張冕 萬芳 王勇 何文

摘要：目的：對大鼠灌胃給予抗腫瘤藥物隱丹參酮及其羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，建立藥物含量的體內(nèi)測定方法，并考察其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：將大鼠隨機(jī)分成兩組，一組灌胃給藥隱丹參酮原料藥，一組灌胃給藥隱丹參酮羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，血漿樣品經(jīng)處理后采用高效液相色譜法測定藥物濃度，以非諾貝特為內(nèi)標(biāo)，采用Hypersil ODS2-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm），甲醇-水（70：30）為流動(dòng)相，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為254 nm，柱溫25 ℃。血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS軟件進(jìn)行處理并計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：隱丹參酮在大鼠體內(nèi)Cmax、tmax、AUC0-t、AUC0-∞分別為2.85 μg·mL-1、2.27 h、19.69 mg·h·L-1、23.45 mg·h·L-1，隱丹參酮羥丙基-β-環(huán)糊精包合物在大鼠體內(nèi)Cmax、tmax、AUC0-t、AUC0-∞分別為8.50 μg·mL-1、1.36 h、45.41 mg·h·L-1、61.66 mg·h·L-1。結(jié)論：該法可用于隱丹參酮及其包合物的體內(nèi)含量測定，與隱丹參酮原料藥相比，其包合物達(dá)峰時(shí)間提前，血藥濃度的峰值增大，藥-時(shí)曲線下面積增大，生物利用度提高。

關(guān)鍵詞：抗腫瘤藥物;隱丹參酮;羥丙基-β-環(huán)糊精;包合物;藥動(dòng)學(xué)

中圖分類號：R969.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ?文章編號：1008-4657（2020）02-0042-05

0 引言

隱丹參酮（cryptotanshinone，CT）是從藥用鼠尾草植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）及甘西鼠尾草（S.przewaquskii Maxim）的根中分離提純的二萜醌類化合物，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗肥胖，改善腦缺血損傷、治療多囊卵巢綜合征等[1-3]。近年來研究表明，隱丹參酮可以通過抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制新血管和淋巴管生成和抗氧化等途徑發(fā)揮抗癌作用，是一種很有前景的抗腫瘤藥物[4-6]。然而隱丹參酮的水溶性較差，加上其對光極為敏感，會(huì)發(fā)生光化反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。

羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）是β-環(huán)糊精的C2，C3和C6位羥基被羥丙基取代后生成的衍生物，具有增溶作用大、包合能力強(qiáng)、毒性小、提高藥物穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，甚至可以用于注射給藥[7]。

本文在前期隱丹參酮制成HP-β-CD包合物，通過包合技術(shù)來改善藥物的溶解性和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將隱丹參酮及其包合物對大鼠進(jìn)行灌胃給藥，通過采用HPLC法考察隱丹參酮及其包合物在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)行為，為隱丹參酮及其包合物的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)踐參考依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

AX205型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）;3K30高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）;WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）;DC150-1氮吹儀（杭州佑寧儀器有限公司）;伍豐LC-100高效液相色譜儀（上海伍豐液相色譜儀）。

1.2 試藥

隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度 ≥ 98%，阿拉丁化學(xué)試劑上海有限公司）;隱丹參酮原料藥（純度98%，西安開來生物工程有限公司）;隱丹參酮羥丙基-β-環(huán)糊精包合物（實(shí)驗(yàn)室自制，包合率約79%）;非諾貝特標(biāo)準(zhǔn)品（批號：100733-201502，中國食品藥品檢定研究院）;甲醇（色譜純）;其它試劑為分析純。

1.3 受試動(dòng)物

SD大鼠12只，體重（250 ± 10） g，雌雄各半，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號SCXK（鄂）2015-0018。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2-C18柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm）;流動(dòng)相：甲醇-水（70：30）;流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：254 nm;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.20 mg·mL-1的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，以甲醇為溶劑，定量稀稀釋成濃度為1.00、2.00、5.00、15.00、25.00、50.00、75.00、100.00 μg·mL-1的對照品溶液，4 ℃保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)非諾貝特標(biāo)準(zhǔn)品[8]5.0 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度。取該溶液2 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為100.00 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存，備用。

2.3 血漿樣品的處理

將大鼠全血置于肝素鈉抗凝處理過的離心管中，于高速冷凍離心機(jī)中12 000 r·min-1分離血漿，用微量進(jìn)樣器吸取200 μL上清液于離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，旋渦混合1 min，加入5 mL甲醇，旋渦混合3 min，于高速冷凍離心機(jī)中12 000 r·min-1離心10 min，分離上清液，于35 ℃水浴用氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相渦流溶解后，取20 μL上清液用“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 專屬性

取空白血漿、空白血漿+隱丹參酮、空白血漿+隱丹參酮+內(nèi)標(biāo)、受試大鼠灌胃給藥后所采集的血漿，按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行處理后，進(jìn)樣檢測，分別記錄色譜圖，見圖1。

? 圖1結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾隱丹參酮和內(nèi)標(biāo)非諾貝特的測定，隱丹參酮的保留時(shí)間為6.3 min，非諾貝特的保留時(shí)間為8.9 min。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取大鼠空白血漿200 μL，分別加入“2.2”項(xiàng)下不同濃度的隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，搖勻，配成隱丹參酮質(zhì)量濃度分別為的系列血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法，自“精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL”起同樣操作，進(jìn)樣分析，記錄隱丹參酮的色譜峰面積（Ai）和內(nèi)標(biāo)非諾貝特的色譜峰面積（As）。以峰面積比R（R = Ai/As）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為R=0.0091C+0.7468（r = 0.994 6）。結(jié)果表明隱丹參酮血漿濃度在1.00～100.00 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度

取大鼠空白血漿200 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高濃度的血漿樣品各5份（濃度分別為5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行血漿樣品的處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，分別于日內(nèi)測定5次，用隱丹參酮的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比R帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到相應(yīng)的濃度，進(jìn)而計(jì)算樣品的日內(nèi)精密度。同樣的方法，連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1，三種不同濃度隱丹參酮日內(nèi)精密度的RSD為 2.78%～4.26%，日間精密度的RSD為5.88%～7.01%，均小于10%，符合體內(nèi)生物樣品分析要求[9]。

2.4.4 提取回收率

取大鼠空白血漿200 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高濃度的血漿樣品各5份（濃度分別為5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行血漿樣品的處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，將所得峰面積與相同濃度未經(jīng)提取的隱丹參酮對照品溶液直接進(jìn)樣所得的峰面積相比[10]，得提取回收率分別為79.6%、82.3%、80.9%，RSD分別為8.6%、7.7%、7.9%。同法得內(nèi)標(biāo)提取率分別為74.9%、73.5%、70.6%，RSD分別為9.1%、7.8%、8.2%。結(jié)果表明，隱丹參酮對照品和內(nèi)標(biāo)通過該方法進(jìn)行血漿樣品處理后，提取回收率良好。

2.4.5 穩(wěn)定性

2.4.5.1 室溫放置穩(wěn)定性

取大鼠空白血漿200 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高濃度的血漿樣品各5份（濃度分別為5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行血漿樣品的處理，分別于0，1，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄隱丹參酮和內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算可得低、中、高濃度血漿樣品的RSD分別為9.8%、8.4%、9.1%。結(jié)果表明，隱丹參酮血漿樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5.2 反復(fù)凍融穩(wěn)定性

取大鼠空白血漿200 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高濃度的血漿樣品各5份（濃度分別為5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），于- 20 ℃冷凍后，放置于室溫狀態(tài)下，待其完全融解后，按按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行血漿樣品的處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄隱丹參酮和內(nèi)標(biāo)的峰面積。將剩余樣品再次于- 20 ℃冷凍后，重復(fù)上述操作，反復(fù)凍融3次，考察樣品的反復(fù)凍融穩(wěn)定性。計(jì)算可得低、中、高濃度血漿樣品的RSD分別為8.3%、7.8%、9.2%，結(jié)果表明隱丹參酮血漿樣品反復(fù)凍融3次穩(wěn)定。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

將SD大鼠隨機(jī)分成兩組，雌雄各半。受試前大鼠禁食12 h，不禁水，灌胃給藥5 h后進(jìn)食。第1組灌胃給藥隱丹參酮原料藥，第2組灌胃給藥隱丹參酮HP-β-CD包合物，其中隱丹參酮的給藥量均為30.0 mg/kg。分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h從眼底靜脈叢采血0.4～0.5mL，置于肝素鈉抗凝處理過的試管中，分離血漿，置- 20 ℃保存待測。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

根據(jù)測定的各時(shí)刻的血藥濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖2。

經(jīng)DAS2.1.1藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，具體結(jié)果見表2。包合物的相對生物利用度計(jì)算方法如下式：F（%）=（AUC0-∞）包合物/（AUC0-∞）原藥 × 100%[11]。由表中的數(shù)據(jù)可得，包合物組的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均高于單體組，而其tmax遠(yuǎn)小于單體組，表明將隱丹參酮制成包合物后，吸收速度明顯加快，吸收程度顯著增加。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終選用非諾貝特為內(nèi)標(biāo)，建立了大鼠血漿中隱丹參酮的HPLC測定方法，該法操作簡單、靈敏準(zhǔn)確。在血藥濃度的測定中，采用內(nèi)標(biāo)法能有效地消除實(shí)驗(yàn)條件變化等因素引起的誤差，同時(shí)將血樣進(jìn)行氮?dú)饬鞔蹈蛇@一富集化操作，也能有效地提高檢測的靈敏度。

隱丹參酮是一種很有前景的抗腫瘤藥物，包合技術(shù)一方面能改善其水溶性較差的特點(diǎn)，另一方面能降低其光化反應(yīng)的發(fā)生幾率，增加其穩(wěn)定性。本文采用HP-β-CD對隱丹參酮進(jìn)行包合，測定隱丹參酮及隱丹參酮HP-β-CD包合物的血藥濃度，考察其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，將所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示隱丹參酮HP-β-CD包合物組的峰濃度、吸收速率常數(shù)與隱丹參酮組相比有極顯著性差異（P<0.01）），且包合物組的藥時(shí)曲線下面積增大，達(dá)峰時(shí)間提前，表明HP-β-CD對隱丹參酮的包合作用使其生物利用度提高。這可能是由于包合作用使隱丹參酮的溶解度增加、穩(wěn)定性增強(qiáng)，在濃度梯度加大的作用下，其透膜吸收的速度和程度均加大的原因。

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[責(zé)任編輯：許立群]