孟月，王丹，王雪蕾，羅芳，郭曉茹，夏桂民

·綜述·

抗腫瘤核酸藥物陽離子納米載體的研究進展

孟月，王丹，王雪蕾，羅芳，郭曉茹，夏桂民

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所制劑室

腫瘤的本質(zhì)是一種“基因病”，其發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)與基因密切相關。隨著科學技術的進步與發(fā)展，基因治療時代悄然而至，越來越多的研究工作者選擇具有抗腫瘤活性的核酸藥物，將其導入靶細胞，通過調(diào)節(jié)相關基因的表達實現(xiàn)抗腫瘤效果[1]。核酸藥物主要包括小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小 RNA（microRNA，miRNA）、反義核酸及質(zhì)粒DNA（plasmid DNA，pDNA）等。該類藥物在體內(nèi)外均不穩(wěn)定，易被核酸酶降解，因此需要適宜的載體完成體內(nèi)遞送。

核酸藥物的遞送載體主要包括病毒載體和非病毒載體。病毒具有感染細胞的天性，可攜帶遺傳物質(zhì)進入細胞，其作為核酸藥物遞送載體，具有轉(zhuǎn)染效率高、作用迅速、起效快等優(yōu)勢。目前，約 70%用于臨床試驗的核酸藥物均以修飾過的病毒作為載體，其中部分已獲批上市[2]。但病毒載體制備困難，生產(chǎn)成本高，裝載 DNA 大小受限，又存在細胞毒性、免疫原性和致癌性等安全性問題，限制了其在臨床上的廣泛應用[3]。隨著藥用高分子材料和納米醫(yī)學等相關學科的快速發(fā)展，涌現(xiàn)了許多非病毒載體，例如脂質(zhì)體、納米粒、膠束等，它們通常含有陽離子組分（陽離子磷脂或陽離子聚合物等），所以常稱之為陽離子納米載體。陽離子納米載體通過靜電作用與荷負電的核酸藥物經(jīng)物理結合形成納米粒，可保護核酸藥物免遭核酸酶的降解，實現(xiàn)核酸藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定遞送。與病毒載體相比，陽離子納米載體具有制備簡單、安全性高、包裹的核酸大小不易受限、易于改性修飾、又可實現(xiàn)核酸與小分子化療藥物共遞送等諸多優(yōu)勢，因而備受關注。目前，雖然已有一些抗腫瘤核酸藥物的陽離子納米制劑進入了臨床研究階段（表 1），但多數(shù)因療效不佳或嚴重的毒副作用而終止了臨床試驗。綜上，構建高效、低毒、智能的納米載體是實現(xiàn)抗腫瘤核酸藥物在體內(nèi)穩(wěn)定遞送的關鍵。本文主要介紹近幾年抗腫瘤核酸藥物陽離子納米載體的研究進展，為新型抗腫瘤核酸藥物納米制劑的研發(fā)提供參考。

1 基于陽離子脂質(zhì)的核酸藥物納米載體

陽離子脂質(zhì)因具有良好的生物相容性和理化性質(zhì)而被用作核酸藥物的遞送載體材料。常見的陽離子脂質(zhì)有1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化銨（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、2,3-二油酰氧-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基-三氯乙酸鹽（DOSPA）、二甲基雙十八烷基溴化胺（DDAB）、3β-[N-(N',N'-二甲基二甲基胺乙基)胺基甲酰基)膽固醇（DC-Chol）及其他新型陽離子脂質(zhì)等。

表 1 抗腫瘤核酸藥物陽離子納米制劑臨床研究現(xiàn)狀

1.1 基于陽離子脂質(zhì)的經(jīng)典納米載體

1.1.1 陽離子脂質(zhì)體 由陽離子脂質(zhì)和中性磷脂構建的陽離子脂質(zhì)體是最常見的核酸藥物遞送載體，它們通常具有穩(wěn)定性好、體內(nèi)可生物降解及保護核酸免遭酶解等優(yōu)勢。中性磷脂的加入，既可輔助陽離子脂質(zhì)體形成，也可降低細胞毒性，提高轉(zhuǎn)染效率。常用的中性磷脂包括磷脂酰乙醇胺（PE）及其衍生物、磷脂酰膽堿（PC）及其衍生物、膽固醇（Chol）等。研究表明，二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）具有 pH 敏感性，在包涵體酸性環(huán)境中能夠誘導脂質(zhì)體膜與包涵體膜融合，促進核酸釋放。因此，以 DOPE 為輔助磷脂的陽離子脂質(zhì)體通常具有較高的轉(zhuǎn)染效率[4-5]。為延長陽離子脂質(zhì)體體內(nèi)循環(huán)時間，避免其與血漿蛋白相互作用而產(chǎn)生調(diào)理作用，可采用聚乙二醇（PEG）修飾陽離子脂質(zhì)體，遮蔽或部分遮蔽其表面的正電荷，降低細胞毒性和血漿清除率。研究表明，在陽離子脂質(zhì)體中加入 3% DSPE-mPEG2000，與未經(jīng) PEG 修飾的陽離子脂質(zhì)體相比，PEG 化脂質(zhì)體粒徑、電位均降低，穩(wěn)定性提高，在 4 ℃條件下至少保存 6 個月[6]。Bathula 等[7]篩選出一種具有人 DNA 連接酶（hLig）Ι抑制作用的新型陽離子脂質(zhì)（C12M）（圖 1），它可以與hLig Ι 結合，干擾 DNA 的復制和修復，從而導致 DNA 片段在細胞中積累，高濃度下可導致細胞凋亡；采用注入法將 C12M 與等摩爾的膽固醇混合可制得粒徑為 106 nm、zeta 電位為 40 mV 的陽離子脂質(zhì)體，該載體能夠?qū)?survivin siRNA 有效遞送至人前列腺癌細胞 PC-3，顯著抑制 survivin 蛋白的表達；此外，采用 B16F10 黑素瘤模型小鼠開展體內(nèi)藥效學評價，在治療 21 d 后（0.5 mg/kg，IV，Q3D × 7），與游離 survivin siRNA 相比，survivin siRNA/C12M 能夠顯著抑制瘤體積增長。

圖 1 陽離子脂質(zhì) C12M 的化學結構

1.1.2 陽離子固體脂質(zhì)納米粒 由陽離子脂質(zhì)與天然的固態(tài)脂質(zhì)（如單硬脂酸甘油酯、脂肪酸、卵磷脂等）混合而制備的陽離子固體脂質(zhì)納米粒（cationic solid lipid nanoparticles，CSLNs）也被用作核酸藥物遞送載體[8]。Akbaba 等[9]采用乳化分散法將陽離子脂質(zhì) DDAB 與固態(tài)脂質(zhì)山崳酸甘油酯混合制備成 CSLNs，并將能夠抑制 5-α 還原酶表達的 shRNA 編碼質(zhì)粒（p5α-Red）負載到 CSLNs，形成 SLN:p5α-Red 納米粒（粒徑 62.65 nm、zeta 電位12.9 mV），將其與前列腺癌細胞 DU-145 共孵育 48 h 后可使胞內(nèi)5-α 還原酶表達水平降低 65.1%。

1.2 基于陽離子脂質(zhì)的智能型納米載體

1.2.1 靶向修飾型 采用一些可與靶細胞特異性或非特異性結合的分子，如抗體、蛋白、多肽及小分子等，對基于脂質(zhì)的陽離子納米載體進行修飾，賦予載體靶向功能，使其能夠主動識別靶組織或靶細胞，并在此聚集，提高核酸藥物治療效果。

⑴抗體修飾：Anti-EphA10 抗體（Eph）可與乳腺癌細胞表面高表達的 Eph 受體 A10 結合，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Zang 等[10]采用 Eph 對 pH 敏感型陽離子脂質(zhì)體（PSL）進行修飾，得靶向脂質(zhì)體（EPSL），將EPSL 和 PSL分別與多藥耐藥基因 MDR1-siRNA 共孵育（N/P = 9）得到 EPSLR納米粒（粒徑 143 nm、zeta 電位 22.7 mV）和 PSLR納米粒；研究表明 MCF-7/ADR 細胞對 EPSLR 的攝取比 PSLR 高 4.42 倍，使得 MDR1 蛋白表達顯著下調(diào)；采用 DIR 對納米粒進行標記，尾靜脈注射至 MCF-7/ADR 荷瘤小鼠體內(nèi)，24 h 后 EPSLR 組腫瘤部位的熒光信號強度比 PSLR 組高 1.2 倍，表明靶向修飾后可以增加納米粒在腫瘤部位聚集。

⑵轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾：轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）可與細胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結合，協(xié)助血漿糖蛋白運載鐵離子至細胞中。由于腫瘤細胞對鐵離子的需求急劇增加，使得腫瘤細胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體明顯增加，依據(jù)這一特性，Saavedra-Alonso 等[11]采用 Tf 修飾的 PEG 化陽離子脂質(zhì)體（Lip）介導1shRNA 用于黑色素瘤動物模型的靶向遞送，結果表明，Lip-shRNA-Tf 的抑瘤效果（抑瘤率24%）顯著優(yōu)于 Lip-shRNA，Lip-shRNA-Tf 組1 基因沉默效率（1 基因相對表達量 0.21）顯著高于 Lip-shRNA（1 基因相對表達量 1.34），且荷瘤小鼠的生存率提高 37%。

⑶葉酸修飾：腫瘤細胞表面高表達葉酸受體。Kabilova 等[12]合成 1,2-di-O-ditetradecyl-rac-glycerol 與葉酸的共軛物（Fc），該共軛物可與陽離子脂質(zhì)和膽固醇等制備成粒徑為（60 ± 22）nm 的葉酸靶向陽離子脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體能夠介導 siRNA 有效遞送至葉酸高表達的人口腔表皮樣癌細胞 KB-3-1 中，其轉(zhuǎn)染效率比未修飾脂質(zhì)體高 3 ~ 4 倍；在多藥耐藥細胞 KB-8-5 荷瘤 SCID 小鼠模型中，此脂質(zhì)體改變了 Cy7-labeled-siRNA 的體內(nèi)分布，顯著增加 siRNA 在腫瘤部位的聚集，且尾靜脈注射 siMDR/F，3 d 后，腫瘤組織中 P-糖蛋白表達下降 40%，表明該脂質(zhì)體可靶向至腫瘤部位并發(fā)揮效果。

⑷半乳糖修飾：半乳糖（galactose，GAL）能夠與肝癌細胞表面特異性表達的去唾液酸蛋白受體結合。Oh等[13]構建了半乳糖基化陽離子脂質(zhì)體用于 vimentin siRNA 和阿霉素（DOX）共遞送，該共載脂質(zhì)體與人肝癌細胞 Huh7 具有更強的親和力，使 Huh7 細胞中 vimentin 蛋白表達下調(diào) 77%，轉(zhuǎn)染 48 h 后，細胞活力下降 49%；在 Huh7 細胞荷瘤裸鼠模型中，半乳糖基化共載脂質(zhì)體在腫瘤部位的累積比未修飾的共載脂質(zhì)體（DOX/siRNA-L）高 2.3 倍，且給藥 28 d 后，半乳糖基化共載脂質(zhì)體組瘤體積為（286 ± 45）mm3，顯著低于 DOX/siRNA-L 的（709 ± 103）mm3。

1.2.2 環(huán)境敏感型 核酸類藥物在體內(nèi)有效釋放是提高轉(zhuǎn)染效率的關鍵。近年來，基于脂質(zhì)的環(huán)境敏感型納米載體備受研究者關注，例如 pH 敏感型、溫度敏感型、氧化還原敏感型、酶敏感型等，這類納米載體只有到達腫瘤部位時，才能將包載的抗腫瘤核酸藥物釋放出來，起到靶向遞送和控制釋放的作用。

⑴pH 敏感型：針對腫瘤組織（pH 6.5 ~ 7.2）和內(nèi)涵體（pH 4 ~ 5）等弱酸性環(huán)境可以構建 pH 敏感型陽離子脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米粒，因其能夠在靶部位控制釋放，通常具有較好的轉(zhuǎn)染效果。YSK05 是一種 pH 敏感的陽離子脂質(zhì)（圖 2）。研究報道，YSK05 可以與其他磷脂材料混合制得 pH 敏感脂質(zhì)體，可以將 siRNA、anti-miRNA oligonucleotide 和 pDNA 有效遞送至肝癌細胞[14-16]。YSK05 分子結構中含有 pH 敏感基團 N-甲基哌啶，其在酸性條件下荷正電（pKa = 6.6），能夠固縮核酸；其在中性環(huán)境下失去正電荷，通過 Apo-E 介導的內(nèi)吞作用進入細胞，在內(nèi)涵體酸性環(huán)境下，YSK05 轉(zhuǎn)變?yōu)榱蔷?，脂質(zhì)體變?yōu)榉欠€(wěn)定結構，與內(nèi)涵體膜融合，使得核酸從內(nèi)涵體釋放至胞漿中[14]。與傳統(tǒng)的陽離子脂質(zhì) DOTAP、DOSPA 相比，采用 YSK05 制備的陽離子脂質(zhì)體雖然細胞攝取率較低，但卻顯示出較強的基因沉默效率和較低的細胞毒性[14-15]。

圖 2 陽離子脂質(zhì) YSK05 的化學結構

⑵氧化還原敏感型：細胞質(zhì)中存在大量谷胱甘肽（glutathione，GSH），其濃度比細胞外或者血液中高100 ~ 1000 倍[17]，致使細胞內(nèi)呈現(xiàn)還原性環(huán)境。依據(jù)這一特性，Candiani等[18]采用二硫鍵將兩分子三嗪類陽離子脂質(zhì)連接在一起形成具有氧化還原敏感特性的陽離子脂質(zhì) SS14（圖 3），采用薄膜法將 DOPC、DOPE 和 SS14 按摩爾比為 16.7:33.3:50 制備陽離子脂質(zhì)體，用該載體負載 pEGFP-N1，轉(zhuǎn)染人惡性腦膠質(zhì)瘤細胞 U87-MG，其轉(zhuǎn)染效率比 Lipofectamine 2000 高 2.7 倍；GSH 耗竭/飽滿實驗研究結果表明，GSH 可特異性地誘導 pEGFP-N1 體外釋放，細胞內(nèi) GSH 水平與轉(zhuǎn)染效率成正相關。

⑶溫度敏感型：Wang 等[19]合成溫度敏感型聚合物P(NIPAAm-co-DMAPAAm)-DOPE，將其與 DOTAP 和 DOPE 混合，采用薄膜法制備得到溫敏陽離子脂質(zhì)體，將該脂質(zhì)體與 Luc siRNA 共孵育后得到脂質(zhì)復合物，當溫度由 30 ℃上升到 40 ℃時，該脂質(zhì)復合物的粒徑由 106 nm 增加到 149 nm（PDI 0.14 → 0.32），表明其具有溫敏特性，用該脂質(zhì)體介導 GFP pDNA 轉(zhuǎn)染能夠瞬時表達 GFP 的 HeLa 細胞，其轉(zhuǎn)染效率與市售轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 相當。然而，合成的溫度敏感聚合物不可降解，限制了其在體內(nèi)的應用。天然來源的熱敏性彈性蛋白多肽（ELP）在體內(nèi)可生物降解為無毒的氨基酸，安全性較高，可用來修飾陽離子脂質(zhì)體，提高基因轉(zhuǎn)染效率[20]。

⑷酶敏感型：腫瘤組織中具有豐富多樣的酶，如磷脂酶 A2（sPLA2）、基質(zhì)金屬蛋白水解酶（MMPs）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）、彈性蛋白酶（elastase）、前列腺特異性抗原（PSA）、組織蛋白酶B（cathepsin B）等[21]。酶敏感型載體通常含有可被酶降解的組分，Song 等[22]合成了脂質(zhì) mPEG-GLFG-K-(C16)2，其中 GLFG 可被細胞溶酶體中的酶降解，采用薄膜法將其與 DOTAP、DOPE 混合，制備酶敏感陽離子脂質(zhì)體（eSPLPs），它能夠成功包裹 pDNA（包封率> 80%）；eSPLPs 與組織蛋白酶 B 混合后，mPEG-GLFG-K-(C16)2被酶降解，脂質(zhì)體粒徑由 200 nm 增長到 20 μm，說明脂質(zhì)體質(zhì)膜疏松，而不含酶敏感鍵的脂質(zhì)體（SPLPs）粒徑?jīng)]有變化；eSPLPs 的轉(zhuǎn)染效率較 SPLPs 高 10 ~ 100 倍，表明 eSPLPs 具有酶敏感性。

2 基于陽離子聚合物的核酸藥物納米載體

陽離子聚合物作為核酸藥物遞送載體，具有安全性高、免疫原性低、結構易于修飾等優(yōu)勢，其種類繁多，通常分為人工合成陽離子聚合物（聚乙烯亞胺、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、陽離子型聚酯和多聚賴氨酸等）和天然來源陽離子聚合物（殼聚糖及其衍生物、環(huán)糊精等）。其中，多聚賴氨酸（PLL）固縮核酸能力與其分子量密切相關，分子量的增大有助于增加 PLL 對核酸的負載，但毒副作用也隨之增加；此外，以 PLL 為骨架的遞送載體進入體內(nèi)后，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，從而快速從體內(nèi)清除，加之部分到達靶細胞的 PLL 在溶酶體中被降解失活，使得 PLL 的轉(zhuǎn)染效率極低，目前，有研究人員通過結構改造提高 PLL 的轉(zhuǎn)染效率[23-24]、賦予載體靶向性[25]。環(huán)糊精衍生物可直接作為核酸藥物載體，也可作為連接臂或是修飾物用于核酸藥物載體的構建[26-27]，還可通過準聚輪烷或聚輪烷的形式用于核酸藥物遞送[28-29]，但存在體內(nèi)穩(wěn)定性差、內(nèi)涵體逃逸能力弱、轉(zhuǎn)染效率低等不利因素，制約其廣泛應用。在此我們著重介紹聚乙烯亞胺、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、陽離子型聚酯和殼聚糖及其衍生物的應用。

圖 3 陽離子脂質(zhì)SS14 的化學結構

2.1 聚乙烯亞胺

聚乙烯亞胺（PEI）的正電荷密度較高，能夠有效地固縮核酸藥物，并將其遞送至腫瘤細胞，其獨特的“質(zhì)子海綿”效應，能夠促使核酸藥物從內(nèi)涵體中逃逸出來，因而被廣泛用于抗腫瘤核酸藥物的體內(nèi)外遞送。PEI 的轉(zhuǎn)染效率與其本身的結構和分子量有關，線性 PEI（22 kD）和支鏈 PEI（25 kD）具有較高的轉(zhuǎn)染效率，均被認為是核酸類藥物陽離子聚合物載體領域里的“金標準”。

2.1.1 聚乙烯亞胺衍生物納米載體 由 PEI 高密度正電荷引起的細胞毒性問題限制了其廣泛應用。近年來研究人員采用氨基酸[30]、脂肪酸[31]、透明質(zhì)酸和殼聚糖[32]等對低分子量的 PEI 進行結構修飾，開發(fā)了多種高效、低毒的 PEI 衍生物。Ewe 等[30]采用酪氨酸對低分子量支鏈 PEI（10 kD）進行修飾，得到 PEI 衍生物 P10Y，與 siRNA 共孵育得 P10Y/siRNA 納米粒（粒徑 300 nm、zeta 電位 20 mV）；與 PEI/siRNA 相比，P10Y/siRNA 在卵巢癌細胞株SKOV-3-LUC、SKOV-3-eGFP 及前列腺癌細胞株PC-3-eGFP中均顯示出較高的基因敲除率（大于 70%）；將 P10Y/siSurv 納米粒靜脈注射到荷瘤鼠的體內(nèi)，與對照組（P10Y/siCtrl）相比，P10Y/siSurv 能夠顯著抑制腫瘤的生長，且給藥16 天內(nèi)小鼠體重無明顯變化。

2.1.2 脂質(zhì)體 PEI 納米粒組裝體 采用脂質(zhì)囊泡對 PEI 納米粒進行包裹可形成脂質(zhì)體 PEI 納米粒組裝體。Pinnapireddy 等[33]采用薄膜分散法將 DOPE:DPPC: Cholesterol 按摩爾比 70:15:15 混合制備脂質(zhì)體，用其包裹 PEI/pDNA 或 PEI/siRNA polyplex 得到 lipopolyplex，其粒徑為 211.4 nm，PDI為 0.19，zeta 電位為 3.9 mV。研究表明，當 liposome/PEI 質(zhì)量比為 0.39 時，lipopolyplex 轉(zhuǎn)染效率增加了 10 倍，且使穩(wěn)定表達熒光素酶的人卵巢腺癌細胞 SK-OV-3 中熒光素酶的表達下調(diào) 80%，細胞毒性顯著降低。

2.1.3 智能化 PEI 納米載體 Liu 等[34]采用葉酸對三嵌段共聚物 PEI-PCL-PEG 進行靶向修飾得到PEI-PCL-PEG-Fol，該共聚物可以有效固縮 siRNA，形成粒徑約 100 nm、zeta 電位為 7 ~ 9 mV 的膠束。用該載體遞送 GAPDH-siRNA 至 SK-OV-3 細胞，使細胞內(nèi) GAPDH 表達下調(diào) 60%。Fan等[35]設計了環(huán)境敏感型 PEI 納米載體，采用鄰苯二酚基團修飾的聚乙二醇（PEG-Cat）對苯硼酸修飾的聚乙烯亞胺（PEI-PBA）進行修飾，二者通過 PBA 與 Cat 之間形成的硼酸酯偶聯(lián)形成 pH 敏感聚合物 PCPP，該聚合物載體負載 siRNA 到達腫瘤酸性環(huán)境時，硼酸酯鍵斷裂，使 PEG 從載體上脫落，暴露出 PBA，PBA 可與腫瘤細胞表面高表達的唾液酸受體結合，介導載體高效入胞。在小鼠乳腺癌細胞 4T1 原位腫瘤模型中，PCPP/cy5-siRNA 組腫瘤部位的熒光強度顯著高于游離 cy5-siRNA 和 PEI/Cy5-siRNA，表明 PCPP/cy5-siRNA 能有效在腫瘤部位聚集。體內(nèi)藥效學實驗表明，PCPP/siSur 能夠顯著抑制腫瘤生長（抑瘤率 61.6%）和轉(zhuǎn)移。

2.2 聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物

聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物（PAMAM）結構中含有大量的伯胺和仲胺，因此也具有質(zhì)子海綿效應。此外，PAMAM 具有獨特的球形結構和可生物降解性，已被廣泛用作核酸藥物載體，其中 SuperFect?作為商品化的轉(zhuǎn)染試劑已被大眾熟知。通過對 PAMAM 進行結構修飾，使其在保留原有結構優(yōu)勢的基礎上，提高轉(zhuǎn)染效果或賦予其靶向功能。Chang 等[36]采用同時含有苯基和胍基的化合物 GBA 對 G5-PAMAM 進行修飾得到聚合物 G5-GBA60，與 siRNA 共孵育制備 G5-GBA60/siRNA 納米粒（粒徑 200 nm、PDI < 0.3、zeta 電位 30 ~ 40 mV）。研究表明，G5-GBA60/siLuc 納米粒在 HeLa-luc 細胞上表現(xiàn)出與 Lipofectamine 2000 相當?shù)霓D(zhuǎn)染效果，在人骨肉瘤細胞 U2OS 上可使bcl-2 基因的表達下調(diào)約 80%，優(yōu)于 Lipofectamine 2000。

2.3 聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯

聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PDMAEMA）也是一種較為常見的陽離子聚合物，它具有良好的親水性和生物相容性，易于功能化，且當體系溫度或 pH 發(fā)生變化時，PDMAEMA 分子結構中的叔胺基發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化，引起聚合物的相態(tài)發(fā)生改變，因此可作為刺激響應性高分子材料用于核酸藥物遞送載體的制備。PDMAEMA 的轉(zhuǎn)染效率與相對分子量密切相關，通常情況下相對分子質(zhì)量大于 300 kD 的 PDMAEMA 具有較高的轉(zhuǎn)染效果，但因其在體內(nèi)不能被降解，容易引起嚴重的細胞毒性。減小 PDMAEMA 的相對分子質(zhì)量可降低細胞毒性，但轉(zhuǎn)染效率也隨之減小。為降低 PDMAEMA 引起的細胞毒性，研究人員通過結構修飾賦予 PDMAEMA 可生物降解的特性，大大提高了轉(zhuǎn)染效率，并降低了毒副作用。Wang 等[37]采用可生物降解的聚[(R)-3-羥基丁酸酯]（PHB）對 PDMAEMA 進行修飾，得到聚合物 PHB-PDMAEMA，該聚合物可用于紫杉醇和 Nur77 基因的共遞送，Nur77 基因可逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株 HepG2/Bcl-2 中 Bcl-2 蛋白表達，與紫杉醇發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效果。Palanca-Wessels 等[38]采用曲妥珠單抗對 PDMAEMA 聚合物膠束進行修飾得到具有 HER 2 靶向性的納米載體，用該載體遞送 siRNA，可使靶蛋白在 96 h 內(nèi)持續(xù)下調(diào) 80%；體內(nèi)實驗表明，曲妥珠單抗的修飾能夠增加納米載體在腫瘤部位的聚集，并使靶基因的表達下調(diào) 70%。

2.4 陽離子型聚氨酯

陽離子型聚氨酯具有良好的水溶性，其在體內(nèi)可被快速降解。常見的陽離子型聚氨酯包括聚(4-羥基-L-脯氨酸甲酯)（PHP）、聚[γ-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]（PAGA）、聚(β-氨基酯) 等，其中 PHP 為最早用于核酸類藥物遞送的陽離子型聚氨酯，其在生理條件下生物半衰期為 2 h，PHP 與 DNA 結合形成復合物，在 4 h 內(nèi)可保護 DNA 免遭核酸酶降解。

PAGA具有與 PHP 相似的降解行為，其與 DNA 形成的復合物轉(zhuǎn)染效率比 PLL/DNA 高 2 倍，且無明顯細胞毒性[39]。Yu 等[40]采用 pH 敏感型聚合物聚 2-(異丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯（PDPA）和 PEG 對 PAGA 進行修飾，制備出 pH 敏感的三嵌段共聚物 PEG-b-PAGA-b-PDPA，用該聚合物共遞送 siRNA-p65 和順鉑前藥，在腫瘤酸性微環(huán)境下，PDPA 核心質(zhì)子化，聚合物膠束解體，釋放順鉑前體藥物和 siRNA-p65，協(xié)同抑制腫瘤生長，并通過下調(diào) NF-κB 的表達，抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移，可用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療。聚(β-氨基酯) 含有質(zhì)子化胺基和可降解鍵，在生理條件下可被快速降解，其作為核酸藥物遞送載體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率。Cutlar 等[41]采用“A2 + B3/B2”策略合成了高分支狀聚(β-氨基酯)（HPAEs），與線性聚（β-氨基酯）和市售轉(zhuǎn)染試劑 SuperFect?相比，HPAEs 具有較低的細胞毒性，并對 HeLa 細胞有較高的轉(zhuǎn)染效率。

2.5 殼聚糖及其衍生物

殼聚糖（CS）因具有制備簡單、成本低廉、良好的生物相容性和生物可降解性等獨特優(yōu)勢，而成為體內(nèi)核酸遞送的良好載體材料。殼聚糖為甲殼素脫乙?；蟮乃猱a(chǎn)物，它的分子中含有游離氨基，在弱酸性環(huán)境下可與帶負電的核酸藥物自發(fā)形成聚合物納米粒。殼聚糖納米粒的轉(zhuǎn)染效果與殼聚糖脫乙?；潭取⑾鄬Ψ肿淤|(zhì)量、環(huán)境 pH、有無血清、殼聚糖/DNA 的電荷比及細胞類型等相關[42]。對殼聚糖納米粒進行適當?shù)母男孕揎棧稍黾悠滢D(zhuǎn)染效率。

Arami 等[43]制備了一種具有生物相容性和可降解性的納米遞送載體 Fe3O4-PEG-LAC-chitosan-PEI，該載體能夠有效遞送 survivin siRNA 至人乳腺癌細胞 MCF-7（48 h 細胞攝取率 64.70%），顯著降低 survivin 蛋白的表達水平，聯(lián)合使用米托蒽醌，可增加細胞對米托蒽醌的敏感性。He 等[44]采用葉酸修飾的殼聚糖納米粒（FA-CS）介導 mIP-10 基因的體內(nèi)靶向遞送，在 B16 細胞（小鼠黑色素瘤細胞）皮下荷瘤小鼠模型中，F(xiàn)A-CS-mIP-10 能夠增強腫瘤微環(huán)境中 IP-10 基因的表達，促使黑色素瘤特異性細胞毒性 CD8+CD28+T 淋巴細胞向腫瘤部位轉(zhuǎn)移，有效抑制腫瘤細胞的增殖，聯(lián)合腫瘤免疫療法可提高黑色素瘤的治療效果。

3 基于陽離子肽的核酸藥物納米載體

陽離子肽即細胞穿膜肽（CPPs）是一類富含堿性氨基酸的短肽序列，荷正電，其作為核酸藥物遞送載體，既可提高核酸藥物的入胞效率，也可賦予遞送載體靶向功能，因此備受關注。常見的陽離子肽包括 TAT、R15、R9、魚精蛋白等。

3.1 TAT

單獨使用 TAT 作為核酸藥物載體通常具有較低的轉(zhuǎn)染效率。Saleh 等[45]采用膜活性肽 LK15 對 TAT進行修飾得到 Tat-LK15，采用 Tat-LK15/DNA 復合物轉(zhuǎn)染人纖維肉瘤細胞 HT1080 或人結腸癌細胞 HT29，可使 TAT 的轉(zhuǎn)染效率分別提高10 倍和 100 倍。此外，采用 TAT 對納米載體進行修飾，不僅可以提高細胞攝取效率，也可以提高載體的入核效率。Malhotra 等[46]將 TAT 與殼聚糖通過 PEG 共價綴合并制備形成 CS-PEG-TAT 納米粒，在 pH 6 的條件下，該載體能夠介導 siGLO-綠色轉(zhuǎn)染指示劑高效入胞，熒光強度顯著高于對照組。Wang 等[47]證實了 TAT 修飾的殼聚糖陽離子膠束能夠?qū)崿F(xiàn)阿霉素和 p53 基因核靶向遞送。

3.2 R15

Zhang 等[48]將富含精氨酸陽離子肽 R15 通過可還原的二硫鍵綴合在聚乙二醇-丙交酯（PEG-b-PLA）上得到氧化還原敏感型嵌段聚合物 PEG-PLA-SS-R15，其在水溶液中形成具有殼-核結構的膠束（micelles），與 miR-21 共孵育得 micelleplexes，粒徑（19.9 ± 3.0）nm、zeta 電位（4.95 ±0.43）mV。研究表明，micelleplexes 在腦脊液中比在人血漿中具有更高的穩(wěn)定性，有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病的治療。

3.3 R9

Yoo 等[49]將改性的九聚精氨酸（mR9）通過二硫鍵聚合成具有氧化還原敏感型的分支狀高聚物 B-mR9。研究表明，當 N/P = 15 時，B-mR9/pDNA 對 HEK293 細胞、HeLa 細胞和 SKOV3 細胞的轉(zhuǎn)染效率分別為 37.57%、50.05% 和 31.30%，顯著高于 R9/pDNA 和 mR9/pDNA；當 N/P = 10 時，B-mR9/siVEGF 能使 HeLa 細胞、SKOV3 細胞和 NCI-H460 細胞中 VEGF 蛋白表達下調(diào) 33.10%、55.20% 和 80.29%；在人肺癌細胞株 NCI-H460 荷瘤小鼠模型中，B-mR9/siVEGF 能夠靶向至腫瘤部位，顯著抑制瘤體積的增長。

3.4 魚精蛋白

Yu 等[50]將低分子量的魚精蛋白（LMWP）與 siRNA以 PEG 作為交聯(lián)劑通過二硫鍵連接起來形成LMWP-PEG-S-S-siRNA 共價綴合物，與 LMWP/siRNA 絡合物相比，該共價綴合物不易產(chǎn)生聚集現(xiàn)象；研究表明，LMWP-PEG-S-S-siRNA 可介導 siRNA 高效進入人乳腺癌細胞（綠色熒光蛋白標記）MDA-MB-231-EGFP，誘導 EGFP 表達下調(diào)至 21.21%，轉(zhuǎn)染效果顯著優(yōu)于 LMWP/siRNA（41.32%）。

4 基于陽離子的無機納米粒核酸藥物納米載體

無機納米粒作為藥物遞送載體具有良好的生物相容性，其制備簡單、粒徑和表面性質(zhì)可控、易于修飾、載藥量大。部分無機納米粒經(jīng)過陽離子材料修飾后用于核酸類藥物的體內(nèi)遞送，如金納米粒（AuNPs）、氧化鐵納米粒、碳納米管（CNTs）、二氧化硅納米粒（SiNPs）及上轉(zhuǎn)換納米粒（UCNPs）等。

4.1 金納米粒

AuNPs 的直徑為 10 ~ 20 nm，是一種具有多種生物學功能的新型材料。Lee等[51]采用具有還原性的鄰苯二酚與支鏈 PEI（25 kD）形成的共價綴合物 PEI-g-catechol（PEI-C）對 AuNPs 進行修飾得到 PEI-C-AuNPs，通過控制 PEI-C 中鄰苯二酚的取代度可調(diào)控 PEI-C-AuNPs的粒徑和表面性質(zhì)；研究結果表明，采用 PEI-C-AuNPs-5 將 GFP siRNA 遞送至人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細胞 MDA-MB-435，可誘導 GFP 表達下調(diào)至（27.8 ± 4.3）%，與 bPEI/siRNA 具有相當?shù)幕虺聊剩?1.0 ± 3.7）%。

4.2 氧化鐵納米粒

氧化鐵納米粒作為核酸藥物遞送載體具有尺寸小、比表面積大、無免疫原性等優(yōu)勢，其在體內(nèi)不易降解成有毒物質(zhì)，多以原型排出。氧化鐵納米粒具有超順磁性，在外加磁場的作用下，可定向移動，實現(xiàn)藥物的靶向遞送。Lee等[52]將超小型超順磁性氧化鐵納米粒子（USPIO）包裹于 PDMA-b-PCL 陽離子膠束的疏水核心，用該載體共遞送7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）和 VEGF siRNA，制備形成 SN-38/USPIO-loaded siRNA-PEG 膠束（粒徑 237.7 nm、PDI 0.106、Zeta 電位為 34.2 mV）；在人結直腸癌細胞 LS174T 荷瘤小鼠模型中，USPIO 的加入，能夠顯著增加 SN-38 和 VEGF siRNA 的抑瘤效果。此外，USPIO 納米?？捎糜诖殴舱癯上?，實時監(jiān)測治療效果。Shi 等[53]通過微乳液法制備了具有殼核結構的四氧化三鐵磁性二氧化硅納米粒 Fe3O4@SiO2，并采用聚丙烯胺鹽酸鹽（PAH）對其進行修飾，得到表面電位為正的磁性納米粒 Fe3O4@SiO2/PAH；在外加磁場的作用下，該磁性納米粒可介導 pDNA 有效遞送至 HeLa 細胞，實現(xiàn) pDNA 在 HeLa 細胞中高表達。

4.3 碳納米管

碳納米管（CNTs）是一種惰性載體，須經(jīng)過功能化修飾才可用于核酸藥物體內(nèi)遞送。CNTs 包括單壁碳納米管（SWNT）和多壁碳納米管（MWNT）兩種結構，通常SWNT 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于 MWNT[54]。Ohta 等[55]采用PEG 和陽離子肽(KWKG)7對 SWNT 進行修飾，得到 SWCNT-(KWKG)7-(PEG)12，將其與 pDNA 共孵育形成的納米復合物 SWCNT-(KWKG)7-(PEG)12/pDNA，該納米復合物具有良好的穩(wěn)定性，即使在細胞培養(yǎng)基中也能穩(wěn)定存在24 h；該載體能夠?qū)⒕幋a mKO2 的 pDNA 有效遞送至人非小細胞肺癌細胞 A549，使得細胞中 mKO2 熒光蛋白的表達顯著增強（相對熒光強度 25 ~ 60）。

4.4 二氧化硅納米粒

Rejeeth 和 Salem[56]制備了一種新型陽離子熒光硅納米顆粒（LSNs），用其遞送 p53 基因用于乳腺癌的治療。研究表明，p53-EGFP/LSNs 納米粒具有良好的血清穩(wěn)定性，可實現(xiàn) p53-EGFP 在體內(nèi)外高效遞送，使得 p53 和 EGFP mRNA 在較長時間內(nèi)持續(xù)表達，細胞凋亡率為32.09%，優(yōu)于市售轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectin（28.00%）。Zarei 等[57]采用 PEI對磷酸鹽修飾的介孔二氧化硅納米粒（PMSNs）進一步修飾得到表面荷正電的納米載體 PMSNs-PEI，該載體能夠有效負載綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pGFP），與 PEI/pGFP 相比，PMSNs-PEI/pGFP 可顯著增強小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞Neuro-2 A 中綠色熒光蛋白的表達。

4.5 上轉(zhuǎn)化納米粒

Song 等[58]采用溶劑熱法合成了上轉(zhuǎn)化納米粒（UCNPs），并采用薄膜分散法在 UCNPs 表面包裹一層陽離子磷脂 CDO14，形成粒徑為 45 ~ 50 nm、zeta 電位約 54.4 mV 的固體脂質(zhì)納米粒（CSLNs），該載體同時具有核酸遞送和生物成像的功能。凝膠電泳實驗表明，CSLNs/siRNA 質(zhì)量比大于 4 時，能夠?qū)崿F(xiàn) siRNA 的全部包載；將 CSLNs與人肺癌細胞 A549 共孵育 4 h，采用 980 nm 的激發(fā)光源，結果表明CSLNs均勻地分布在細胞質(zhì)中，且具有較低的細胞毒性，可將穩(wěn)定表達熒光素酶的 siRNA 遞送至 A549 細胞，基因沉默效率為 70%。

5 小結

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)與基因異常密切相關，核酸藥物在腫瘤治療中具有獨特優(yōu)勢。核酸藥物易被核酸酶降解，因此需要借助適宜載體才能實現(xiàn)核酸藥物體內(nèi)高效遞送。根據(jù)核酸藥物荷負電的理化特性，近年來，科學家探索了諸多陽離子納米載體作為核酸藥物的遞送工具。除了 2018 年8 月美國 FDA 批準首個 siRNA 藥物（OnpattoTM，patisiran，用于遺傳性甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白淀粉樣變性引起的周圍多發(fā)性神經(jīng)疾病，將 siRNA 包裹在脂質(zhì)納米顆粒中經(jīng)靜脈輸注給藥）以外，時至今日，仍未見全身給藥的抗腫瘤核酸藥物納米制劑應用于臨床。之所以如此，不僅是因為核酸藥物易被核酸酶降解失活，還因為核酸藥物體內(nèi)遞送載體及載核酸納米粒的穩(wěn)定性、安全性、有效性和質(zhì)量可控性等一系列的關鍵性問題均未得以解決，限制了核酸藥物向臨床轉(zhuǎn)化的進程。

目前，已有許多研究表明陽離子納米遞送載體在體內(nèi)外均展現(xiàn)了良好的基因轉(zhuǎn)染效果，也有通過構建靶向和（或）環(huán)境敏感的智能型納米載體，實現(xiàn)抗腫瘤核酸藥物的靶向遞送和控制釋放，部分載體介導的抗腫瘤核酸藥物已經(jīng)進入臨床研究階段，但距離核酸藥物廣泛上市還存在差距。隨著科學家的探究和積累，抗腫瘤核酸藥物體內(nèi)高效、安全、穩(wěn)定的遞送一定會實現(xiàn)。

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國家自然科學基金（81673383、81603063、81803479）

夏桂民，Email：xiaguimin@126.com

2019-11-08

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.014