李建宋，李亞，王繼棟，郝之奎，薛長艷

·論著·

高效抗腫瘤藥物煙曲霉素的分離純化及雜質(zhì)分析

李建宋，李亞，王繼棟，郝之奎，薛長艷

318000 浙江，臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所（李建宋、郝之奎、薛長艷）；318000 臺州，浙江海正藥業(yè)股份有限公司（李亞）；313000 浙江，湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（王繼棟）

開發(fā)一種高純度煙曲霉素的分離純化工藝，并對煙曲霉素中的主要雜質(zhì)進行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定。

發(fā)酵液采用全料液萃取，以煙曲霉素收率為指標篩選最佳萃取溶劑，優(yōu)化萃取條件，以甲醇和二氯甲烷混合溶液進行結(jié)晶，通過 HPLC 對煙曲霉素晶體中的主要雜質(zhì)進行分離純化，并采用核磁共振和質(zhì)譜分析鑒定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。

以甲基叔丁基醚為萃取溶劑得到的煙曲霉素收率最高，當甲基叔丁基醚:發(fā)酵液體積比為 2:1 時，萃取收率大于 85%，再經(jīng)過兩次結(jié)晶可以得到純度 95% 以上的煙曲霉素晶體，分離并鑒定了煙曲霉素晶體中的兩個主要雜質(zhì)。

通過對煙曲霉素提取工藝研究，確定了較優(yōu)的工藝條件，該方法具有易操作、純度高、收率高、成本低的特點，適合工業(yè)化生產(chǎn)，煙曲霉素中兩個主要雜質(zhì)是煙曲霉素類似物，通過雜質(zhì)鑒定為煙曲霉素質(zhì)量控制和安全性評價提供支持。

煙曲霉素； 分離純化； 雜質(zhì)； 結(jié)構(gòu)鑒定

煙曲霉素（fumagillin）是從煙曲霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中首次分離得到的具有多種生物活性的代謝產(chǎn)物[1-2]。最初用于治療蜜蜂和魚類的微孢子蟲病，這也是當前治療蜜蜂微孢子蟲病的唯一有效藥[3-4]。1990 年，Ingber等[5]發(fā)現(xiàn)煙曲霉素能抑制腫瘤血管再生，從而阻斷腫瘤周圍血液供給，達到治療癌癥的作用，其作用機制是在體內(nèi)共價修飾甲硫氨酸氨肽酶-2（MetAP-2）活性位點中的 His-231，使酶失活，進而特異性地抑制血管內(nèi)皮細胞的生長和增殖，且作用方式是不可逆的。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉素及其半合成衍生物 TNP-470 和 CKD-732 能減少食物吸收、體重、脂肪量和脂肪細胞的大小，是治療肥胖癥的潛在藥物[6]；煙曲霉素的半合成衍生物 TNP-470、PPI-2458 和 CKD-732 已用于治療人類癌癥的臨床試驗，通過以 MetAP-2 為作用靶標破壞腫瘤血管[7-8]。

目前，關(guān)于煙曲霉菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物煙曲霉素及其衍生物的優(yōu)化培養(yǎng)方法，僅有很少的報道，并且煙曲霉素效價低，很難用于工業(yè)化生產(chǎn)或應(yīng)用[9-10]。國內(nèi)外對產(chǎn)煙曲霉素菌株研究較多的為。2003 年，Yang 等[11]針對NRRL 2436 菌株，對其培養(yǎng)基進行了碳氮源的優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基較初始培養(yǎng)基產(chǎn)煙曲霉素能力提高了 15 倍。同年，Yang 等[12]通過在NRRL 2346 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 1.5% 的羧甲基纖維素或 0.3% 羧聚乙烯，使菌體發(fā)酵形態(tài)從單一大團變成細小顆粒狀，穩(wěn)定了發(fā)酵的重復(fù)性，進而使效價提高 3 ~4 倍（150 ~ 240 mg/L）。然而，是致病菌株，能夠引起支氣管肺曲霉菌病和侵襲性肺曲霉病等疾病，2010 年后，非致病性菌株成為產(chǎn)煙曲霉素的替代菌株。Barboráková 等[13]于 2012 年研究了不同葡萄糖濃度、不同培養(yǎng)條件對FCB353 菌株產(chǎn)煙曲霉素的影響，發(fā)現(xiàn)添加 1% 葡萄糖的礦物鹽培養(yǎng)基，22 ℃靜態(tài)培養(yǎng) 4 d 為最佳合成煙曲霉素條件，效價達到 82.5 mg/L。

關(guān)于高純度煙曲霉素提取工藝的研究報道較少。薛曉峰等[14]報道了一種用大孔樹脂吸附獲得煙曲霉素粗提物的方法，但是該方法生產(chǎn)周期長，煙曲霉素易降解，并且煙曲霉素溶解性較差，大孔樹脂上樣困難。因此，亟需開發(fā)簡單高效的煙曲霉素提取和純化工藝，實現(xiàn)煙曲霉素產(chǎn)品的市場化。

本研究團隊篩選得到一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的煙曲霉素產(chǎn)生菌，通過選育優(yōu)化獲得一株高產(chǎn)菌株1516，煙曲霉素效價可以穩(wěn)定在 1100 mg/L，適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，因此本研究對煙曲霉素提取工藝進一步研究開發(fā)，并對影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要雜質(zhì)進行分析研究，為煙曲霉素質(zhì)量標準的建立及安全性評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 原始菌株是一株青霉（保藏號 CGMCC No.14144），由本實驗室保存。原始菌株經(jīng)誘變選育、配方優(yōu)化得到煙曲霉素高產(chǎn)菌株1516。煙曲霉素標準品純度 99.99%，由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及儀器 核磁共振儀 Bruker Avance III 400 MHz 購自德國 Bruker 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 REC-2000 購自上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜 Agilent 1260 購自美國 Agilent 公司；色譜柱為 HALO C18，規(guī)格 4.6 mm × 150 mm，粒徑為2.7 μm；液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）：Agilent1260 液相系統(tǒng)與 Agilent-6540 QTOF 質(zhì)譜系統(tǒng)聯(lián)用；色譜級甲醇、乙腈等試劑購于美國 Merck 公司；分析級正庚烷、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二氯甲烷等試劑購于杭州化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)基配方（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，pH（6.0 ± 0.1）。高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至 50 ~ 60 ℃擺放斜面，在超凈工作臺使用無菌接種環(huán)接種一環(huán)孢子，涂布均勻后置于 25 ℃避光培養(yǎng) 3 ~ 5 d。

種子培養(yǎng)基配方（g/L）：葡萄糖 10，淀粉 10，黃豆餅粉 10，酵母抽提粉 5，碳酸鈣 15，硫酸鎂 1.5，硫酸二氫鉀 1，pH（6.0 ± 0.1）。搖瓶裝液量為 30 ml/瓶，高壓蒸汽 121 ℃滅菌20 min。孢子接種量為 105~ 106CFU/ml，培養(yǎng)溫度為（25 ± 1）℃，250 r/min，搖床振蕩培養(yǎng) 24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：蔗糖 80，糊精 20，甘油 40，酵母抽提粉 5，酵母粉 10，酵母膏 10，硫酸鎂 1.5，硫酸二氫鉀 1，碳酸鈣 30，pH（6.0 ± 0.1），在 50 L 發(fā)酵罐中投入 30 L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加 0.05%（體積百分比）泡敵作為消泡劑，121 ℃蒸汽滅菌20 min，待冷卻至 25 ℃后，移入 3 L種子液，培養(yǎng)溫度為（25 ± 1）℃，攪拌轉(zhuǎn)速 200 r/min，通氧量 1.0 vvm（每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值），培養(yǎng) 120 h 后得煙曲霉素發(fā)酵液。

1.2.2 煙曲霉素提取純化

1.2.2.1 煙曲霉素分析方法 標準品配制：精確稱取 20 mg 純度 99.99% 的煙曲霉素標準品溶解于 20 ml 乙腈，超聲 10 min 使其完全溶解；色譜條件：紫外檢測波長 340 nm；流速 0.8 ml/min；進樣量 5 μl；柱溫 25 ℃；時間 40 min；流動相 A：0.1% 的甲酸水溶液（V/V），流動相 B：乙腈與 0.1% 的甲酸（V/V），梯度條件如表 1。

表 1 梯度洗脫條件

煙曲霉素標準曲線繪制：以煙曲霉素標準品 1000 mg/L 為母液，色譜乙腈為溶劑，稀釋成不同濃度（100、200、300、400、500、600、700、800、900 mg/L）的標準溶液，每個梯度做 5 個平行。在色譜條件下進行 HPLC 分析，以各標準品的峰面積 y 對其濃度 x（mg/L）進行線性回歸分析，得到標準曲線回歸方程為 y = 210047x ? 13265，相關(guān)系數(shù)2= 0.9998。以峰面積為橫坐標，根據(jù)回歸方程計算煙曲霉素濃度。

1.2.2.2 煙曲霉素萃取工藝優(yōu)化 選用乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正庚烷和正己烷作為萃取溶劑，分別按萃取溶劑:發(fā)酵液體積比 = 1:1、2:1、3:1、4:1 進行全料液萃取實驗，攪拌速率 150 r/min，攪拌2 h 后靜置分層，待分層后取上層有機相通過 HPLC 分析測定煙曲霉素濃度，與標準品比對計算浸提收率，每個實驗做 3 個平行，結(jié)果取平均值。

1.2.2.3 煙曲霉素結(jié)晶條件優(yōu)化 煙曲霉素在甲醇、乙醇、丙酮、乙腈中的溶解度很低，僅有 6 ~10 g/L，在二氯甲烷、三氯甲烷中的溶解度很高，可以達到 500 g/L，因此煙曲霉素的結(jié)晶原理是用二氯甲烷和甲醇的混合溶液溶解煙曲霉素粗品，然后在減壓攪拌的過程中將二氯甲烷抽離，從而使煙曲霉素慢慢結(jié)晶析出。具體方法如下：煙曲霉素經(jīng)全料液萃取，分液收集有機相，有機相減壓濃縮得到煙曲霉素粗提物，煙曲霉素粗提物用二氯甲烷與甲醇的混合溶劑（二氯甲烷與甲醇的體積比為 1:1）等體積溶解，攪拌至完全溶解后用濾紙過濾，濾液在溫度–10 ℃，壓力–0.08 MPa，攪拌速率 150 r/min 條件下結(jié)晶，1 h 后向結(jié)晶溶液中加入 0.1 倍體積的甲醇，之后每 1 小時加入 0.1 倍體積的甲醇，8 h 后過濾得到煙曲霉素晶體，按同樣的方法進行二次結(jié)晶。每個實驗做 3 個平行，結(jié)果取平均值。

1.2.3 煙曲霉素雜質(zhì)分析

1.2.3.1 雜質(zhì)制備 利用 HPLC 對煙曲霉素主要雜質(zhì)進行制備，制備方法沿用煙曲霉素分析方法，通過連續(xù)進樣收集累積單個雜質(zhì)峰，然后經(jīng)過濃縮、干燥后，置于–20 ℃避光保存。

1.2.3.2 核磁共振分析條件 將約 10 mg 純樣品用氘代甲醇（CD3OD）裝入專用核磁管（0.5 cm × 20 cm）中進行核磁共振掃描。采用 Bruker Avance III400 MHz 配 5 mm BBOF 探頭，觀察頻率 100 MHz，掃描范圍–20 ~ 220 ppm，30° 脈沖角，采樣時間 0.68 s，延遲時間 2 s，掃描次數(shù)5120 次，測定溫度 300 K。

1.2.3.3 液質(zhì)聯(lián)用分析條件 液相分析條件同 1.2.2.1，質(zhì)譜分析條件：電噴霧電離源（ESI），霧化器溫度 325 ℃，霧化器干氣流速 8 L/min，噴霧器壓力 35 psig，噴霧電壓 +3500 V。取適量樣品于進樣瓶中，用乙腈溶解，搖勻，作為樣品檢測溶液進行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

2.1 煙曲霉素全料液萃取實驗

以乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正庚烷和正己烷四種有機溶劑為萃取劑，有機溶劑與發(fā)酵液體積比分別為 1:1、2:1、3:1、4:1，攪拌 2 h，靜置分層，待分層后取有機相通過 HPLC 測定有機相中煙曲霉素的含量，其結(jié)果見圖 1。

由圖 2 可知，隨著有機溶劑與發(fā)酵液體積比增大，煙曲霉素萃取收率增高，在相同條件下，甲基叔丁基醚和乙酸乙酯萃取收率遠遠高于正庚烷和正己烷。當有機溶劑:發(fā)酵液體積比 = 1:1 時，甲基叔丁基醚萃取收率是 70%，乙酸乙酯萃取收率是 67%。當有機溶劑:發(fā)酵液體積比 = 2:1 時，甲基叔丁基醚萃取收率是 89%，乙酸乙酯萃取收率是85%。此時再增大有機溶劑與發(fā)酵液體積比，其萃取收率增加不明顯。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期，選擇甲基叔丁基醚作為最佳萃取溶劑，其與發(fā)酵液體積比為 2:1 進行全料液萃取。

圖 1 煙曲霉素液相色譜圖

Figure 1 HPLC chromatogram of fumagillin

圖 2 四種不同溶劑對煙曲霉素的萃取效果

Figure 2 Effects of four different dissolvent on the yield of fumagillin

2.2 煙曲霉素結(jié)晶實驗

煙曲霉素粗提物經(jīng)過一次結(jié)晶，其 HPLC 純度達到 92.4%，二次結(jié)晶后，煙曲霉素HPLC 純度 95.8%（圖 1），經(jīng)干燥后通過外標法測定煙曲霉素含量為 96.5%，每次結(jié)晶收率 91.2%，說明通過結(jié)晶方式得到的煙曲霉素純度高，收率高。

煙曲霉素晶體經(jīng) NMR 和 ESI-MS 進一步確認了其結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)式如圖 3。煙曲霉素為白色至淡黃色無定型粉末；易溶于二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜等有機溶劑，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚等有機溶劑，難溶于水；電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）457 [M-H]-，分子量為458（圖 4），與其分子式 C26H34O7相吻合。以氘代甲醇（CD3OD）作溶劑進行核磁共振1H-NMR（400 MHz, CD3OD，圖 5）分析，四甲基硅烷（TMS）做內(nèi)標（H0.00）。煙曲霉素1H-NMR（400 MHz，CD3OD）：H1.15（br d，= 13.4 Hz），1.29（s），1.72（s），1.81（s），1.93（m），2.06（br d，= 13.4 Hz），2.13（d，= 11.2 Hz），2.23（m），2.31（m），2.45（m），2.62（d，= 4.0 Hz），2.73（t，= 6.1 Hz），3.06（d，= 4.0 Hz），3.51（s），3.75（br d，= 11.2 Hz），5.27（m），5.78（s），6.00（d，= 15.3 Hz），6.05（d，= 15.3 Hz），6.52（m），6.53（m），6.66（m），6.67（m），7.33（dd，= 11.2，11.0 Hz），7.42（dd，= 11.2，11.3 Hz）。

圖 3 煙曲霉素結(jié)構(gòu)式

Figure 3 Structure of fumagillin

圖 4 煙曲霉素的負離子質(zhì)譜圖

Figure 4 Negative ESI-MS of fumagillin

2.3 煙曲霉素雜質(zhì)分析

通過對煙曲霉素雜質(zhì)制備、分析，鑒定了兩個主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，分別為雜質(zhì) 1 和雜質(zhì) 2，其結(jié)構(gòu)式如圖 6，HPLC 圖譜見圖 1。雜質(zhì) 1 保留時間 Rt = 14.2 min，HPLC 含量 1.5%，在1H-NMR 圖中明顯看出其比煙曲霉素少了一個 -OCH3（H3.51）特征信號，說明雜質(zhì) 1 比煙曲霉素少了一個連氧甲基基團，與其質(zhì)譜數(shù)據(jù) ESI-MS443 [M-H]-，分子量 444 相吻合，雜質(zhì) 1 的1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜分別見圖 7 和圖 8。雜質(zhì) 2 保留時間 Rt = 26.5 min，HPLC 含量 2.6%，在1H-NMR圖中明顯看出其比雜質(zhì) 1 少了一個連氧次甲基（H4.14）特征信號，說明雜質(zhì) 2 比雜質(zhì) 1 少了一個羥基基團，與其質(zhì)譜數(shù)據(jù) ESI-MS427 [M-H]-，分子量 428 相吻合，雜質(zhì) 2 的1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜分別見圖 9 和圖 10。

圖 5 煙曲霉素的核磁共振氫譜

Figure 51H-NMR spectrum of fumagillin

雜質(zhì) 1 ESI-MS443 [M-H]-，分子量為 444（圖 8），分子式為 C25H32O7。1H-NMR （400 MHz，CD3OD）：H1.12（br d，= 13.2 Hz），1.29（s），1.78（s），1.82（s），1.95（m），2.05（br d，=13.2 Hz），1.99（d，= 11.2 Hz），2.21（m），2.32（m），2.65（d，= 4.0 Hz），2.72（t，= 6.1 Hz），3.00（d，= 4.0 Hz），4.14（br d，= 11.2 Hz），5.26（m），5.30（s），6.00（d，= 15.3 Hz），6.03（d，= 15.3 Hz），6.62（m），6.63（m），6.74（m），6.77（m），7.35（dd，= 11.2，11.0 Hz），7.42（dd，= 11.2，11.0 Hz）。

雜質(zhì) 2 ESI-MS427 [M-H]-，分子量為 428（圖 10），分子式為 C25H32O6。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）：H1.16（s），1.18（m），1.29（s），1.77（s），1.82（s），1.84（m），1.95（m），2.05（br d，= 13.4 Hz），2.15（m），2.23（m），2.35（m），2.60（d，= 4.0 Hz），2.79（t，= 6.1 Hz），2.95（d，= 4.0 Hz），5.27（t，= 6.8），5.30（s），6.00（d，= 15.2 Hz），6.52（m），6.53（m），6.66（m），6.67（m），7.34（dd，= 11.2，11.0 Hz），7.39（dd，= 11.2，11.3 Hz）。

圖 6 雜質(zhì) 1 和 2 的結(jié)構(gòu)式

Figure6 Structures of impurities 1 and 2

圖 7 雜質(zhì) 1 的核磁共振氫譜

Figure 71H-NMR spectrum of impurity 1

圖 8 雜質(zhì) 1 的負離子質(zhì)譜圖

Figure 8 Negative ESI-MS of impurity 1

3 討論

煙曲霉素具有多種生物活性，不僅可以治療蜜蜂、魚等動物的微孢子蟲病，而且對人血管瘤具有顯著的抑制活性，其衍生物還可以用于治療肥胖癥和代謝系統(tǒng)疾病，因此，煙曲霉素在未來的應(yīng)用會更加廣泛，所以開發(fā)適合產(chǎn)業(yè)化的煙曲霉素提取工藝具有顯著的社會價值和經(jīng)濟效益。目前，煙曲霉素產(chǎn)生菌效價普遍較低，并且關(guān)于煙曲霉素提取工藝的報道不適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，本實驗室在前期工作中選育到一株高產(chǎn)菌株，效價穩(wěn)定在 1100 mg/L，通過提取工藝優(yōu)化獲得高純度煙曲霉素產(chǎn)品，為煙曲霉素及其衍生物藥物的后續(xù)開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。由于煙曲霉素穩(wěn)定性較差，在儲存和運輸過程中應(yīng)避光避熱，以免降解引入新的雜質(zhì)，在–80 ℃可保存 180 d 不變質(zhì)。

圖 9 雜質(zhì) 2 的核磁共振氫譜

Figure 91H-NMR spectrum of impurity 2

圖 10 雜質(zhì) 2 的負離子質(zhì)譜圖

Figure 10 Negative ESI-MS of impurity 2

雜質(zhì)對煙曲霉素藥效和藥代動力會有一定的影響，雜質(zhì)含量越高，影響也就越顯著，由于個體差異，不同個體對雜質(zhì)敏感度又不同，因此，了解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，控制產(chǎn)品雜質(zhì)含量對藥物的研發(fā)具有重要的意義。通過對影響煙曲霉素質(zhì)量的主要雜質(zhì)進行分析，鑒定了兩個主要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，為煙曲霉素質(zhì)量控制和安全性評價提供支持。同時，煙曲霉素兩個主要雜質(zhì)是煙曲霉素類似物，由菌株1516 發(fā)酵過程代謝產(chǎn)生，為煙曲霉素生物合成的分子機制及定向改造提供依據(jù)。

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Purification and impurity analysis of the highly-efficient antitumor drug fumagillin

LI Jian-song, LI Ya, WANG Ji-dong, HAO Zhi-kui, XUE Chang-yan

Taizhou Vocational & Technical College, Zhejiang 318000, China (LI Jian-song, HAO Zhi-kui, XUE Chang-yan); Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd, Taizhou 318000, China (LI Ya); School of Life Sciences, Huzhou University, Zhejiang 313000, China (WANG Ji-dong)

To develop a separation and purification process of high purity fumagillin, and to isolate and purify the main impurities in fumagillin and identify their structures.

In order to screen and optimize the extraction solvent, the fermentation broth was extracted with whole broth solvent extraction (WBE), and the yield of fumagillin was used as the index. The crystallization was carried out in a mixture of methanol and dichloromethane. The main impurities in fumagillin crystals were separated and purified by HPLC, and the structures of impurities were identified by NMR and mass spectrometry.

The extraction solvent was methyl tert-butyl ether (MTBE), and the extraction yield was higher than 85% when the volume ratio of MTBE:fermentation broth was 2:1. After two crystallization, the crystals with purity above 95% could be obtained. The two main impurities in the fumagillin crystals were separated and identified.

Through the study on the extraction technology of fumagillin, the optimum technological conditions are determined. The method has the characteristics of easy operation, high purity, high yield and low cost, which is suitable for industrial production. The two main impurities are the analogues of fumagillin. The impurity identification provides support for quality control and safety evaluation of fumagillin.

Fumagillin; Separation and purification; Impurities; Structure identification

LI Jian-song, Email: Lijstz1987@163.com

李建宋，Email：lijstz1987@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.011

2020-01-09