蒙建州，王瀟，關(guān)艷，肖春玲，劉憶霜

·論著·

以金色分枝桿菌為模式菌株篩選抗結(jié)核活性化合物可行性研究

蒙建州，王瀟，關(guān)艷，肖春玲，劉憶霜

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所重點室

評估以金色分枝桿菌作為結(jié)核分枝桿菌模式菌株篩選抗結(jié)核抑制劑的可行性。

以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv 建立細(xì)胞水平的抑制劑高通量篩選模型，對本單位化合物庫部分樣品進(jìn)行篩選，獲得具有抗結(jié)核活性的化合物；進(jìn)一步比較模式菌株金色分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌及谷氨酸棒狀桿菌對具有較強(qiáng)抗結(jié)核活性樣品的敏感性差異。

利用基于結(jié)核分枝桿菌建立的全細(xì)胞篩選模型，從本單位化合物庫的 5 萬個樣品中篩選得到 67 個最低抑菌濃度≤ 5 μg/ml 的化合物。對金色分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌和谷氨酸棒狀桿菌有抑制活性的樣品分別有22 個（32.84%）、10 個（14.93%）、12 個（17.91%）和6 個（8.96%），其中抑菌活性與抗結(jié)核活性差異在 4 倍以內(nèi)的樣品分別有 16 個（72.73%）、5 個（50%）、7 個（58.33%）和 3 個（50%）。

相對于其他 3 種模式菌株，金色分枝桿菌對本單位樣品庫化合物的敏感性與結(jié)核分枝桿菌的最為接近，以金色分枝桿菌為模式菌株開展抑制劑篩選研究更有可能獲得具有抗結(jié)核活性的化合物。

結(jié)核分枝桿菌； 金色分枝桿菌； 表型篩選； 抗結(jié)核化合物

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（，Mtb）感染引起的傳染性疾病，具有高致病性和致死性的特點。2017 年全球結(jié)核病患者大約有 1000 萬，其中死于結(jié)核病的患者有 130 萬[1]。目前結(jié)核病的治療主要是采用 WHO 推薦的 DOTS 方案，治療周期長達(dá)半年。由于治療周期長、患者依從性差以及 Mtb 獨特的生理特征，結(jié)核病出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥問題。2017 年，全球利福平耐藥新發(fā)病例有 55.8 萬（82% 為耐多藥結(jié)核病患者），其中 13% 的病例發(fā)生在我國[1]。傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物不能有效治療由耐藥 Mtb 感染引起的結(jié)核病，其治愈率僅為 55%。新型抗結(jié)核藥物研制進(jìn)展緩慢，近五十年來僅有貝塔奎寧和德拉瑪尼兩種具有全新結(jié)構(gòu)的抗結(jié)核藥物被批準(zhǔn)用于治療耐藥結(jié)核病[2-3]。但這兩種藥物具有較強(qiáng)的心臟毒性，而且臨床很快出現(xiàn)了對它們具有耐藥性的 Mtb 突變株[4-5]。因此迫切需要開發(fā)出新型抗結(jié)核藥物用于治療由耐藥 Mtb 感染引起的結(jié)核病。

貝塔奎寧和德拉瑪尼的成功研制表明具有全新作用機(jī)制、結(jié)構(gòu)新穎的化合物能夠成功避開 Mtb 已有的耐藥機(jī)制。目前獲得新結(jié)構(gòu)抑制劑的研究策略主要有兩種：一是基于酶的生化反應(yīng)原理建立高通量篩選模型，尋找具有抗菌活性的酶抑制劑，但通過這種方法難以得到有抑菌活性的樣品[6]；另一種方法是建立細(xì)胞水平的抑制劑篩選模型，從樣品庫中直接篩選到具有抑菌活性的樣品。傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物（或其先導(dǎo)物）都是利用全細(xì)胞篩選模型獲得的，新型抗結(jié)核藥物貝塔奎寧、德拉瑪尼、PA824以及利奈唑胺等的先導(dǎo)物也是通過這種方式發(fā)現(xiàn)的[7]。因此在細(xì)胞水平開展抑制劑的篩選研究更有可能獲得具有開發(fā)價值的先導(dǎo)物。但是生長緩慢且具有很強(qiáng)致病性的 Mtb 難以直接用于大量樣品的篩選研究，而與 Mtb 遺傳背景接近、不具有致病性且生長快速的分枝桿菌如恥垢分枝桿菌（，Msm）、海分枝桿菌（，Mma）、金色分枝桿菌（，Mau）和牛結(jié)核分枝桿菌 BCG 以及與 Mtb 具有相似細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的谷氨酸棒狀桿菌（，Cgl）常被用作模式菌株篩選抗結(jié)核抑制劑[8-12]。其中以 Mau和 BCG 對臨床抗結(jié)核藥物的敏感性與 Mtb 最為接近[13-14]。Altaf 等[15]采用 Mtb、Msm 和 BCG 對來自 LOPAC、NIH 和 Spectrum 的化合物樣品進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn) 3 種菌株對不同來源樣品的敏感性不一致，篩選結(jié)果的陽性率與菌種及樣品特征都有相關(guān)性。因此選擇合適的模式菌株針對特定樣品庫開展抑制劑篩選研究能夠提高篩選效率、降低假陰性率和假陽性率，盡可能多地獲得具有抗結(jié)核活性的苗頭化合物。

本實驗室長期從事抗結(jié)核抑制劑篩選研究，擁有 Msm、Mma、Mau 和 Cgl 4 種 Mtb 模式菌株。本研究將通過比較它們對從本單位化合物庫（部分）樣品中得到的抗結(jié)核化合物的敏感性差異，從而挑出敏感性與 Mtb 一致性最高的菌株，以便于采用該菌株對本單位化合物庫樣品開展全面的篩選研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Mtb H37Rv（ATCC 27294）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細(xì)菌免疫室保存；Mau（ATCC23366）、Msm mc2155、Mma BAA-535及 Cgl（ATCC 13032）均購自 ATCC。

1.1.2 化合物樣品 篩選樣品來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室化合物庫保藏的 5 萬種單體化合物，濃度為 10 mg/ml；異煙肼（isoniazide，INH）購自美國Sigma 公司，用 DMSO 溶解配成 10 mg/ml 的溶液，于 4 ℃保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)分枝桿菌的培養(yǎng)基 7H9、7H10 及其添加劑 OADC和培養(yǎng) Cgl 的BHI 培養(yǎng)基均購自美國BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 采用接種環(huán)蘸取保存在–80 ℃的 Mtb H37Rv、Mau、Msm 和 Mma 于 7H10固體培養(yǎng)基（含 10% OADC）劃線，靜置培養(yǎng)直至長出單菌落（Mtb H37Rv、Mau 和Msm 最適生長溫度為 37 ℃，Mma 最適生長溫度為 28 ℃）；挑取單菌落接種于 5 ml 7H9培養(yǎng)基（含 10% OADC 和 0.05% Tween80），靜置培養(yǎng)；它們生長至平臺期的時間分別為 10 ~ 14、12 ~ 14、2 ~ 3 及 5 ~ 7 d。將保存于–80 ℃的 Cgl 在含有 BHI 的瓊脂平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)；挑取單菌落接種于 5 ml BHI 培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng) 12 ~ 14 h 至平臺期。

1.2.2 高通量篩選模型建立及評價

1.2.2.1 Mtb生長情況監(jiān)測 于 96 孔板第1 列加入 0.6 μl INH 溶液（陽性對照，p），第 2 列加入 0.6 μl溶劑DMSO（陰性對照，n），于第 1、2、3（正常生長）列加入 200 μl接種有對數(shù)期 Mtb H37Rv 的 7H9 培養(yǎng)液（終濃度600≈ 0.1），第4 列加入不含菌液的培養(yǎng)基 200 μl（空白對照，b）。將 96 孔板用保鮮膜密封、37 ℃靜置培養(yǎng)并采用酶標(biāo)儀測定菌株 7 d 內(nèi)600光吸收的變化情況，制作生長曲線。

1.2.2.2 高通量抑制劑篩選模型建立 對“1.2.2.1”中測定的 Mtb 在液體培養(yǎng)基的600光吸收值，采用 Z'因子評估高通量篩選模型的可靠性。其計算公式如下：

表示600吸收值的標(biāo)準(zhǔn)差，表示600吸收值的平均值。

1.2.3 高通量抑制劑篩選 利用建立的高通量篩選模型對本單位化合物庫部分樣品（約 5 萬個）進(jìn)行篩選，樣品初篩濃度為 30 μg/ml。篩選體系如表 1 所示。

表 1 Mtb H37Rv 高通量抑制劑篩選體系

注：–表示不添加相應(yīng)成分。

Note: – Indicated that the corresponding ingredients were not added.

將 96 孔板用保鮮膜封閉、37 ℃靜置培養(yǎng)7 d 后，測定600光吸收值并計算化合物對菌株生長的抑制率。抑制率 IR 計算公式如下：

1.2.4 化合物抗結(jié)核活性測定 采用二倍稀釋法在 96 孔板中測定“1.2.3”獲得的抑制劑對Mtb H37Rv 的最低抑制濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC）。第 1 排和第 8 排加入200 μl 7H9 培養(yǎng)基以防止干燥。測試濃度最高為 20 μg/ml，最低為 0.625 μg/ml，每個濃度做 3 個平行。溶劑 DMSO 為陰性對照，INH為陽性對照。

1.2.5 化合物對模式菌株的抑制活性測定 采用二倍稀釋法測定“1.2.4”項中對 Mtb H37Rv MIC ≤ 5 μg/ml 的化合物對 Mau、Msm、Mma 和 Cgl的 MIC值。最高測定濃度為 32 μg/ml，最低濃度為 0.0625 μg/ml，每個濃度設(shè) 3 個平行，對照組設(shè)置同“1.2.4”。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌生長情況

采用生長緩慢的 Mtb建立細(xì)胞水平的高通量抑制劑篩選模型時，在兼顧模型的靈敏性和重復(fù)性的前提下應(yīng)盡量節(jié)約時間。我們首先監(jiān)測了 Mtb H37Rv在 7 d 內(nèi)的生長情況。從圖 1 可以看出，Mtb H37Rv 在含有 0.3% DMSO 的 7H9 培養(yǎng)基中的生長情況與正常培養(yǎng)基中的一致，表明 DMSO 在此濃度下不會影響菌株的生長。本研究中樣品初篩濃度為 30 μg/ml，因此也將陽性對照樣品 INH 的濃度設(shè)為 30 μg/ml。而 INH 對 H37Rv 的 MIC 值為 0.1 ~ 0.2 μg/ml[16]，所以菌株在含有 30 μg/ml INH 的培養(yǎng)基中不能生長，與本研究實驗現(xiàn)象一致。

2.2 篩選模型評估

根據(jù)“2.1”項實驗結(jié)果，采用公式⑴對體系在第 5 ~ 7 天的光吸收600值進(jìn)行計算，3 個 Z' 值分別為 0.07、0.70 和 0.76，通常情況下 Z' 值大于 0.5 的篩選模型被認(rèn)為是可靠的[17]。本研究中，Mtb H37Rv 在第 5 天后進(jìn)入對數(shù)生長期，600吸收值迅速提高，模型的 Z' 值從第 6 天開始超過 0.5。Z' 越大，模型的可靠性也越高，為了兼顧可靠性和實驗效率，我們的篩選模型將在加樣后第7 天觀測實驗結(jié)果。

2.3 高通量抑制劑篩選

利用建立的篩選模型對本單位化合物庫的50 000 個單體樣品進(jìn)行篩選，并根據(jù)公式⑵計算化合物對 Mtb 的抑制活性。為了不遺漏骨架結(jié)構(gòu)新穎的化合物，我們將抑制率大于 50% 的化合物定義為陽性樣品，該抑制率大于同等濃度下 D-環(huán)絲氨酸對野生 Mtb 的抑制率[18]。本實驗中我們總共獲得了 528個陽性樣品，陽性率為 1.05%。

圖 1 Mtb H37Rv 在 7 d 內(nèi)的生長情況

Figure 1 Growth curve of Mtb H37Rv incubated for 7 days

圖 2 抗結(jié)核化合物 MIC 值分布情況

Figure 2 Minimal inhibitory concentration (MIC) distributions of anti-MTB compounds

2.4 化合物抗結(jié)核活性測定

進(jìn)一步測定了“2.3”項中獲得的抑制劑對 Mtb 的 MIC 值，樣品的 MIC 值分布情況如圖 2 所示。從圖中可以看出，絕大多數(shù)樣品對 Mtb的抑制活性較弱，MIC 值大于 20 μg/ml 的有271 個，占比 51.33%；MIC 值為 20 μg/ml 的樣品有 113 個，占比 21.40%；MIC 值為 10 μg/ml 的樣品有 77 個，占比 14.58%。MIC 值小于 10 μg/ml的化合物有 67 個，占比 12.69%，其中 MIC 值為 5 μg/ml 的樣品有 27 個，2.5 μg/ml 的樣品有 9 個，1.25 μg/ml 的樣品有 13 個，≤ 0.625 μg/ml 樣品有 18 個。

2.5 化合物對模式菌株的抑制活性

由于獲得的活性樣品較多，為了降低工作量，我們只對具有較強(qiáng)抗結(jié)核活性（MIC 值≤ 5 μg/ml）的樣品開展了后續(xù)研究。這些樣品中共有 24 個化合物分別對 Mau、Msm、Mma 和 Cgl 表現(xiàn)出抑制活性。從表 2 中可以看出，對 Mau、Msm、Mma 和 Cgl 具有抑制活性的樣品分別有 22 個（32.84%）、10 個（14.93%）、12 個（17.91%）和 6 個（8.96%）。其中抑菌活性與抗結(jié)核活性相當(dāng)（MIC 值差異≤ 4倍）樣品的數(shù)目分別為 16 個（72.73%），5 個（50%），7 個（58.33%）和 3 個（50%）。這些活性樣品中，只有 MCC53 對所有菌株都表現(xiàn)出抑制活性。

同時，我們也對 Mtb 及本研究中所采用的模式菌株測試藥物敏感性需要耗費的時間做了統(tǒng)計圖，如圖 3 所示。從中可以看出，采用模式菌株 Mau 和 Cgl 開展抑制劑篩選研究耗時最短，僅需 12 h 就能獲得實驗結(jié)果。結(jié)合表 2 可知，相對于其余 3 種模式菌株，采用 Mau 開展抗結(jié)核抑制劑篩選研究能夠快速獲得具有潛在研究價值的先導(dǎo)物樣品。

3 討論

本實驗室長期從事抗結(jié)核藥物篩選研究，針對 Mtb 關(guān)鍵酶 GuaB2、Dxs、Alr、IspD、Icl 和 Sd 等建立了分子水平的抑制劑高通量篩選模型并對本單位化合物庫樣品進(jìn)行篩選，獲得了 10 余個具有抗結(jié)核活性的酶抑制劑[19-24]，而多數(shù)酶抑制劑并不具有抗菌活性。出現(xiàn)這種情況的主要原因有兩點：首先是 Mtb 關(guān)鍵酶作為藥物靶標(biāo)的理論基礎(chǔ)有待驗證，其次酶抑制劑能否穿過 Mtb 復(fù)雜的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是其能否發(fā)揮抗菌作用的重要因素。而細(xì)胞水平的抑制劑篩選模型是以菌株的存活或生長為指標(biāo)，從而直接獲得具有抑菌活性的化合物樣品。到目前為止幾乎所有的抗結(jié)核藥物（或其先導(dǎo)物）都是通過這種篩選方式得到的[7]。這也表明在全菌水平篩選抑制劑更有可能獲得具有成藥前景的先導(dǎo)物，同時也能發(fā)現(xiàn)具有全新作用機(jī)制的化合物。

先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)研究是藥物開發(fā)過程中極為重要的環(huán)節(jié)，而先導(dǎo)物的質(zhì)量直接關(guān)系到化合物最終能否被開發(fā)為藥物[25]。多年來，本實驗室采用分子水平的高通量篩選模型對本單位化合物庫的 15 萬樣次合成樣品進(jìn)行篩選，獲得了多個具有抗結(jié)核活性的樣品，但是藥物靶向篩選方法的局限性使得我們不可能全面掌握化合物庫中樣品的抗結(jié)核活性，也不可能對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘。因此有必要采用細(xì)胞水平的篩選模型對這些樣品進(jìn)行再次篩選。利用 Mtb 篩選抗結(jié)核化合物耗時耗力、且嚴(yán)重威脅著實驗人員的健康，而采用模式菌株開展研究不僅能降低實驗者被感染的風(fēng)險，還能提高研究效率。不同模式菌株與 Mtb 的遺傳背景、毒力及感染能力存在很大差異，采用不同模式菌株從同一化合物庫中篩選獲得活性化合物的陽性率是不一致的[15]。為了最大限度地獲得具有抗結(jié)核活性的樣品，我們開展了本項研究。通過比較 Mau、Msm、Mma 及 Cgl 對化合物庫部分樣品中篩選得到的抗結(jié)核化合物的敏感性差異，發(fā)現(xiàn) Mau對這些樣品的敏感性最高。我們可以推斷出基于 Mau 建立細(xì)胞水平的抑制劑篩選模型開展實驗，能夠快速發(fā)現(xiàn)化合物庫中近 3 成的抗結(jié)核樣品，而其中 7 成樣品的抗結(jié)核活性能被準(zhǔn)確預(yù)測。

表 2 抗結(jié)核化合物對模式菌株的抑制活性

圖 3 Mtb 及模式菌株測定藥物敏感性耗時情況

Figure 3 Time for determining drug sensitivity in Mtb and its model strains

本研究中我們獲得了 500 余個具有抗結(jié)核活性的化合物樣品，在此基礎(chǔ)上我們將對這些樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞水平的毒性測試，排除與現(xiàn)有抗結(jié)核藥物結(jié)構(gòu)類似的化合物和毒性較大的樣品，進(jìn)一步測定剩余樣品對臨床耐藥 Mtb 的抑制活性，最終獲得結(jié)構(gòu)新穎、毒性較低、對耐藥 Mtb 具有抑制活性的苗頭化合物；同時將采用Mau 建立細(xì)胞水平的抑制劑篩選模型對化合物庫剩余 10 萬樣品進(jìn)行篩選，從而掌握本單位樣品庫全部樣品的抗結(jié)核活性情況，最終建立獨具特色的抗結(jié)核活性樣品庫，為開發(fā)抗結(jié)核藥物奠定基礎(chǔ)。

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Study on the feasibility of searching anti-tuberculosis agents using Mycobacterium aureus

MENG Jian-zhou, WANG Xiao, GUAN Yan, XIAO Chun-ling, LIU Yi-shuang

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

We aim to evaluate the feasibility of screening for anti-tuberculosis agents using(Mau).

Firstly, a phenotypic high-throughput screening model was constructed using(Mtb) H37Rv to screen through sub-pool of our chemical-library for anti-tuberculosis agents, and their minimum inhibitory concentrations (MIC) to Mtb were tested via double broth dilution method. The best surrogate was determined by comparing sensitivities of Mau,(Msm),(Mma) and(Cgl) to compounds with potent anti-tuberculosis activities.

Via the screening model, we obtained 67 compounds with potent anti-tuberculosis activities (MIC ≤5 μg/ml). Among these compounds, 22 (32.84%), 10 (14.93%), 12 (17.91%) and 6 (8.96%) displayed antibacterial activities to Mau, Msm, Mma and Cgl, respectively. Comparing with their anti-tuberculosis activities, 16 (72.73%), 5 (50%), 7 (58.33%) and 3 (50%) of these active compounds demonstrated < 4 times discrepancies in antibacterial potencies respectively.

Among these bacteria, Mau is the most suitable surrogate of Mtb used for searching anti-tuberculosis agents from our chemical library.

;; Phenotypic screening; anti-Mtb agents

LIU Yi-shuang, Email: rememberfrost@163.com

國家自然科學(xué)基金（81803412）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-1-013）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助（3332019084）

劉憶霜，Email：rememberfrost@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.009

2020-04-06