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PES1上調(diào)ERα/ERβ蛋白比率促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移

2020-08-17 05:11:40邱伊波許琳婉劉智敏
關(guān)鍵詞:比率陰性蛋白

程 龍,邱伊波,許琳婉,劉智敏

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心,重慶 400016;2.附屬第二醫(yī)院乳腺甲狀腺外科,重慶 400010)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺癌中最常見的組織學(xué)類型,約占甲癌總數(shù)的80%,近年來PTC 的發(fā)病率呈上升趨勢。從青春期到絕經(jīng)期PTC 在女性中的發(fā)病率是男性的3 倍,女性絕經(jīng)后PTC 發(fā)病率逐漸下降,且用雌激素替代治療的女性更易患PTC[1-2]。這些數(shù)據(jù)表明雌激素(17β-Estradiol,E2)在PTC 的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[3]。E2 對(duì)靶細(xì)胞的作用主要是通過雌激素受體ERα 和ERβ 介導(dǎo)的,ERα 和ERβ 在AF-1 和AF-2 功能結(jié)構(gòu)與僅有28%和58%的同源性[4]。結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其功能的不同。在雌激素相關(guān)腫瘤中,ERα 促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展,而ERβ 抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,ERα/ERβ 蛋白比率上調(diào)大于1,易導(dǎo)致雌激素反應(yīng)器官腫瘤發(fā)生[5-7]。Pescadillo(PES1)是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)的斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷中發(fā)現(xiàn)的,它是一種進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì),含有BRCT 結(jié)構(gòu)域(BRCA1 C-terminal-domain),在DNA 復(fù)制和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用,與細(xì)胞增生、惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8-10]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)PES1 與乳腺癌和卵巢癌等雌激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12],但有關(guān)PES1 在PTC中的研究國內(nèi)外均尚無報(bào)道。本研究將通過免疫組化法檢測PES1、ERα 和ERβ 在正常甲狀腺組織以及PTC 組織中的表達(dá)情況,用Western blot法分別 檢測Nthy-ori3-1、BCPAP 和K1 中PES1、ERα 和ERβ 的表達(dá)情況,以及PES1 過表達(dá)和PES1 下調(diào)時(shí)對(duì)ERα/ERβ 蛋白表達(dá)比率的影響,最后通過MTT 和Transwell 小室法檢測PES1、ERα和ERβ 蛋白表達(dá)水平對(duì)PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院三腺外科經(jīng)病理診斷為PTC 的組織標(biāo)本200 例作為實(shí)驗(yàn)組,以及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本200 例作為對(duì)照組,研究方案得到重慶醫(yī)學(xué)大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有患者均獲得知情同意。本實(shí)驗(yàn)所用正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1,與人PTC 細(xì)胞系BCPAP 均由香港中文大學(xué)George G.Chen 教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)SP 法試劑盒,DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋公司);無酚紅RPMI1640 培養(yǎng)液、RPMI 1640 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS;美國Gibco 公司);胰蛋白酶、RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 配膠試劑盒、免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑ECL(碧云天公司);預(yù)染蛋白Marker(美國BIORAD 公司);羊抗人PES1 抗體(美國Gene Tex 公司);兔抗人ERα抗體、兔抗人ERβ抗體、兔抗人βactin 抗體、兔抗羊二抗、鼠抗兔二抗(Bioworld 公司);17β-雌二醇、PPT、DPN、MTT 試劑盒、DMSO(Sigma 公司);Matrigel 基質(zhì)膠(美國BD Biosciences公司);Lipofectamine RNAiMAX(美國Invitrogen 公司);pcDNA3.1 表達(dá)載體(Invitrogen);PES1-siR?NA、PES1-overexpression vector、Scrambled siRNA、Empty vector序列(上海生工生物工程有限公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)法

用免疫組織化學(xué)染色法,即鏈霉親和素-過氧化物酶(sreptavidin-perosidase,SP)測定PES1、ERα和ERβ 的表達(dá)情況。主要步驟為:①將組織標(biāo)本用10%甲醛固定,石蠟包埋,4 μm 連續(xù)切片;②組織切片用二甲苯脫蠟;③枸櫞酸鈉鹽95 ℃抗原修復(fù);④3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;⑤滴加一抗(1∶100 稀釋羊抗人PES1 抗體;1∶100 稀釋兔抗人ERα 抗體、1∶100 兔抗人ERβ 抗體)4 ℃過夜;⑥滴加生物素二抗(羊抗兔/兔抗羊);⑦加入HRP 標(biāo)記親和素(試劑三)37 ℃,30 min;⑧DAB 顯色。用PBS 替代一抗,作為陰性對(duì)照。

1.4 判斷指標(biāo)

半定量免疫組化(IHC)評(píng)分由兩名觀察員在雙盲條件下判定結(jié)果。IHC 評(píng)分基于染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比。強(qiáng)度為0(無染色)、1(弱染色)、2(中度染色)3(強(qiáng)染色);百分比為0(<5%陽性細(xì)胞)、1(6%~25%陽性細(xì)胞)、2(26%~50%)陽性細(xì)胞、3(51%~75%陽性細(xì)胞)、4(>75%陽性細(xì)胞)。強(qiáng)度和百分比的分?jǐn)?shù)乘積為最終的IHC 評(píng)分:0(陰性)、+(1-4)、++(5-8)、+++(9-12)。為便于統(tǒng)計(jì)分析:0(陰性)和+(1-4)為陰性低表達(dá)組;++(5-8)和+++(9-12)為陽性高表達(dá)組。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 以及PTC 細(xì)胞株BCPAP 培養(yǎng)于含10% FBS、100μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長,根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行換液、傳代,對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染和過表達(dá)

根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX 使用說明書對(duì)Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,siRNA模版如下:PES1-siRNA:5'-CCGGCCAGAAGATC?ATGTTTGGCAACTCGAGTTGCCAAACATGATCTT?CTGGTTTTTG-3';Scrambled-siRNA:5'-CCTAAG?GTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTA?ACCTTAGG-3'。根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX 的制造商使用說明將siRNA 轉(zhuǎn)染到Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞中。將與PES1 開放閱讀框序列對(duì)應(yīng)的PCR 擴(kuò)增片段插入pcDNA3.1 表達(dá)載體,根據(jù)說明書用Lipofectamine 2000 將該表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白等進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⑻幚砗蟮募?xì)胞進(jìn)行分組,收集并裂解Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。將30 μg 的細(xì)胞總蛋白上樣后進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,接著電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再用5%的脫脂奶粉封閉1 h,PBST 洗膜,加入相應(yīng)稀釋后的的一抗,4 ℃過夜。PBST 漂洗3 次,每次5 min,加二抗,37 ℃孵育1.5 h,PBST 洗膜后用ECL 發(fā)光劑顯色,Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,分析目的條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 MTT法檢測細(xì)胞增殖

用MTT 法檢測Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞的體外增殖能力。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種在96 孔板中,密度為3 000 個(gè)/孔。接著培養(yǎng)于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育箱中,孵育24 h。細(xì)胞貼壁后分組處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)基除去,每孔加入150 μL DMSO,充分溶解。用ELISA 平板讀數(shù)儀在570 nm 處測定光密度值,導(dǎo)出結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Transwell 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

使 用Transwell 評(píng) 價(jià)Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力。將細(xì)胞饑餓處理24 h,將細(xì)胞消化、離心、棄去原培養(yǎng)液,再加入無酚紅和無血清培養(yǎng)基重新懸浮制成細(xì)胞懸液。取200 μL靜止細(xì)胞懸液置于Transwell 小室內(nèi)室中,外室中填充無酚紅和血清的培養(yǎng)基,補(bǔ)充E2、PPT 或DPN 72 h。對(duì)于侵襲試驗(yàn),將Matrigel按1∶8的比例稀釋后預(yù)涂覆于Transwell 小室基底膜的內(nèi)室面上。最后再加入MTT 處理4 h,用棉棒拭去上室底部膜表面殘留的細(xì)胞。將含有殘余細(xì)胞的棉棒和外室中遷移或侵入細(xì)胞置于含有400 μL DMSO 的24 孔板中。輕輕搖動(dòng)1 h 后,取100 μL 樣品,用ELISA 平板讀數(shù)儀測量570 nm 處的吸光度。遷移或侵入細(xì)胞的百分比計(jì)算方法為:遷移或侵入細(xì)胞的百分比=A/(A+B)×100,其中A 代表遷移或侵入細(xì)胞的吸收率,B表示剩余細(xì)胞的吸收率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊的多組間均數(shù)差異用One way-ANOVA 進(jìn)行分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組均數(shù)比較時(shí)用Dunnett-t檢驗(yàn),多組間相互比較時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。組織標(biāo)本分析采用χ2檢驗(yàn),P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PES1、ERα 和ERβ 在正常甲狀腺組織以及PTC組織中的表達(dá)情況

免疫組化法分析200 例PTC 組織以及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織發(fā)現(xiàn):在正常甲狀腺組織中,PES1 幾乎沒有濾泡細(xì)胞染色(圖1A),ERα有少量濾泡細(xì)胞弱染色(圖1B),ERβ有大量濾泡的強(qiáng)染色(圖1C);在惡性程度低的PTC 組織中,PES1(圖1D)、ERα(圖1E)、ERβ(圖1F)有部分腫瘤細(xì)胞中等程度的染色;在惡性程度高的PTC 組織中,PES1(圖1G)和ERα(H)有大量腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)染色,ERβ(圖1I)有少量腫瘤細(xì)胞的弱染色。PES1、ERα和ERβ在PTC中的陽性表達(dá)例數(shù)分別為104(52%)、103(51.5%)和30(15%),在對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的陽性表達(dá)例數(shù)分別為0(0%)、19(9.5%),112(56%)。PES1和ERα 蛋白在PTC 組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(P<0.001),而ERβ 蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(P<0.001;圖1,表1)。

圖1 PES1、ERα和ERβ在正常甲狀腺組織和PTC組織中的表達(dá)Fig.1 The expressions of PES1,ERα and ERβ in normal thyroid tissue and papillary thyroid carcinoma tissue

2.2 PES1、ERα 和ERβ 蛋白表達(dá)水平與PTC 患者腫瘤惡性程度及預(yù)后的相關(guān)性

用卡方檢驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)PES1、ERα 和ERβ 蛋白水平與PTC 患者臨床病理特征的相關(guān)性。如表1所示,PTC 患者的PES1、ERα 和ERβ 蛋白水平與組織學(xué)亞型(P=0.165、P=0.286、P=0.222)、年齡(P=0.280、P=0.143、P=0.144)、性別(P=0.187、P=0.115、P=0.145)無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān),然而與腫瘤大?。≒=0.005、P=0.003、P=0.007)、ETE(P=0.002、P=0.001、P=0.003)、LNM(P=0.004、P=0.006、P=0.003)、BRAFV600E 突變(P=0.008、P=0.002、P=0.004)和TNM分期(P=0.002、P=0.001、P=0.002)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)。腫瘤惡性程度越高、有BRAFV600E 突變,即預(yù)后越差的PTC 患者PES1、ERα 蛋白表達(dá)水平較高,ERβ 蛋白表達(dá)水平較低。

表1 PES1、ERα和ERβ 在200例PTC患者中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlations of PES1,ERα and ERβ protein levels with clinicopathological characteristics in 200 PTC patients (n)

2.3 PES1、ERα 和ERβ 在正常甲狀腺細(xì)胞Nthyori3-1以及PTC細(xì)胞BCPAP和K1中的表達(dá)情況

提取正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 以及PTC 細(xì)胞BCPAP 和K1 中的細(xì)胞總蛋白,Western blot 方法檢測PES1、ERα 及ERβ 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:經(jīng)方差分析3 組之間有顯著差異PES1(F=262.170,P<0.001)、ERα(F=129.870,P<0.001)、ERβ(F=166.257,P<0.001),進(jìn)一步用Dunnett-t檢驗(yàn)對(duì)PTC細(xì)胞與正常甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行相互比較,較正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1,PTC 細(xì)胞株BCPAP 中PES1(P<0.001)和ERα(P<0.001)蛋白表達(dá)水平顯著增高,而ERβ 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001),K1 中PES1(P<0.001)和ERα(P<0.001)蛋白表達(dá)水平顯著增高,而ERβ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。為了定量測定Nthy-ori3-1、BCPAP 和K-1細(xì)胞中的ERα/ERβ 蛋白比率,分別測定這3 種細(xì)胞中ERα 和ERβ 的蛋白濃度,在正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 中,ERα 蛋白表達(dá)水平顯著低于ERβ蛋白表達(dá)水平(t=14.440,P<0.001),ERα 和ERβ蛋白濃度分別為10.13 fmol/30 μg 和23.56 fmol/30 μg,ERα/ERβ 蛋白比率小于1(≈0.43);在PTC 細(xì)胞BCPAP(t=13.432,P<0.001)和K1(t=16.475,P<0.001)中,ERα 蛋白表達(dá)水平顯著高于ERβ 蛋白表達(dá)水平,BCPAP 細(xì)胞中的ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為28.96 fmol/30 μg和12.87 fmol/30 μg,K-1細(xì)胞中的ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為34.37 fmol/30 μg 和12.19 fmol/30 μg,ERα/ERβ 蛋白比率大于1(≈2.25,≈2.82)。在3組甲狀腺細(xì)胞中,PES1蛋白表達(dá)水平與ERα/ERβ蛋白比率呈正相關(guān)(圖2)。

2.4 Nthy-ori3-1 細(xì)胞中PES1 過表達(dá)對(duì)ERα 和ERβ蛋白表達(dá)比率的影響

分別用Empty vector 和PES1 Overexpression vector 轉(zhuǎn)染Nthy-ori3-1 細(xì)胞,用Western blot 方法檢測ERα 和ERβ 的表達(dá)情況,Veh 為空白對(duì)照組,Empty vector 為陰性對(duì)照組,PES1 Overexpression vector為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示:經(jīng)方差分析3組之間有顯著差異PES1(F=208.227,P<0.001)、ERα(F=359.995,P<0.001)、ERβ(F=72.189,P<0.001),進(jìn)一步用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較,實(shí)驗(yàn)組中PES1和ERα 蛋白表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的空白對(duì)照組(P<0.001)和陰性對(duì)照組(P<0.00),而ERβ蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組(P<0.001)和陰性對(duì)照組(P<0.001),PES1過表達(dá)使Nthy-ori3-1細(xì)胞中ERα 表達(dá)增高,ERβ 表達(dá)降低,ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為35.26 fmol/30 μg和13.88 fmol/30 μg,ERα/ERβ 蛋白比率(≈2.54)明顯增大??瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.339,P=0.237,P=0.253,圖3)。

2.5 BCPAP 細(xì)胞中PES1 下調(diào)對(duì)ERα 和ERβ 蛋白表達(dá)比率的影響

分別用scrambled-siRNA 和PES1-siRNA 轉(zhuǎn)染BCPAP 細(xì)胞,用Western blot 方法檢測ERα 和ERβ的表達(dá)情況,Veh 為空白對(duì)照組,scrambled-siRNA為陰性對(duì)照組,PES1-siRNA 為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示:經(jīng)方差分析3組之間有顯著差異PES1(F=121.433,P<0.001)、ERα(F=110.885,P<0.001)、ERβ(F=88.100,P<0.001),進(jìn)一步用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較,實(shí)驗(yàn)組中PES1 和ERα 蛋白表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的空白對(duì)照組(P<0.001)和陰性對(duì)照組(P<0.05),而ERβ 蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.001)和陰性對(duì)照組(P<0.001),PES1 下調(diào)使BCPAP 細(xì)胞中ERα 表達(dá)降低,ERβ 表達(dá)增高,ERα 和ERβ 蛋白濃度分別為11.73 fmol/30 μg 和28.61 fmol/30 μg,ERα/ERβ 蛋白比率(≈0.41)明顯降低??瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.742,P=1.000,P=0.883,圖4)。

圖2 在PTC細(xì)胞BCPAP、K-1和正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1中PES1、ERα和ERβ的蛋白表達(dá)水平Fig.2 PES1,ERα and ERβ protein levels in human PTC-derived BCPAP and K1 cells and normal thyroid-derived Nthyori3-1 cells

圖3 在正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1中PES1過表達(dá)時(shí)ERα蛋白表達(dá)增高,ERβ的蛋白表達(dá)降低Fig.3 In normal thyroid cells,the over-expression of PES1 elevated the ERα protein level and simultaneously reduced the ERβ protein level

圖4 在BCPAP細(xì)胞中PES1過下調(diào)時(shí)ERα蛋白表達(dá)降低,ERβ的蛋白表達(dá)增高Fig.4 In BCPAP cells,the down-regulation of PES1 reduced the ERα protein level and simultaneously elevated the ERβ protein level

2.6 PES1、ERα 和ERβ 對(duì)PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

實(shí)驗(yàn)共設(shè)8 組,分別為Veh 組、E2 組、PPT 組(ERα 激動(dòng)劑)、DPN(ERβ 激動(dòng)劑)組、E2+scram?bled-siRNA 組、E2+Empty vector 組、E2+PES1-siR?NA 組、E2+PES1 Overexpression 組,E2 濃度均為10-8mol/L,處理24 h。MTT 法檢測細(xì)胞的增殖能力,Transwell 小室法檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力,結(jié)果顯示:經(jīng)方差分析Veh組、E2組、PPT組和DPN組間差有顯著差異Nthy-ori3-1(F增殖=38.131,P<0.001)、(F侵襲=29.524,P<0.001)、(F遷移=45.105,P<0.001);BCPAP(F增殖=151.372,P<0.001),(F侵襲=93.971,P<0.001)、(F遷移=140.437,P<0.001)。進(jìn)一步用Dunnett-t檢驗(yàn)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組與Veh 組進(jìn)行相互比較,與Veh 組相比,PPT 組Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖(P=0.002,P<0.001)、侵襲(P=0.003,P<0.001)和遷移(P<0.001,P<0.001)能力顯著增強(qiáng);DPN 組Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖(P=0.002,P=0.013)、侵襲(P=0.008,P=0.046)和遷移(P=0.018,P=0.031)能力顯著減弱;E2 組Nthy-ori3-1細(xì)胞增殖(P=0.890)、侵襲(P=0.124)和遷移(P=0.197)能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而BCPAP 細(xì)胞增殖(P<0.001)、侵襲(P<0.001)和遷移(P<0.001)能力顯著增強(qiáng)。經(jīng)方差分析E2 組、E2+scrambled-siRNA 組、E2+Empty vector 組、E2+PES1-siRNA 組 和E2+PES1 Overexpression 組間差有顯著差異Nthy-ori3-1(F增殖=36.888,P<0.001)、(F侵襲=25.275,P<0.001)、(F遷移=119.250,P<0.001);BCPAP(F增殖=53.983,P<0.001),(F侵襲=44.582,P<0.001)、(F遷移=64.361,P<0.001)。進(jìn)一步用Dunnett-t檢驗(yàn)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組與E2 組進(jìn)行相互比較,與E2 組相比,E2+scrambled-siRNA 組Nthy-ori3-1和BCPAP細(xì)胞增殖(P=1.000,P=0.999)、侵襲(P=0.926,P=0.989)和遷移(P=1.000,P=0.986)能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2+Empty vector 組Nthy-ori3-1和BCPAP 細(xì)胞增殖(P=0.998,P=1.000)、侵襲(P=0.576,P=0.888)和遷移(P=0.873,P=0.867)能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2+PES1-siRNA 組Nthyori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖(P=0.003,P<0.001)、侵襲(P<0.038,P<0.001)和遷移(P=0.014,P<0.001)能力顯著減弱;E2+PES1 Overexpression 組Nthy-ori3-1 和BCPAP 細(xì)胞增殖(P<0.001,P<0.001)、侵襲(P<0.001,P<0.001)和遷移(P<0.001,P<0.001)能力顯著增強(qiáng)(圖5)。

3 討論

越來越多的研究表明,E2 可能參與PTC 的發(fā)生、發(fā)展[1-3],E2對(duì)靶細(xì)胞的作用主要是通過雌激素受體ERα 和ERβ 介導(dǎo)的[4],ERα 和ERβ 常共表達(dá)并參與雌激素的生理和病理反應(yīng)[13]。在本研究中,我們用免疫組化和Western Blot的方法檢測ERα和ERβ 的蛋白水平,發(fā)現(xiàn)ERα 和ERβ 在人PTC 組織和細(xì)胞中均共表達(dá),且與正常甲狀腺組織和細(xì)胞相比,PTC 組織和細(xì)胞中ERα 蛋白表達(dá)上調(diào),ERβ 蛋白表達(dá)下調(diào)。這一結(jié)果與曾報(bào)道的研究結(jié)果相一致,即ERα 和ERβ 在正常甲狀腺組織和腫瘤組織中共同表達(dá),與正常甲狀腺組織相比,在PTC 組織中ERα的水平相對(duì)高于ERβ[14]。

雖然ERα 和ERβ 在結(jié)構(gòu)上類似,都包括N-末端結(jié)構(gòu)域(NTD)、DNA 結(jié)合域(DBD)和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)的3 個(gè)功能域,但它們?cè)贜TD 和LBD 的結(jié)構(gòu)上存在著明顯的差異,它們的結(jié)構(gòu)差異表明ERα 和ERβ 可能具有不同的功能,乳腺癌MDA-231 細(xì)胞系和子宮內(nèi)膜癌HEC-1 細(xì)胞系細(xì)胞分析顯示ERβ 的活性一般低于ERα,且可能會(huì)影響ERα 的活性[5]。盡管有極少數(shù)報(bào)道顯示:在ERα 陰性的腫瘤組織和細(xì)胞中ERβ 對(duì)腫瘤有促增值作用。但大量的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)支持ERβ 作為一種抗增殖和促凋亡因子,特別是與ERβ 與ERα 共表達(dá)時(shí)[15]。大多數(shù)研究表明:ERα 促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,具有促腫瘤作用,而ERβ 與ERα 共表達(dá)時(shí),可能對(duì)ERα 介導(dǎo)的促腫瘤作用起抑制作用[16]。與過去的報(bào)道結(jié)果相一致,在本研究中我們通過對(duì)PTC 組織的免疫組化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn):ERα 蛋白水平與PTC患者的惡性侵襲性行為呈正相關(guān),ERβ蛋白水平與PTC 患者的惡性侵襲性行為呈負(fù)相關(guān)。腫瘤體積大、有ETE 和LNM、高BRAFV600E 表達(dá)、高TNM 分期(III-IV)的PTC 患者有高ERα、低ERβ 蛋白表達(dá)。

圖5 PES1促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞和正常甲狀腺細(xì)胞增殖、侵襲和遷移Fig.5 PES1 promoted the proliferation,invasion and migration of human PTC-derived BCPAP cells and normal thyroidderived Nthy-ori3-1 cells

ERα 和ERβ 蛋白水平之間的平衡和比率對(duì)于確定其對(duì)雌激素相關(guān)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的總體反應(yīng)至關(guān)重要。有報(bào)道顯示:ERα/ERβ 的比值可以作為判定PTC 患者和子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后和生存率的指標(biāo),即ERα/ERβ 比值較高時(shí)PTC 患者以及子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤惡性程度高、預(yù)后差[14,17]。在乳腺癌中,當(dāng)ERα/ERβ>1 促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖;當(dāng)ERα/ERβ<1 時(shí)抑制癌細(xì)胞增殖[7,18]。與這些研究結(jié)果一致,本研究中在細(xì)胞水平我們發(fā)現(xiàn):在正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1 中ERα/ERβ 蛋白比率顯著小于1(≈0.43),而在BCPAP 和K1 細(xì)胞中ERα/ERβ 蛋白比率顯著大于1(≈2.25,≈2.82)。

PES1是一種含有BRCT結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),參與胚胎發(fā)育、核糖體的生物合成、DNA 復(fù)制、染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞周期進(jìn)程,這些都是決定細(xì)胞增殖的重要組成因素[8-10]。近期有研究發(fā)現(xiàn):在卵巢癌和乳腺癌這些雌激素相關(guān)腫瘤中,PES1 能使ERα/ERβ蛋白比率顯著增高,促進(jìn)乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展[11-12]。然而PES1 在PTC 中的研究國內(nèi)外均尚無報(bào)道,且由于有報(bào)道顯示ERs的作用具有組織特異性[19],因此在本研究中,我們檢測了PTC 組織和細(xì)胞中的PES1 蛋白水平,并評(píng)估其蛋白水平與ERα 和ERβ 蛋白水平以及PTC 的發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。結(jié)果表明:PES1升高ERα蛋白水平,同時(shí)降低ERβ 蛋白水平,導(dǎo)致ERα/ERβ 蛋白比值升高,進(jìn)而促進(jìn)人PTC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。MTT和Transwell 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí):PES1 下調(diào)使癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯減弱,PES1 過表達(dá)使癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng),這與之前的報(bào)道結(jié)果相一致。

PES1蛋白表達(dá)水平與ERα/ERβ蛋白比率呈正相關(guān);PES1 過表達(dá)使Nthy-ori3-1 細(xì)胞中ERα/ERβ蛋白比率明顯增大(≈2.54);PES1 下調(diào)使BCPAP 細(xì)胞中ERα/ERβ 蛋白比率明顯降低(≈0.41);PES1 下調(diào)使PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯減弱,PES1 過表達(dá)使PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)。

綜上所述,PTC 患者的PES1 和ERα 蛋白水平較高,ERβ 水平較低,高PES1、高ERα 蛋白表達(dá)水平和低ERβ 蛋白表達(dá)水平與PTC 惡性侵襲性行為相關(guān)。PES1 增加ERα 蛋白水平,降低ERβ 蛋白水平,增加ERα/ERβ 蛋白比率,促進(jìn)PTC 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。PES1 對(duì)PTC 的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用,PES1 可能成為PTC 治療和預(yù)后的一個(gè)潛在靶點(diǎn),為PTC 的早期發(fā)現(xiàn)、臨床治療以及預(yù)后評(píng)估提供新思路。

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