05:11:38陳偉強(qiáng)王宇恒楊曉夏
關(guān)鍵詞:小室纖維細(xì)胞細(xì)胞周期

周 暢,陳偉強(qiáng),王宇恒,楊曉夏,涂 幸,劉 靖,羅 利

(廣東藥科大學(xué)1.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院;2.護(hù)理學(xué)院,廣東廣州 510006)

胃癌是我國(guó)第二大惡性腫瘤,是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1-2]。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌治療失敗的原因之一,轉(zhuǎn)移不僅與腫瘤自身有關(guān),更與腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境相關(guān)[3-4]。腫瘤微環(huán)境包括細(xì)胞外基質(zhì)和多種間質(zhì)細(xì)胞。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)是間質(zhì)細(xì)胞中最豐富的細(xì)胞類型[5]。臨床數(shù)據(jù)顯示CAFs與胃癌預(yù)后密切相關(guān)[6]。然而CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響及相關(guān)機(jī)制仍未明確。胃癌轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的演變過(guò)程,“上皮-間質(zhì)”轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesen?chymal transition,EMT)是影響轉(zhuǎn)移的重要因素[7]。EMT 指上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力[8-9]。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志物[10]。E-cadherin 可介導(dǎo)細(xì)胞粘附,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[11]。Vimentin 和N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞中的中間絲蛋白,參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)[12-13]。有研究表明肺癌CAFs 內(nèi)高表達(dá)EMT 相關(guān)基因,提示兩者存在相關(guān)性[14]。另有報(bào)道顯示CAFs 可誘導(dǎo)前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞的EMT 進(jìn)程[15-16]。但有關(guān)CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞EMT 影響的研究較少。在本研究將通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)評(píng)估CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響;CAFs 作用于胃癌細(xì)胞后,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞形態(tài)變化;通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)胃癌細(xì)胞中EMT 相關(guān)指標(biāo)變化,以此證實(shí)CAFs 的促癌作用與胃癌中EMT 進(jìn)程激活有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材 料

胃癌細(xì)胞株AGS 及MGC803 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);1640 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基、PBS緩沖液、青鏈霉素、胎牛血清及胰酶均購(gòu)自美國(guó)Hycolon 公司;DNA 酶、Ⅳ型膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;Vimentin 抗體、Alexa-Fluor 594 結(jié)合山羊抗兔IgG(H+L)二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司;DAPI 購(gòu)自北京索萊寶公司;Trizol裂解液購(gòu)自廣州英偉創(chuàng)津公司;qRT-PCR 引物由武漢谷歌生物公司合成;qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司;細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;8.0 μm Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)廣東藥科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),收集3 例胃癌手術(shù)患者的腫瘤組織及相配對(duì)的正常粘膜組織(距離腫瘤組織最近邊緣>5 cm),分別用于培養(yǎng)CAFs 及NFs。配置含DNA 酶溶液(2 mg/mL)、透明質(zhì)酸酶溶液(20 mg/mL)、IV 型膠原蛋白酶溶液(20 mg/mL)、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基的組織消化液。在超凈臺(tái)內(nèi)用含1%青霉素-鏈霉素雙抗的PBS 溶液清洗組織塊3次,剪碎組織塊至1 mm3大小并加入組織消化液充分進(jìn)行組織裂解。裂解液經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾,收集濾液離心(2 000 r/min,r=10 cm,10 min),棄上清,用含20% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80%,用2.5 g/L 胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。第3 代傳代后細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度達(dá)到90%,棄去培養(yǎng)基,PBS 溶液清洗2 次,加入無(wú)血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后,收集兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液并離心(2 000 r/min,r=10 cm,10 min),吸取上清凍存于-80 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前解凍上述細(xì)胞培養(yǎng)液并加入10%FBS,此時(shí)獲得兩種細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(NFs-CM、CAFs-CM)。胃癌細(xì)胞AGS 和MGC803 采用含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基,在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 2×104個(gè)NFs 或CAFs 在24孔板上爬行過(guò)夜,在4 ℃下用40 g/L 多聚甲醛固定30 min。預(yù)冷的100 μL 0.5%TritonX-100 室溫下處理15 min,PBS 洗滌3 次。5% BSA 溶液37 ℃孵箱中封閉1 h,之后加入兔抗人Vimentin 多克隆抗體(1:200)4 ℃孵育過(guò)夜。標(biāo)本中加入Alexa-Fluor 594結(jié)合山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶500)在室溫下避光孵育30 min 中,PBS 清洗后,加入DAPI 染色細(xì)胞核。最后用熒光顯微鏡對(duì)圖像進(jìn)行觀察(放大倍率,200×)。

1.2.3 熒光定量PCR 檢測(cè) 使用Trizol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA,RNA 作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照熒光定量PCR 使用說(shuō)明書檢測(cè)α-SMA、FAP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平,反應(yīng)條件為∶95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃下延伸34 s,40 個(gè)循環(huán),肌動(dòng)蛋白(Actin)用作內(nèi)參。引物序列如表1 所示。檢測(cè)每個(gè)模板的CT 值(C 代表周期,T 代表閾值)。2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,計(jì)算平均值。

表1 檢測(cè)基因的引物信息Table 1 The primer information of detected genes

1.2.4 細(xì)胞周期分析 收集1×106個(gè)NFs 和CAFs,PBS 洗2 次后,緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇溶液中,4 ℃固定過(guò)夜。PBS 洗2 次后,加入細(xì)胞周期試劑盒中的碘化丙啶染色液(50 ng/mL)/RNase(0.2 mg/mL)/0.1%Triton X-100 混合液重懸細(xì)胞,并在37 ℃水浴箱中,避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.5 劃痕試驗(yàn) 將5×105個(gè)AGS 接種于6 孔板中,用NFs-CM 和CAFs-CM 培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)90%。MGC823 細(xì)胞也進(jìn)行同樣的處理。之后用10 μL 無(wú)菌移液管頭垂直于培養(yǎng)孔底劃3 條平行線,造成傷口。PBS 洗滌脫落細(xì)胞,之后加入無(wú)血清1640 培養(yǎng)基,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),鏡下觀察0、24和48 h劃痕愈合程度(放大倍率,200×)。

1.2.6 Transwell 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 侵襲試驗(yàn)將基質(zhì)膠用預(yù)先冷卻的無(wú)血清1640 培養(yǎng)基稀釋(稀釋比為1∶3),將50 μL 稀釋后的凝膠加入Tran?swell 小室上室面并置入培養(yǎng)箱中2 h,將1×105個(gè)AGS用200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后,接種于8.0 μm Transwell 小室上室,并將600 μL NFs-CM 或CAFs-CM 加入下室。在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后,取出Transwell 小室,棄去小室中培養(yǎng)液,PBS 清洗2 遍,在室溫下用100%甲醇固定15 min。用棉簽擦拭未穿Transwell 小室基底膜的細(xì)胞。膜用結(jié)晶紫染色15~20 min。遷移實(shí)驗(yàn)不鋪基質(zhì)膠,4×104個(gè)AGS 加入Transwell 小室上室,其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。在光學(xué)顯微鏡下選擇5 個(gè)代表性視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)(放大倍率,200×)。MGC803 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)的操作流程同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NFs與CAFs 的分離培養(yǎng)及鑒定

NFs 和CAFs 分別從胃癌手術(shù)患者的配對(duì)的正常粘膜組織及胃癌組織中分離培養(yǎng)(n=3)。傳代第3 代后的NFs 和CAFs 形狀均為長(zhǎng)梭形;但與NFs 相比,CAFs 多出現(xiàn)胞質(zhì)突起,排列較紊亂,更易發(fā)生融合性生長(zhǎng)(圖1A)。為了檢測(cè)NFs 和CAFs 的純度,我們對(duì)這兩種細(xì)胞株的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物——Vimentin 進(jìn)行檢測(cè)。免疫熒光結(jié)果顯示NFs 和CAFs 均表達(dá)Vimentin(圖1B)。后對(duì)CAFs 的特征性標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)進(jìn)行檢測(cè),熒光定量PCR 結(jié)果表明:CAFs 中α-SMA 和FAP 的mRNA 表達(dá)水平高于NFs,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α-SMA:t=17.847,P=0.000 058;FAP:t=7.698,P=0.016 456;圖1C)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)常常用來(lái)反映細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示:與NFs 相比,CAFs 的細(xì)胞周期主要分布在S 期,而相應(yīng)的G1 期在細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(G1:t=3.793,P=0.019 218;G2:t=-3.169,P=0.033 903;S:t=4.379,P=0.011 888;圖1D)。這些數(shù)據(jù)表明我們成功地從正常的胃粘膜組織中分離及培養(yǎng)NFs,并成功地從胃癌組織中分離及培養(yǎng)CAFs。

2.2 CAFs-CM促進(jìn)GC細(xì)胞的遷移和侵襲

為了探索CAFs 對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲是否產(chǎn)生影響,我們收集NFs-CM(n=3)及CAFs-CM(n=3)作用于胃癌細(xì)胞并進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論在24 h 還是48 h,CAFs-CM 作用后的AGS 細(xì)胞遷移率高于NFs-CM 組細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(AGS 24 h:t=10.575,P=0.000 452;AGS 48 h:t=-5.270,P=0.006;圖2A)。之后再利用Tran?swell 小室的方法檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與NFs-CM組相比,CAFs-CM能增加AGS 細(xì)胞的遷移數(shù)量(t=-6.390,P=0.000 211;圖2B)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到與NFs-CM 組相比,當(dāng)CAFs-CM 作為吸引血清時(shí),AGS 細(xì)胞穿過(guò)基層膠的數(shù)量增加(t=-4.114,P=0.003 372;圖2C)。類似的結(jié)果也在MGC803 細(xì)胞中得到證實(shí)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論在24 h還是48 h,CAFs-CM作用后的MGC803 細(xì)胞遷移率高于NFs-CM 組細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MGC803 24 h:t=-7.690,P=0.001 538;MGC803 48 h:t=-8.572,P=0.001 017;圖3A)。之后再利用Transwell 小室的方法檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與NFs-CM 組相比,CAFs-CM 能增加MGC803 細(xì)胞的遷移數(shù)量(t=-10.826,P=0.000 005;圖3B)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到與NFs-CM 組相比,當(dāng)CAFs-CM 作為吸引血清時(shí),MGC803 細(xì)胞穿過(guò)基層膠的數(shù)量增加(t=-4.273,P=0.006 741;圖3C)??傊@些數(shù)據(jù)表明CAFs能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲。

圖1 NFs和CAFs的生長(zhǎng)特性與特異標(biāo)記Fig.1 The growth characteristics and special molecular markers of NFs and CAFs

圖2 CAFs體外促進(jìn)AGS細(xì)胞遷移與侵襲Fig.2 CAFs promoted migration and invasion of AGS cells in vitro

2.3 CAFs-CM啟動(dòng)GC細(xì)胞EMT過(guò)程

為進(jìn)一步探討CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移與侵襲的機(jī)制,我們通過(guò)光學(xué)顯微鏡鏡觀察到:與NFs-CM 組相比,CAFs-CM 作用后的AGS 和MGC803 細(xì)胞形態(tài)均由鵝卵石狀的上皮細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮?、紡錘形的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞變細(xì),突起增多。同時(shí),細(xì)胞之間的聯(lián)系變得松散(圖4A)。進(jìn)一步熒光定量PCR 結(jié)果NFs-CM 組相比,CAFs-CM 組AGS 和MGC803 細(xì)胞中的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)(AGS:t=2.801,P=0.048 767;MGC803:t=5.933,P=0.004 046;圖4B)均降低,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志 物Vimentin(AGS:t=3.232,P=0.031 910;MGC803:t=-6.382,P=0.003 094;圖4B)、N-cad?herin(AGS:t=-4.083,P=0.015 060;MGC803:t=-8.073,P=0.001 279;圖4B)表達(dá)上升。結(jié)果表明,CAFs可通過(guò)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程促進(jìn)AGS和MGC803細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

3 討論

圖3 CAFs體外促進(jìn)MGC803細(xì)胞遷移與侵襲Fig.3 CAFs enhanced migration and invasion of MGC803 cells in vitro

我國(guó)是胃癌的高發(fā)高死亡地區(qū)。大部分胃癌患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期,多數(shù)病人易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[17]。胃癌的轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過(guò)程,其中最重要的一個(gè)因素是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的相互影響。在腫瘤微環(huán)境中,活化的成纖維細(xì)胞被稱CAFs,可通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子作用于腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤發(fā)生生長(zhǎng)、血管的形成[18]。但CAFs影響胃癌進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚。

本研究成功分離并培養(yǎng)NFs 及CAFs,Vimentin在NFs 及CAFs 中的高表達(dá)證實(shí)兩者具有纖維細(xì)胞的特征。盡管CAFs 表現(xiàn)出異質(zhì)性,但是α-SMA 及FAP 常常被認(rèn)為是區(qū)分CAFs 細(xì)胞和NFs 細(xì)胞的重要標(biāo)志物。α-SMA 是肌纖維母細(xì)胞的典型標(biāo)志,也是間質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志。當(dāng)NFs 與腫瘤細(xì)胞接觸后,可以自發(fā)地轉(zhuǎn)化為α-SMA 高表達(dá)的成纖維細(xì)胞,從而獲得CAFs 的表型特征。并且α-SMA 高表達(dá)的CAFs 更容易促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[19]。FAP 屬于絲氨酸蛋白酶,常在CAFs 表面高表達(dá),具有膠原酶活性,能溶解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[20]。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)α-SMA 和FAP 在所培養(yǎng)的CAFs中呈現(xiàn)高表達(dá),證明所獲得的CAFs處于腫瘤刺激下的成纖維細(xì)胞活化狀態(tài)。細(xì)胞周期分析表明:CAFs 較NFs的S期分布增加,而G1期分布減少;此結(jié)果表明CAFs的增殖率高于NFs,CAFs細(xì)胞具有異常增殖的特點(diǎn)。

圖4 CAFs調(diào)控AGS、MGC803細(xì)胞中的EMT變化Fig.4 CAFs caused EMT in AGS cells and MGC803 cells

為了探索CAFs 對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。我們采用CAFs-CM 與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn),這種培養(yǎng)方式可達(dá)到成纖維細(xì)胞與胃癌細(xì)胞非接觸式生長(zhǎng),并保證了細(xì)胞間正常信號(hào)傳導(dǎo)及相互影響,更接近于人體腫瘤微環(huán)境。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明:與NFs-CM 組相比,CAFs-CM 組創(chuàng)面愈合較快,說(shuō)明CAFs 促進(jìn)了AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞的遷移。同時(shí)我們采用Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究CAFs-CM 對(duì)AGS 和MGC803 細(xì)胞遷移與侵襲的作用。我們發(fā)現(xiàn)CAFs 能促進(jìn)AGS 和MGC803 細(xì)胞的遷移和侵襲。

最后我們對(duì)CAFs促胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行了初步探究。EMT 在刺激許多癌癥的侵襲性方面常發(fā)揮關(guān)鍵作用[8,10,21]。在本研究中,我們觀察到與NFs-CM 組相比,CAFs-CM 處理的AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞逐漸失去細(xì)胞間的連接,細(xì)胞變得松散,呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形外觀。結(jié)果表明,AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化。此外,我們還對(duì)EMT 相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。熒光定量PCR 檢測(cè)表明:與NFs-CM 組相比,CAFs-CM 組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)下調(diào),而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin 和N-cadherin 表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)CAFs 可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程促進(jìn)AGS細(xì)胞和MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)。

在本研究中,我們成功地分離和培養(yǎng)了NFs 和CAFs。我們發(fā)現(xiàn)CAFs 可以通過(guò)誘發(fā)EMT 反應(yīng),促進(jìn)AGS 細(xì)胞和MGC803 細(xì)胞的遷移和侵襲。今后,我們將繼續(xù)深入探究CAFs通過(guò)哪些具體的分子信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞EMT的進(jìn)程。

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