程 龍，邱伊波，許琳婉，劉智敏

（重慶醫(yī)科大學(xué)1.分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶 400016；2.附屬第二醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，重慶 400010）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的組織學(xué)類型，約占甲癌總數(shù)的80%，近年來PTC 的發(fā)病率呈上升趨勢。從青春期到絕經(jīng)期PTC 在女性中的發(fā)病率是男性的3 倍，女性絕經(jīng)后PTC 發(fā)病率逐漸下降，且用雌激素替代治療的女性更易患PTC［1-2］。這些數(shù)據(jù)表明雌激素（17β-Estradiol，E2）在PTC 的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［3］。E2 對(duì)靶細(xì)胞的作用主要是通過雌激素受體ERα 和ERβ 介導(dǎo)的，ERα 和ERβ 在AF-1 和AF-2 功能結(jié)構(gòu)與僅有28%和58%的同源性［4］。結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其功能的不同。在雌激素相關(guān)腫瘤中，ERα 促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展，而ERβ 抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，ERα/ERβ 蛋白比率上調(diào)大于1，易導(dǎo)致雌激素反應(yīng)器官腫瘤發(fā)生［5-7］。Pescadillo（PES1）是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)的斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷中發(fā)現(xiàn)的，它是一種進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)，含有BRCT 結(jié)構(gòu)域（BRCA1 C-terminal-domain），在DNA 復(fù)制和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞增生、惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［8-10］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)PES1 與乳腺癌和卵巢癌等雌激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-12］，但有關(guān)PES1 在PTC中的研究國內(nèi)外均尚無報(bào)道。本研究將通過免疫組化法檢測PES1、ERα 和ERβ 在正常甲狀腺組織以及PTC 組織中的表達(dá)情況，用Western blot法分別 檢測Nthy-ori3-1、BCPAP 和K1 中PES1、ERα 和ERβ 的表達(dá)情況，以及PES1 過表達(dá)和PES1 下調(diào)時(shí)對(duì)ERα/ERβ 蛋白表達(dá)比率的影響，最后通過MTT 和Transwell 小室法檢測PES1、ERα和ERβ 蛋白表達(dá)水平對(duì)PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院三腺外科經(jīng)病理診斷為PTC 的組織標(biāo)本200 例作為實(shí)驗(yàn)組，以及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本200 例作為對(duì)照組，研究方案得到重慶醫(yī)學(xué)大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均獲得知情同意。本實(shí)驗(yàn)所用正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1，與人PTC 細(xì)胞系BCPAP 均由香港中文大學(xué)George G.Chen 教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)SP 法試劑盒，DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）；無酚紅RPMI1640 培養(yǎng)液、RPMI 1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS；美國Gibco 公司）；胰蛋白酶、RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 配膠試劑盒、免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑ECL（碧云天公司）；預(yù)染蛋白Marker（美國BIORAD 公司）；羊抗人PES1 抗體（美國Gene Tex 公司）；兔抗人ERα抗體、兔抗人ERβ抗體、兔抗人βactin 抗體、兔抗羊二抗、鼠抗兔二抗（Bioworld 公司）；17β-雌二醇、PPT、DPN、MTT 試劑盒、DMSO（Sigma 公司）；Matrigel 基質(zhì)膠（美國BD Biosciences公司）；Lipofectamine RNAiMAX（美國Invitrogen 公司）；pcDNA3.1 表達(dá)載體（Invitrogen）；PES1-siR?NA、PES1-overexpression vector、Scrambled siRNA、Empty vector序列（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)法

用免疫組織化學(xué)染色法，即鏈霉親和素-過氧化物酶（sreptavidin-perosidase，SP）測定PES1、ERα和ERβ 的表達(dá)情況。主要步驟為：①將組織標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片；②組織切片用二甲苯脫蠟；③枸櫞酸鈉鹽95 ℃抗原修復(fù)；④3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；⑤滴加一抗（1∶100 稀釋羊抗人PES1 抗體；1∶100 稀釋兔抗人ERα 抗體、1∶100 兔抗人ERβ 抗體）4 ℃過夜；⑥滴加生物素二抗（羊抗兔/兔抗羊）；⑦加入HRP 標(biāo)記親和素（試劑三）37 ℃，30 min；⑧DAB 顯色。用PBS 替代一抗，作為陰性對(duì)照。

1.4 判斷指標(biāo)

半定量免疫組化（IHC）評(píng)分由兩名觀察員在雙盲條件下判定結(jié)果。IHC 評(píng)分基于染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比。強(qiáng)度為0（無染色）、1（弱染色）、2（中度染色）3（強(qiáng)染色）；百分比為0（＜5%陽性細(xì)胞）、1（6%～25%陽性細(xì)胞）、2（26%～50%）陽性細(xì)胞、3（51%～75%陽性細(xì)胞）、4（＞75%陽性細(xì)胞）。強(qiáng)度和百分比的分?jǐn)?shù)乘積為最終的IHC 評(píng)分：0（陰性）、+（1-4）、++（5-8）、+++（9-12）。為便于統(tǒng)計(jì)分析：0（陰性）和+（1-4）為陰性低表達(dá)組；++（5-8）和+++（9-12）為陽性高表達(dá)組。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 以及PTC 細(xì)胞株BCPAP 培養(yǎng)于含10% FBS、100μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行換液、傳代，對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染和過表達(dá)

根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX 使用說明書對(duì)Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA模版如下：PES1-siRNA：5'-CCGGCCAGAAGATC?ATGTTTGGCAACTCGAGTTGCCAAACATGATCTT?CTGGTTTTTG-3'；Scrambled-siRNA：5'-CCTAAG?GTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTA?ACCTTAGG-3'。根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX 的制造商使用說明將siRNA 轉(zhuǎn)染到Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞中。將與PES1 開放閱讀框序列對(duì)應(yīng)的PCR 擴(kuò)增片段插入pcDNA3.1 表達(dá)載體，根據(jù)說明書用Lipofectamine 2000 將該表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白等進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⑻幚砗蟮募?xì)胞進(jìn)行分組，收集并裂解Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。將30 μg 的細(xì)胞總蛋白上樣后進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，接著電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，再用5%的脫脂奶粉封閉1 h，PBST 洗膜，加入相應(yīng)稀釋后的的一抗，4 ℃過夜。PBST 漂洗3 次，每次5 min，加二抗，37 ℃孵育1.5 h，PBST 洗膜后用ECL 發(fā)光劑顯色，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目的條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 MTT法檢測細(xì)胞增殖

用MTT 法檢測Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞的體外增殖能力。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種在96 孔板中，密度為3 000 個(gè)/孔。接著培養(yǎng)于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育箱中，孵育24 h。細(xì)胞貼壁后分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)基除去，每孔加入150 μL DMSO，充分溶解。用ELISA 平板讀數(shù)儀在570 nm 處測定光密度值，導(dǎo)出結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Transwell 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

使 用Transwell 評(píng) 價(jià)Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力。將細(xì)胞饑餓處理24 h，將細(xì)胞消化、離心、棄去原培養(yǎng)液，再加入無酚紅和無血清培養(yǎng)基重新懸浮制成細(xì)胞懸液。取200 μL靜止細(xì)胞懸液置于Transwell 小室內(nèi)室中，外室中填充無酚紅和血清的培養(yǎng)基，補(bǔ)充E2、PPT 或DPN 72 h。對(duì)于侵襲試驗(yàn)，將Matrigel按1∶8的比例稀釋后預(yù)涂覆于Transwell 小室基底膜的內(nèi)室面上。最后再加入MTT 處理4 h，用棉棒拭去上室底部膜表面殘留的細(xì)胞。將含有殘余細(xì)胞的棉棒和外室中遷移或侵入細(xì)胞置于含有400 μL DMSO 的24 孔板中。輕輕搖動(dòng)1 h 后，取100 μL 樣品，用ELISA 平板讀數(shù)儀測量570 nm 處的吸光度。遷移或侵入細(xì)胞的百分比計(jì)算方法為：遷移或侵入細(xì)胞的百分比＝A/（A+B）×100，其中A 代表遷移或侵入細(xì)胞的吸收率，B表示剩余細(xì)胞的吸收率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊的多組間均數(shù)差異用One way-ANOVA 進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組均數(shù)比較時(shí)用Dunnett-t檢驗(yàn)，多組間相互比較時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。組織標(biāo)本分析采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PES1、ERα 和ERβ 在正常甲狀腺組織以及PTC組織中的表達(dá)情況

免疫組化法分析200 例PTC 組織以及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織發(fā)現(xiàn)：在正常甲狀腺組織中，PES1 幾乎沒有濾泡細(xì)胞染色（圖1A），ERα有少量濾泡細(xì)胞弱染色（圖1B），ERβ有大量濾泡的強(qiáng)染色（圖1C）；在惡性程度低的PTC 組織中，PES1（圖1D）、ERα（圖1E）、ERβ（圖1F）有部分腫瘤細(xì)胞中等程度的染色；在惡性程度高的PTC 組織中，PES1（圖1G）和ERα（H）有大量腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)染色，ERβ（圖1I）有少量腫瘤細(xì)胞的弱染色。PES1、ERα和ERβ在PTC中的陽性表達(dá)例數(shù)分別為104（52%）、103（51.5%）和30（15%），在對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的陽性表達(dá)例數(shù)分別為0（0%）、19（9.5%），112（56%）。PES1和ERα 蛋白在PTC 組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（P＜0.001），而ERβ 蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（P＜0.001；圖1，表1）。

圖1 PES1、ERα和ERβ在正常甲狀腺組織和PTC組織中的表達(dá)Fig.1 The expressions of PES1，ERα and ERβ in normal thyroid tissue and papillary thyroid carcinoma tissue

2.2 PES1、ERα 和ERβ 蛋白表達(dá)水平與PTC 患者腫瘤惡性程度及預(yù)后的相關(guān)性

用卡方檢驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)PES1、ERα 和ERβ 蛋白水平與PTC 患者臨床病理特征的相關(guān)性。如表1所示，PTC 患者的PES1、ERα 和ERβ 蛋白水平與組織學(xué)亞型（P=0.165、P=0.286、P=0.222）、年齡（P=0.280、P=0.143、P=0.144）、性別（P=0.187、P=0.115、P=0.145）無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)，然而與腫瘤大?。≒=0.005、P=0.003、P=0.007）、ETE（P=0.002、P=0.001、P=0.003）、LNM（P=0.004、P=0.006、P=0.003）、BRAFV600E 突變（P=0.008、P=0.002、P=0.004）和TNM分期（P=0.002、P=0.001、P=0.002）有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)。腫瘤惡性程度越高、有BRAFV600E 突變，即預(yù)后越差的PTC 患者PES1、ERα 蛋白表達(dá)水平較高，ERβ 蛋白表達(dá)水平較低。

表1 PES1、ERα和ERβ 在200例PTC患者中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlations of PES1，ERα and ERβ protein levels with clinicopathological characteristics in 200 PTC patients （n）

2.3 PES1、ERα 和ERβ 在正常甲狀腺細(xì)胞Nthyori3-1以及PTC細(xì)胞BCPAP和K1中的表達(dá)情況

提取正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 以及PTC 細(xì)胞BCPAP 和K1 中的細(xì)胞總蛋白，Western blot 方法檢測PES1、ERα 及ERβ 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：經(jīng)方差分析3 組之間有顯著差異PES1（F=262.170，P＜0.001）、ERα（F=129.870，P＜0.001）、ERβ（F=166.257，P＜0.001），進(jìn)一步用Dunnett-t檢驗(yàn)對(duì)PTC細(xì)胞與正常甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行相互比較，較正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1，PTC 細(xì)胞株BCPAP 中PES1（P＜0.001）和ERα（P＜0.001）蛋白表達(dá)水平顯著增高，而ERβ 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），K1 中PES1（P＜0.001）和ERα（P＜0.001）蛋白表達(dá)水平顯著增高，而ERβ蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）。為了定量測定Nthy-ori3-1、BCPAP 和K-1細(xì)胞中的ERα/ERβ 蛋白比率，分別測定這3 種細(xì)胞中ERα 和ERβ 的蛋白濃度，在正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 中，ERα 蛋白表達(dá)水平顯著低于ERβ蛋白表達(dá)水平（t=14.440，P＜0.001），ERα 和ERβ蛋白濃度分別為10.13 fmol/30 μg 和23.56 fmol/30 μg，ERα/ERβ 蛋白比率小于1（≈0.43）；在PTC 細(xì)胞BCPAP（t=13.432，P＜0.001）和K1（t=16.475，P＜0.001）中，ERα 蛋白表達(dá)水平顯著高于ERβ 蛋白表達(dá)水平，BCPAP 細(xì)胞中的ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為28.96 fmol/30 μg和12.87 fmol/30 μg，K-1細(xì)胞中的ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為34.37 fmol/30 μg 和12.19 fmol/30 μg，ERα/ERβ 蛋白比率大于1（≈2.25，≈2.82）。在3組甲狀腺細(xì)胞中，PES1蛋白表達(dá)水平與ERα/ERβ蛋白比率呈正相關(guān)（圖2）。

2.4 Nthy-ori3-1 細(xì)胞中PES1 過表達(dá)對(duì)ERα 和ERβ蛋白表達(dá)比率的影響

分別用Empty vector 和PES1 Overexpression vector 轉(zhuǎn)染Nthy-ori3-1 細(xì)胞，用Western blot 方法檢測ERα 和ERβ 的表達(dá)情況，Veh 為空白對(duì)照組，Empty vector 為陰性對(duì)照組，PES1 Overexpression vector為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示：經(jīng)方差分析3組之間有顯著差異PES1（F=208.227，P＜0.001）、ERα（F=359.995，P＜0.001）、ERβ（F=72.189，P＜0.001），進(jìn)一步用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較，實(shí)驗(yàn)組中PES1和ERα 蛋白表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的空白對(duì)照組（P＜0.001）和陰性對(duì)照組（P＜0.00），而ERβ蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.001）和陰性對(duì)照組（P＜0.001），PES1過表達(dá)使Nthy-ori3-1細(xì)胞中ERα 表達(dá)增高，ERβ 表達(dá)降低，ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為35.26 fmol/30 μg和13.88 fmol/30 μg，ERα/ERβ 蛋白比率（≈2.54）明顯增大?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.339，P=0.237，P=0.253，圖3）。

2.5 BCPAP 細(xì)胞中PES1 下調(diào)對(duì)ERα 和ERβ 蛋白表達(dá)比率的影響

分別用scrambled-siRNA 和PES1-siRNA 轉(zhuǎn)染BCPAP 細(xì)胞，用Western blot 方法檢測ERα 和ERβ的表達(dá)情況，Veh 為空白對(duì)照組，scrambled-siRNA為陰性對(duì)照組，PES1-siRNA 為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示：經(jīng)方差分析3組之間有顯著差異PES1（F=121.433，P＜0.001）、ERα（F=110.885，P＜0.001）、ERβ（F=88.100，P＜0.001），進(jìn)一步用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較，實(shí)驗(yàn)組中PES1 和ERα 蛋白表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的空白對(duì)照組（P＜0.001）和陰性對(duì)照組（P＜0.05），而ERβ 蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.001）和陰性對(duì)照組（P＜0.001），PES1 下調(diào)使BCPAP 細(xì)胞中ERα 表達(dá)降低，ERβ 表達(dá)增高，ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為11.73 fmol/30 μg 和28.61 fmol/30 μg，ERα/ERβ 蛋白比率（≈0.41）明顯降低?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.742，P=1.000，P=0.883，圖4）。

圖2 在PTC細(xì)胞BCPAP、K-1和正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1中PES1、ERα和ERβ的蛋白表達(dá)水平Fig.2 PES1，ERα and ERβ protein levels in human PTC-derived BCPAP and K1 cells and normal thyroid-derived Nthyori3-1 cells

圖3 在正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1中PES1過表達(dá)時(shí)ERα蛋白表達(dá)增高，ERβ的蛋白表達(dá)降低Fig.3 In normal thyroid cells，the over-expression of PES1 elevated the ERα protein level and simultaneously reduced the ERβ protein level

圖4 在BCPAP細(xì)胞中PES1過下調(diào)時(shí)ERα蛋白表達(dá)降低，ERβ的蛋白表達(dá)增高Fig.4 In BCPAP cells，the down-regulation of PES1 reduced the ERα protein level and simultaneously elevated the ERβ protein level

2.6 PES1、ERα 和ERβ 對(duì)PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

實(shí)驗(yàn)共設(shè)8 組，分別為Veh 組、E2 組、PPT 組（ERα 激動(dòng)劑）、DPN（ERβ 激動(dòng)劑）組、E2+scram?bled-siRNA 組、E2+Empty vector 組、E2+PES1-siR?NA 組、E2+PES1 Overexpression 組，E2 濃度均為10-8mol/L，處理24 h。MTT 法檢測細(xì)胞的增殖能力，Transwell 小室法檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力，結(jié)果顯示：經(jīng)方差分析Veh組、E2組、PPT組和DPN組間差有顯著差異Nthy-ori3-1（F增殖=38.131，P＜0.001）、（F侵襲=29.524，P＜0.001）、（F遷移=45.105，P＜0.001）；BCPAP（F增殖=151.372，P＜0.001），（F侵襲=93.971，P＜0.001）、（F遷移=140.437，P＜0.001）。進(jìn)一步用Dunnett-t檢驗(yàn)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組與Veh 組進(jìn)行相互比較，與Veh 組相比，PPT 組Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖（P=0.002，P＜0.001）、侵襲（P=0.003，P＜0.001）和遷移（P＜0.001，P＜0.001）能力顯著增強(qiáng)；DPN 組Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖（P=0.002，P=0.013）、侵襲（P=0.008，P=0.046）和遷移（P=0.018，P=0.031）能力顯著減弱；E2 組Nthy-ori3-1細(xì)胞增殖（P=0.890）、侵襲（P=0.124）和遷移（P=0.197）能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而BCPAP 細(xì)胞增殖（P＜0.001）、侵襲（P＜0.001）和遷移（P＜0.001）能力顯著增強(qiáng)。經(jīng)方差分析E2 組、E2+scrambled-siRNA 組、E2+Empty vector 組、E2+PES1-siRNA 組 和E2+PES1 Overexpression 組間差有顯著差異Nthy-ori3-1（F增殖=36.888，P＜0.001）、（F侵襲=25.275，P＜0.001）、（F遷移=119.250，P＜0.001）；BCPAP（F增殖=53.983，P＜0.001），（F侵襲=44.582，P＜0.001）、（F遷移=64.361，P＜0.001）。進(jìn)一步用Dunnett-t檢驗(yàn)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組與E2 組進(jìn)行相互比較，與E2 組相比，E2+scrambled-siRNA 組Nthy-ori3-1和BCPAP細(xì)胞增殖（P=1.000，P=0.999）、侵襲（P=0.926，P=0.989）和遷移（P=1.000，P=0.986）能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E2+Empty vector 組Nthy-ori3-1和BCPAP 細(xì)胞增殖（P=0.998，P=1.000）、侵襲（P=0.576，P=0.888）和遷移（P=0.873，P=0.867）能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E2+PES1-siRNA 組Nthyori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖（P=0.003，P＜0.001）、侵襲（P＜0.038，P＜0.001）和遷移（P=0.014，P＜0.001）能力顯著減弱；E2+PES1 Overexpression 組Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖（P＜0.001，P＜0.001）、侵襲（P＜0.001，P＜0.001）和遷移（P＜0.001，P＜0.001）能力顯著增強(qiáng)（圖5）。

3 討論

越來越多的研究表明，E2 可能參與PTC 的發(fā)生、發(fā)展［1-3］，E2對(duì)靶細(xì)胞的作用主要是通過雌激素受體ERα 和ERβ 介導(dǎo)的［4］，ERα 和ERβ 常共表達(dá)并參與雌激素的生理和病理反應(yīng)［13］。在本研究中，我們用免疫組化和Western Blot的方法檢測ERα和ERβ 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)ERα 和ERβ 在人PTC 組織和細(xì)胞中均共表達(dá)，且與正常甲狀腺組織和細(xì)胞相比，PTC 組織和細(xì)胞中ERα 蛋白表達(dá)上調(diào)，ERβ 蛋白表達(dá)下調(diào)。這一結(jié)果與曾報(bào)道的研究結(jié)果相一致，即ERα 和ERβ 在正常甲狀腺組織和腫瘤組織中共同表達(dá)，與正常甲狀腺組織相比，在PTC 組織中ERα的水平相對(duì)高于ERβ［14］。

雖然ERα 和ERβ 在結(jié)構(gòu)上類似，都包括N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD）、DNA 結(jié)合域（DBD）和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）的3 個(gè)功能域，但它們?cè)贜TD 和LBD 的結(jié)構(gòu)上存在著明顯的差異，它們的結(jié)構(gòu)差異表明ERα 和ERβ 可能具有不同的功能，乳腺癌MDA-231 細(xì)胞系和子宮內(nèi)膜癌HEC-1 細(xì)胞系細(xì)胞分析顯示ERβ 的活性一般低于ERα，且可能會(huì)影響ERα 的活性［5］。盡管有極少數(shù)報(bào)道顯示：在ERα 陰性的腫瘤組織和細(xì)胞中ERβ 對(duì)腫瘤有促增值作用。但大量的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)支持ERβ 作為一種抗增殖和促凋亡因子，特別是與ERβ 與ERα 共表達(dá)時(shí)［15］。大多數(shù)研究表明：ERα 促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，具有促腫瘤作用，而ERβ 與ERα 共表達(dá)時(shí)，可能對(duì)ERα 介導(dǎo)的促腫瘤作用起抑制作用［16］。與過去的報(bào)道結(jié)果相一致，在本研究中我們通過對(duì)PTC 組織的免疫組化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：ERα 蛋白水平與PTC患者的惡性侵襲性行為呈正相關(guān)，ERβ蛋白水平與PTC 患者的惡性侵襲性行為呈負(fù)相關(guān)。腫瘤體積大、有ETE 和LNM、高BRAFV600E 表達(dá)、高TNM 分期（III-IV）的PTC 患者有高ERα、低ERβ 蛋白表達(dá)。

圖5 PES1促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞和正常甲狀腺細(xì)胞增殖、侵襲和遷移Fig.5 PES1 promoted the proliferation，invasion and migration of human PTC-derived BCPAP cells and normal thyroidderived Nthy-ori3-1 cells

ERα 和ERβ 蛋白水平之間的平衡和比率對(duì)于確定其對(duì)雌激素相關(guān)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的總體反應(yīng)至關(guān)重要。有報(bào)道顯示：ERα/ERβ 的比值可以作為判定PTC 患者和子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后和生存率的指標(biāo)，即ERα/ERβ 比值較高時(shí)PTC 患者以及子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤惡性程度高、預(yù)后差［14，17］。在乳腺癌中，當(dāng)ERα/ERβ＞1 促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖；當(dāng)ERα/ERβ＜1 時(shí)抑制癌細(xì)胞增殖［7，18］。與這些研究結(jié)果一致，本研究中在細(xì)胞水平我們發(fā)現(xiàn)：在正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 中ERα/ERβ 蛋白比率顯著小于1（≈0.43），而在BCPAP 和K1 細(xì)胞中ERα/ERβ 蛋白比率顯著大于1（≈2.25，≈2.82）。

PES1是一種含有BRCT結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，參與胚胎發(fā)育、核糖體的生物合成、DNA 復(fù)制、染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞周期進(jìn)程，這些都是決定細(xì)胞增殖的重要組成因素［8-10］。近期有研究發(fā)現(xiàn)：在卵巢癌和乳腺癌這些雌激素相關(guān)腫瘤中，PES1 能使ERα/ERβ蛋白比率顯著增高，促進(jìn)乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展［11-12］。然而PES1 在PTC 中的研究國內(nèi)外均尚無報(bào)道，且由于有報(bào)道顯示ERs的作用具有組織特異性［19］，因此在本研究中，我們檢測了PTC 組織和細(xì)胞中的PES1 蛋白水平，并評(píng)估其蛋白水平與ERα 和ERβ 蛋白水平以及PTC 的發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。結(jié)果表明：PES1升高ERα蛋白水平，同時(shí)降低ERβ 蛋白水平，導(dǎo)致ERα/ERβ 蛋白比值升高，進(jìn)而促進(jìn)人PTC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。MTT和Transwell 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：PES1 下調(diào)使癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯減弱，PES1 過表達(dá)使癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)，這與之前的報(bào)道結(jié)果相一致。

PES1蛋白表達(dá)水平與ERα/ERβ蛋白比率呈正相關(guān)；PES1 過表達(dá)使Nthy-ori3-1 細(xì)胞中ERα/ERβ蛋白比率明顯增大（≈2.54）；PES1 下調(diào)使BCPAP 細(xì)胞中ERα/ERβ 蛋白比率明顯降低（≈0.41）；PES1 下調(diào)使PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯減弱，PES1 過表達(dá)使PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)。

綜上所述，PTC 患者的PES1 和ERα 蛋白水平較高，ERβ 水平較低，高PES1、高ERα 蛋白表達(dá)水平和低ERβ 蛋白表達(dá)水平與PTC 惡性侵襲性行為相關(guān)。PES1 增加ERα 蛋白水平，降低ERβ 蛋白水平，增加ERα/ERβ 蛋白比率，促進(jìn)PTC 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。PES1 對(duì)PTC 的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用，PES1 可能成為PTC 治療和預(yù)后的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，為PTC 的早期發(fā)現(xiàn)、臨床治療以及預(yù)后評(píng)估提供新思路。