武音帆，李 琴，鄒進超，毛鈺蘅，郭興悅，陳彥球，楊 燕

（1.中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東廣州 510080；2.廣東省營養(yǎng)與健康重點實驗室，廣東廣州 510080；3.廣東省營養(yǎng)轉(zhuǎn)化工程技術研究中心，廣東廣州 510080；4.中山大學公共衛(wèi)生學院（深圳），廣東深圳 518000；5.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心耳鼻喉科，廣東廣州 510623）

近20 年來過敏性鼻炎、哮喘等氣道炎癥發(fā)病率不斷升高［1-2］，其影響因素和發(fā)病機制錯綜復雜，而防治關鍵在于及時有效地控制病情［3］。糖皮質(zhì)激素作為過敏性氣道炎癥發(fā)作時的首選藥物在臨床上廣泛引用［4-5］，可快速緩解呼吸道癥狀，但長期依賴激素治療引起的副作用也不容忽視，如骨質(zhì)疏松、發(fā)音障礙以及兒童生長發(fā)育遲緩等［6-9］。因此選擇安全性更高的營養(yǎng)素作為輔助或替代性防治手段得到了越來越多的關注，例如姜黃素、花色苷、白藜蘆醇以及維生素D 等已被證實具有良好的抗哮喘功效［10-14］。由于此類營養(yǎng)素的生物利用度極低，通過膳食補充難以在較短時間內(nèi)發(fā)揮保護效應［15-16］，而采用注射的方式能夠幫助其更快起效：例如給予哮喘小鼠腹腔注射維生素D，可在短時間內(nèi)緩解呼吸道癥狀和減輕炎癥反應［17-18］，從而發(fā)揮更高的臨床應用價值。四氫姜黃素（terahydrocurcumin，THC）是姜黃素的主要代謝產(chǎn)物，具有比姜黃素更強的抗炎、抗氧化等生物學功效［19-21］。動物實驗發(fā)現(xiàn)，THC 在急性腎損傷、缺血再灌注以及肝脂肪病變、癌癥等多種急、慢性疾病中均起到保護作用［19，22-23］。本課題組前期的研究結(jié)果已證明長期膳食補充THC 可有效抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應，且防治效果優(yōu)于姜黃素［24］，然而THC 能否通過注射的方式在哮喘發(fā)作時更快地控制病情，值得更進一步的研究。因此，本研究通過腹腔注射THC 對過敏性哮喘小鼠進行治療，觀察短期THC 干預對小鼠呼吸道癥狀和炎癥反應的控制效果，探討THC 能否作為過敏性哮喘的一種替代性治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4 周齡雌性BALB/c 純系小鼠（20 只）購買于中山大學動物實驗中心，并飼養(yǎng)于中山大學公共衛(wèi)生學院SPF 級動物房，實驗動物相關操作符合動物實驗倫理規(guī)定，獲得中山大學動物倫理委員會批準，許可證號：SYXK［粵］2017-0080。

1.2 儀器和試劑

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（Sigma A5503 純度5 級），氫氧化鋁（Sigma A8222），AIG 95G 飼料（江蘇美迪森），四氫姜黃素（上海源葉），地塞米松（dexamethasone，DEX）壓縮空氣式霧化器（江蘇魚躍），ELISA 試劑盒（eBioscience），破膜破核劑（eBioscience），膠原酶（Sigma），DNaseⅠ（Roche）、細胞刺激劑（eBioscience），流式細胞術抗體CD3e（PE-eFluor?610）、CD4（APC-eFluor?780）、CD8a（FITC）、IFNgamma（APC）、IL-17A（PE）、IL-4（PECyanine7）、CD25（PE-Cyanine7）、IL-10（APC）、Foxp3（PE）購自eBioscience。

1.3 分組及處理

實驗動物按隨機數(shù)表法分為4 組（n=5）：空白對照組（PBS）、模型組（OVA）、陽性對照組（OVA+DEX）和THC 治療組（OVA+THC）。過敏性氣道炎癥小鼠模型的建立同本課題組已發(fā)表文獻［11，24］，主要步驟為：實驗第0、7 和14 天腹腔注射200 μL OVA 致敏液（含40 μg OVA 和4 mg 氫氧化鋁），間隔1 周后即第21～25 天，每日通過空氣壓縮霧化器霧化吸入5 mL 5% OVA 溶液，持續(xù)30 min 后使用40 μg/μL OVA 進行滴鼻處理（兩側(cè)鼻腔各滴入10 μL）。陽性對照組和THC 治療組小鼠在每次激發(fā)前分別經(jīng)腹腔注射給予2.5 mg/kg DEX 或20 mg/kg THC，空白對照組小鼠使用PBS 進行相應處理（圖1A）。

1.4 組織病理學分析

取左肺葉浸泡于40 g/L 多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，切片后進行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxy?lin-eosin，HE）染色和過碘酸雪夫（periodic acidschiff，PAS）染色，光學顯微鏡下分別觀察肺組織炎癥細胞浸潤及氣道上皮杯狀細胞增生及粘液分泌水平。組織病理學評分方法參考已發(fā)表文獻［25］：根據(jù)支氣管增厚以及支氣管周、毛細血管周和薄壁組織中炎性細胞浸潤的指標，按照嚴重程度分為0～4 分。采用Image J 軟件測定PAS 陽性區(qū)域的百分比，進而評估杯狀細胞增生和粘液分泌水平。

1.5 流式細胞術分析肺組織T細胞亞型

新鮮肺組織經(jīng)過剪切、研磨和消化獲取單細胞懸液，然后加入細胞刺激劑于二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培育5 h。刺激后使用相應抗體進行表面染色，破膜破核后繼續(xù)進行核內(nèi)染色，將所得樣本加入200 mL BufferⅡ重懸，上機檢測，檢測結(jié)果用FlowJo軟件分析各類T細胞亞型。

1.6 肺泡灌洗液（BALF）中細胞因子檢測

BALF 中Th2 細胞因子白介素（interleukin，IL）IL-4、IL-5、IL-13，Th17 細胞因子IL-17A，Th1 細胞因子干擾素（interferon，IFN）IFN-γ 和Treg 細胞因子IL-10 的檢測使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），具體方法參照試劑盒說明書進行。檢測結(jié)果使用多功能酶標儀進行讀數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 THC 對OVA 激發(fā)引起的小鼠體質(zhì)量變化和攝食水平無顯著影響

通過監(jiān)測和記錄小鼠體質(zhì)量變化，發(fā)現(xiàn)實驗的第0～21 天（即小鼠致敏階段），各組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長。第21～25天（即OVA激發(fā)階段），除正常對照組外各組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)不同程度的負增長趨勢（圖1B）。激發(fā)前后體質(zhì)量差值在正常對照組和OVA 組之間差異顯著（P＜0.05，圖1B，C），而THC 和DEX 未能有效緩解OVA 引起的小鼠體質(zhì)量丟失（圖1B、C）。各組間小鼠每日攝食量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖1D）。

2.2 THC減輕小鼠鼻部癥狀和減少撓鼻頻率

OVA 末次激發(fā)后，觀察小鼠胡須狀態(tài)，以及計數(shù)各組小鼠10 min 內(nèi)撓鼻次數(shù)（重復3 次并進行統(tǒng)計分析）。與正常對照組相比，模型組小鼠表現(xiàn)煩躁不安、抓撓頻繁以及弓背呼吸，其鼻部皮膚暴露、鼻周胡須明顯較短或丟失，且撓鼻頻率顯著升高。THC 或DEX 治療組小鼠鼻部毛發(fā)保存較為完整，撓鼻頻率明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖2），其中THC與OVA兩組均數(shù)之差為5.2，其95%置信區(qū)間（CI）為0.66～9.74，DEX 與OVA兩組均數(shù)之差為10.6，其95%CI為6.06～15.14。進一步比較發(fā)現(xiàn)DEX 治療組撓鼻頻率比THC治療組明顯更少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖2），兩組均數(shù)之差為-5.4，其95%CI為-9.94～-0.86。

2.3 THC 減少小鼠肺部炎性細胞浸潤和杯狀細胞增生

圖1 小鼠體質(zhì)量和攝食量變化Fig.1 Changes of mice’s body weight and food intakes

圖2 小鼠鼻部癥狀和撓鼻頻率Fig.2 Nasal symptoms and rubbing frequencies of OVA-induced mice

小鼠肺組織切片HE染色后鏡下觀察和進行病理評分，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，模型組小鼠支氣管和血管周炎性細胞浸潤明顯增加、支氣管壁增厚，而THC 或DEX 治療組小鼠炎性細胞浸潤和其管壁增厚癥狀顯著減輕（P＜0.05；圖3A、B），其中THC與OVA兩組均數(shù)之差為1.6，其95%CI為0.32～2.88，DEX 與OVA 兩組均數(shù)之差為2，其95% CI 為0.72～3.28，兩組治療組間病理學評分差異無統(tǒng)計學意義。PAS 染色可見模型組小鼠氣管上皮杯狀細胞增生明顯，粘液分泌增加，THC 或DEX 治療可明顯抑制杯狀細胞增生以及粘液分泌（P＜0.05，圖3C 和D），其中THC 與OVA 兩組均數(shù)之差為9.56，其95%CI為5.05～14.07，DEX 與OVA 兩組均數(shù)之差為13.81，其95% CI 為9.3～18.31，兩組治療組間差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 小鼠肺組織病理染色及分析Fig.3 Histopathology changes of lungs in each group

2.4 THC 抑制小鼠肺部Th2和Th17細胞

通過流式細胞術檢測小鼠肺組織中Th 細胞亞型的百分比，評估肺部免疫反應類型和程度。發(fā)現(xiàn)OVA 組小鼠肺組織中Th2（CD3+CD4+IL-4+）和Th17（CD3+CD4+IL-17A+）型T細胞百分比與正常對照組相比顯著升高。THC 和DEX 治療均可有效抑制Th2 和Th17 細胞的過度分化，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖4A、B），其中THC 與OVA 兩組均數(shù)之差分別為1.49 和2.15，其95%CI 分別為0.50～2.49和0.72～3.58，DEX 與OVA 兩組均數(shù)之差分 別為2.64 和2.98，其95% CI 分 別為1.65～3.64 和1.56～4.41。進一步比較發(fā)現(xiàn)DEX 治療組小鼠肺部Th2細胞百分比低于THC 治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖4A、B），兩組均數(shù)之差分別為-1.15，其95%CI 分別為-2.15～-0.16。Th1 和Treg 細胞百分比在各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖4C、D）。

2.5 THC 降低BALF中Th2和Th17細胞因子水平

使用ELISA 試劑盒檢測BALF 中Th2（IL-4、IL-5 和IL-13）和Th17（IL-17A）促炎性細胞因子水平。與正常對照組相比，模型組小鼠IL-4，IL-5、IL-13 和Th17 IL-17A 細胞因子水平顯著升高，經(jīng)THC 或DEX 治療后，IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A 的水平均明顯降低（P＜0.05，圖5A-D），THC 和OVA兩組均數(shù)之差分別為5.45、4.13、5.17 和2.44，其95%CI 分別為1.95～8.94、1.08～7.19、0.80～9.54 和-0.30～5.17，DEX 和OVA 兩組均數(shù)之差分別為9.14、8.76、6.13 和3.74，其95%CI 分別為5.65～12.63、5.71～11.81、1.76～10.5 和1.01～6.48。進一步比較發(fā)現(xiàn)DEX 治療組小鼠IL-4 和IL-5 的水平比THC 治療組更低（P＜0.05；圖5A、B），兩組均數(shù)之差分別為-3.69 和-4.63，其95%CI 分別為-7.18～-0.20、-7.68～-1.57，而對于IL-13 和IL-17A 的抑制效果，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖5C、D）。Th1（IFN-γ）和Treg（IL-10）細胞因子水平各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖5E、F）。

3 討論

圖4 小鼠肺組織T淋巴細胞亞型Fig.4 Subsets of T lymphocytes in lungs of mice

過敏性哮喘患者中Th2 細胞介導的炎癥反應類型最為常見［1，26］，主要表現(xiàn)為嗜酸性粒細胞大量浸潤、杯狀細胞增生以及多種促炎因子（IL-4，IL-5等）的釋放，從而造成炎癥反應加劇、氣道狹窄和炎性損傷。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)Th17 細胞具有較高的可塑性和適應性，其中一部分可以轉(zhuǎn)化為Th2 型細胞［27］。THC作為姜黃素的主要代謝產(chǎn)物，具有類似姜黃素的生物學功效和更高的生物利用度，對多種急慢性疾病均可發(fā)揮保護性作用，如癌癥、神經(jīng)退行性改、心血管疾病和急性腎損傷等［28］。動物研究發(fā)現(xiàn)THC 可以通過抑制TAK1-NF-Kb、IL?4Rα?Jak1?STAT6 和Jagged1/Jagged2?Notch1/Notch2 等信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，從而抑制Th 細胞過度分化以及減少促炎因子的釋放［22，24］。本研究的結(jié)果表明THC 和DEX 均可有效緩解過敏性氣道炎癥小鼠的呼吸道癥狀（降低撓鼻頻率、減輕氣道狹窄和粘液過度分泌）以及抑制炎癥反應（減少Th2和Th17 細胞數(shù)量及其細胞因子水平）。對于炎性細胞浸潤、氣管壁增厚、粘液分泌以及Th17 細胞和IL-13、IL-17A 等指標的作用效果，THC 與DEX 具有可比性，說明THC 具有作為防治過敏性氣道炎癥替代性治療手段的潛在價值。

圖5 小鼠肺泡灌洗液中細胞因子水平分析Fig.5 Levels of cytokines in BALF from mice

目前尚缺乏治愈過敏性哮喘等氣道炎癥的有效手段，如果沒能及時有效地控制病情或緩解癥狀，甚至可能威脅患者的生命安全［2］。前期研究已經(jīng)證實：給予小鼠長期（26 d）膳食添加THC 可以有效減輕Th2 型炎癥反應以及緩解過敏性哮喘呼吸道癥狀［24］，說明THC 作為營養(yǎng)補充劑能夠調(diào)節(jié)免疫功能，起到良好防治過敏性哮喘的作用。為了進一步探索THC 在過敏性哮喘發(fā)作期的短效治療效應，本研究采用腹腔注射的方式以保證更快的吸收和利用［28］。實驗結(jié)果表明：相較于為期26 d THC膳食添加的干預方法，連續(xù)5 d THC 腹腔注射治療大大縮短了干預時間，且同樣可以顯著減少Th2 細胞及相應細胞因子水平，從而減輕過敏性哮喘小鼠呼吸道癥狀和抑制炎癥反應。主要是因為小鼠腹腔部位含有大量血管和淋巴管道，可以充分、迅速得吸收營養(yǎng)物質(zhì)而無需經(jīng)過腸道消化過程，因此在短時間內(nèi)即可將這些物質(zhì)運輸?shù)桨衅鞴侔l(fā)揮治療作用。這些研究結(jié)果為THC 作為哮喘發(fā)作時的候選急救藥物提供了數(shù)據(jù)支持，值得更深入地開發(fā)和更廣泛地利用。

臨床一線藥物糖皮質(zhì)激素可以有效控制病情，降低住院率，部分研究認為系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素的治療效果優(yōu)于吸入性治療［3］。然而考慮到長期使用帶來的副作用以及對于激素不敏感或難治性哮喘患者的治療效果不佳，合理劑量的選擇仍尚未有定論［29-31］：在動物實驗或人體試驗研究當中，激素用量范圍非常廣（0.5～80 mg/kg）［3，29］，本研究選擇了相對較低以及使用較多的劑量（即2.5 mg/kg）用于該動物實驗。而關于THC 劑量的選擇，本研究參考了以往動物實驗中的報道：發(fā)現(xiàn)THC 在20～25 mg/kg 劑量時可以發(fā)揮較高的保護作用［32-33］，且在400 mg/（kg·d）的劑量下也未出現(xiàn)生殖、發(fā)育等毒性［34］，同時結(jié)合本課題組已有關于膳食補充0.08%THC 防治過敏性哮喘的研究結(jié)果，經(jīng)換算后采用20 mg/（kg·d）的干預劑量。

綜上所述，我們的研究證實了腹腔注射THC可以在較短時間內(nèi)有效緩解呼吸道癥狀和減輕氣道炎癥反應，主要是通過抑制Th2、Th17 細胞及其細胞因子以及減少嗜酸性粒細胞等炎性細胞的浸潤。另外，THC 的治療效果與DEX 具有可比性，且其安全性更高，因此THC 作為防治過敏性哮喘的替代性急救藥物值得進一步的臨床試驗和推廣。