熊瑤　王海劍　陸維克　高飛

摘??要：目的：優(yōu)化卡痛試劑卡玻纖工藝。方法：以卡痛試劑卡陰性質(zhì)控結(jié)果為指標(biāo)，采用Plackett-Burman設(shè)計篩選卡痛試劑卡玻纖體系的主要影響因素;再以陰性質(zhì)控結(jié)果為評價指標(biāo)，采用?Box-Behnken設(shè)計對影響卡痛試劑卡陰性質(zhì)控結(jié)果的主要因素進一步優(yōu)化，對實驗數(shù)據(jù)進行多元線性回歸、二項式擬合，分析預(yù)測最佳工藝。結(jié)果：卡痛試劑卡玻纖體系的最佳工藝條件為：Na2HPO4添加量為0.05M，Chemal?LA-9添加量為8.74g/L，pH7.0。結(jié)論：采用Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計法優(yōu)化卡痛試劑卡科學(xué)合理，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠，為卡痛試劑卡的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)。

關(guān)鍵詞：卡痛;膠體金;Plackett-Burman試驗;Box-Behnken試驗

卡痛（Kratom）葉為茜草科的熱帶常綠樹[1]，原生于泰國、馬來西亞、印度尼西亞、緬甸等東南亞國家，其主要成分為生物堿帽柱木堿和7-羥基帽柱木堿[2]。其中主要成分帽柱木堿為白色無定形粉末，分子式為C23H30N2O4，熔點102～106℃，沸點230～240℃，旋光度[ɑ]D+39°（氯仿），可溶于乙醇、氯仿和醋酸，對離體組織有抑制作用，還具有避部麻醉作用。人體內(nèi)帽柱木堿的代謝是通過側(cè)鏈酯的水解、甲氧基的去甲基化、氧化和/或還原轉(zhuǎn)化以及葡萄糖醛酸和硫酸鹽偶聯(lián)的形成來實現(xiàn)的。這種生物堿的結(jié)構(gòu)和致幻劑結(jié)構(gòu)相似，但無致幻劑的活性，常用來阻止或緩解阿片類藥物依賴患者的戒斷癥狀，或被用于降低對阿片類藥物的依賴[3-6]。除此之外，由于卡痛葉的延緩戒斷綜合征作用，其也有一定的被濫用為毒品的風(fēng)險。目前，帽柱木堿和7-羥基帽柱木堿已被多個國家列為受管制物質(zhì)，因此，卡痛檢測試劑卡的研制開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義和市場需求。

毒品及毒品犯罪作為我國嚴(yán)厲打擊的對象，一直以來，深受國家重視，而毒品快速檢測方法的開發(fā)對于毒品打擊有至關(guān)重要的作用，尤其是新型毒品的檢測方法的開發(fā)，對于識別判定毒品流入，加強市場管控有重要意義[7]。

毒品檢測方法多樣，其中免疫層析技術(shù)的引入，對現(xiàn)場毒品檢測方法的發(fā)展有重要作用，運用免疫法制造的各種免疫試劑盒等能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品大規(guī)模商品化生產(chǎn)，且制作成本較低，操作簡便快速，便于實現(xiàn)毒品的現(xiàn)場初篩檢測[8]。

本研究采用膠體金免疫層析技術(shù)，運用Plackett-Burman試驗和Box-Behnken[9]試驗的方法，以卡痛試劑卡陰性質(zhì)控結(jié)果為考察指標(biāo)，對卡痛試劑卡玻纖體系進行優(yōu)化，得到最優(yōu)卡痛檢測試劑卡玻纖方案。

1.材料與方法

1.1?實驗材料和儀器

1.1.1?實驗材料

帽柱木堿：購于Cerilliant;檸檬酸三鈉、K2CO3為常規(guī)分析純試劑;牛血清蛋白帽柱木堿偶聯(lián)物：杭州傲銳生物醫(yī)藥科技有限公司;鼠抗帽柱木堿單克隆抗體：杭州傲銳生物醫(yī)藥科技有限公司;羊抗兔IgG：杭州傲銳生物醫(yī)藥科技有限公司;兔IgG：杭州傲銳生物醫(yī)藥科技有限公司;氯金酸、牛血清白蛋白（Bovine?albumin，BSA）玻璃纖維、硝酸纖維素膜（NC膜）、樣品吸收墊、PVC底板、吸水墊等均為杭州奧泰生物技術(shù)股份有限公司提供;

1.1.2?實驗儀器

三維XYZ3000?點膜儀，由Bio-Dot?公司提供;3H16R1高速冷凍離心機，由長沙湘智離心機儀器有限公司提供;AutoKun?HG5510金標(biāo)機，由杭州峰航科技提供;電熱鼓風(fēng)干燥箱，由上海一恒科學(xué)儀器有限公司提供;全自動切條機：上海金標(biāo)生物科技有限公司;85-2?型恒溫磁力攪拌器：上海志威電器有限公司;奧瑞德分析儀，杭州奧泰生物技術(shù)股份有限公司。

1.2?實驗方法

1.2.1?卡痛試劑卡的檢測

取3滴（約40?L）陰性質(zhì)控或者陽性質(zhì)控加入到試劑卡加樣窗口中，5min后采用奧瑞德分析儀讀取試劑卡的線條強度。

1.2.2?Plackett-Burman實驗設(shè)計

對緩沖劑的添加量，PH，烘制溫度，烘制時間和活性劑的添加量等5個因素進行考察，每個因素取低水平和高水平，另設(shè)一個空項列，以卡痛試劑卡陰性質(zhì)控響應(yīng)值為考察指標(biāo)，設(shè)計N=12的Plackett-Burman實驗。

1.2.3?Box-Behnken實驗設(shè)計

在Plackett-Burman實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以卡痛陰性質(zhì)控響應(yīng)值作為考察指標(biāo)，選取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal?LA-9添加量）等三個因素為自變量，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，做三因素三水平的響應(yīng)面試驗。

2?結(jié)果與分析

2.1?卡痛試劑卡質(zhì)控檢測結(jié)果的判讀

采用奧瑞德分析儀對不同質(zhì)控色卡進行讀數(shù)，質(zhì)控色卡的線條強度越弱，分析儀上響應(yīng)值越弱，其關(guān)系曲線如圖1所示，質(zhì)控色卡的線條強度與分析儀響應(yīng)值曲線有較好的擬合度（R2=0.9917）。

2.2Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

緩沖劑的添加量，pH，烘制溫度，烘制時間和活性劑的添加量等5個因素進行考察，每個因素取低水平和高水平，另設(shè)一個空項列，以卡痛試劑卡陰性質(zhì)控響應(yīng)值為考察指標(biāo)，設(shè)計N=12的Plackett-Burman實驗。其中A為Na2HPO4添加量，B為pH值，C為玻纖烘制溫度，D為玻纖烘制時間，E為Chemal?LA-9添加量。

利用MINITAB15對Plackett-Burman的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表2所示，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.11021，R2為93.68%，調(diào)整后R2為86.09%。其中兩個因素Na2HPO4添加量和Chemal?LA-9添加量對結(jié)果的有顯著影響（P<0.05），pH值對結(jié)果有極顯著影響（P<0.01），此三個因素均可作為進一步優(yōu)化因素。其他因素對結(jié)果影響不大，對影響效果不進行分析。

2.3Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果，以卡痛陰性質(zhì)控響應(yīng)值作為考察指標(biāo)，選取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal?LA-9添加量）三個因素為自變量，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面方法進行分析，每個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼。Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果見表3。

實驗數(shù)據(jù)采用MINITAB15軟件進行統(tǒng)計分析，得到自變量相對于結(jié)果的回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)差為1.19245，R2為97.00%，R2Adj為91.60%，表明模型的相關(guān)性和解釋度都很好。方差分析的結(jié)果表4表明，模型P值小于0.01（模型極顯著），失擬項P值為0.138不顯著，說明方程不失擬，所選模型合適。因此該Box-Behnken試驗設(shè)計可靠，模型可以應(yīng)用于卡痛試劑卡玻纖體系優(yōu)化的理論預(yù)測。在該模型中，回歸系數(shù)的顯著性檢驗顯示一次項A，一次項B和平方項B2達(dá)到顯著水平;平方項A2的影響達(dá)到極顯著水平;3個因素對卡痛試劑卡結(jié)果影響大小的排序為：B>A>C。各因素交互作用對卡痛試劑卡陰性質(zhì)控結(jié)果影響的響應(yīng)面如圖2所示。

2.4卡痛試劑卡最佳玻纖工藝驗證

運用MINITAB15響應(yīng)優(yōu)化器，可以得出，最優(yōu)的玻纖方案是，Na2HPO4添加量為0.05M，Chemal?LA-9添加量為8.74g/L，PH值為7.0時，理論方案達(dá)到最優(yōu)為485.51mV。在此條件下進行3次平行驗證實驗，取平均值，實際測卡痛試劑卡陰性質(zhì)控響應(yīng)值為為480.44mV，實際值與預(yù)測值相對誤差為1.04%，說明采用Box-Behnken試驗優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，有實際應(yīng)用價值。

3結(jié)論

卡痛是一種新型阿片替代物類毒品，具有一定的成癮性。本研究先從緩沖劑和活化劑類型的選擇對卡痛試劑卡陰性質(zhì)控結(jié)果影響方面考察，聯(lián)和采用Plackett-Burman試驗和Box-Behnken試驗的方法，建立了卡痛試劑卡玻纖體系的多項式模型，經(jīng)顯著性檢驗分析和響應(yīng)面分析，其最佳工藝參數(shù)為Na2HPO4添加量為0.05M，Chemal?LA-9添加量為8.74g/L，pH7.0，獲得卡痛試劑卡陰性質(zhì)控結(jié)果的理論值為485.51mV。經(jīng)驗證實際值為480.44mV，證明該模型準(zhǔn)確可靠。該研究為今后對此卡痛試劑卡開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為卡痛試劑卡的工業(yè)化制備和應(yīng)用提供理論參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 卡痛葉[J].大自然探索，2017，（6）：73.

[2] Charles?Veltri，Oliver?Grundmann.Current?perspectives?on?the?impact?of?Kratom?use[J].Substance?Abuse?and?Rehabilitation，2019，（10）：23-31.

[3] C?Michael?White.Pharmacologic?and?clinical?assessment?of?kratom：An?update.[J].American?journal?of?health-system?pharmacy：AJHP：official?journal?of?the?American?Society?of?Health-System?Pharmacists，2019，（0）.

[4] Khadija?Tayabali，Colin?Bolzon，Paul?Foster，Janki?Patel，Mohammad?Omar?Kalim.Kratom：a?dangerous?player?in?the?opioid?crisis[J].Journal?of?community?hospital?internal?medicine?perspectives，2018，（3）：107-110.

[5] Dimy?Fluyau，Neelambika?Revadigar.Biochemical?Benefits，Diagnosis，and?Clinical?Risks?Evaluation?of?Kratom[J].Frontiers?in?Psychiatry，2017，（8）.

[6] Meyer，David.Opioid?Alternative?Kratom?Is?Actually?an?Opioid?Itself，F(xiàn)DA?Warns.[J].Fortune.com，2018，：26.

[7] 宮學(xué)勤.毒品現(xiàn)場快速檢測方法的應(yīng)用，法制沙龍，2016，（4）：116.

[8] 張亞海，周文華.阿片類類毒品常用檢測方法及評價[J].中國藥物濫用防治雜志，2005，5.

[9] 馬逢時.六西格瑪管理統(tǒng)計指南：MINITAB使用指導(dǎo)[M].北京：中國人民大學(xué)出版社，2008.