付騰飛，薛興陽，孟 江

(1.廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095；3.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜HouttuyniacordataThumb.的新鮮全草或干燥地上部分，具有清熱解毒、利尿通淋、消腫排膿的功效，魚腥草歸肺經(jīng)，善治各種肺癰，常用于肺癰吐膿、痰熱咳嗽、熱痢熱淋以及瘡瘍腫毒的治療，也是藥食兩用的中藥植物資源之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，從天然植物中提取的生物堿類化學成分具有良好的抗腫瘤功效,其療效高、耐受性好、毒副作用小，在抗腫瘤治療領域處于優(yōu)勢地位[2]。魚腥草中已報道的生物堿類化合物有70多種，藥理活性研究顯示其具有良好的抗炎、抗病毒、抗血小板聚集、肝保護等方面作用，具有廣闊的應用前景[3]。祖國醫(yī)學將魚腥草列作“肺癰之要藥”，其傳統(tǒng)湯藥和現(xiàn)代注射液劑型應用于肺癌的治療顯示出良好的臨床療效[4-6]。本研究選取臨床常見的5種肺癌細胞(95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460)，研究魚腥草生物堿類組分對肺癌腫瘤細胞的作用，以期為魚腥草生物堿類組分應用于肺癌治療提供實驗研究依據(jù)。

1 研究材料

魚腥草藥材從廣州清平藥材市場購得，經(jīng)廣東藥科大學劉基柱教授鑒定為三白草科蕺菜HouttuyniacordataThunb。鹽酸小檗堿為實驗室自制(純度>98%)。HPD-100型大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)，人肺癌細胞株95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460保存于廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司，MTS試劑盒購自Promega公司(CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 貨號G3580)，細胞凋亡Hoechst 33258染色試劑盒購自碧云天公司(產(chǎn)品編號C0003)。

2 研究方法

2.1 魚腥草生物堿類成分的提取和純化

干魚腥草藥材4 kg，碎成粗粉，用20倍95%乙醇回流提取，每次2 h，提取2次。回收乙醇，用0.5%HCl溶液調(diào)pH=2～3，過濾，濾液用1%NaOH溶液調(diào)pH=5～7，靜置除去沉淀，繼續(xù)調(diào)pH=9～11，減壓濃縮得魚腥草生物堿粗浸膏。制備20 mg/mL的魚腥草生物堿上樣液，調(diào)pH=3.0，取樣品液40 mL，以0.5 mL/min的流速通過預處理好的d101-100樹脂。靜置吸附2 h，用60 mL蒸餾水沖洗，再用10%～90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得魚腥草生物堿浸膏11.375 2 g，得率0.284 4%[7-9]。

2.2 提取物中生物堿的含量測定及工作液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品12.35 mg，置于25 mL容量瓶內(nèi)，加95%乙醇15 mL，定容搖勻得0.494 mg/mL對照品溶液。分別移取對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于25 mL容量瓶中，定容至25 mL。用乙醇作空白對照，265 nm處測吸光度，以濃度X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標，得回歸方程：Y=52.826X+0.057 7，R2=0.999 7。用此方法得浸膏中生物堿含量為65.43%。加入磷酸鹽緩沖液配成1 mg/mL的工作液，0.22 μm濾膜過濾，4 ℃冰箱保存。

2.3 MTS實驗

復蘇置于液氮中的5種肺癌細胞株，隔天換液，細胞生長至80%左右傳代，置于37 ℃和5%CO2的細胞孵育箱中培養(yǎng)。鏡下觀察，分別取對數(shù)生長期的肺癌細胞，胰酶消化后，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，置于細胞孵育箱中培養(yǎng)。用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)魚腥草生物堿的濃度分別為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL,每孔100 μL藥液，每個濃度5個副孔，48 h后棄上清，磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入100 μL培養(yǎng)基，避光加入MTS試劑，每孔10 μL，4 h后用酶標儀檢測490 nm波長處的光密度A490，重復3次，計算A490平均值。計算相對抑制率，公式如下，再通過IC50計算軟件算出5種細胞的IC50。

相對抑制率(%)=(1-試驗組A490/對照組A490)×100%

2.4 形態(tài)學觀察

根據(jù)IC50設置4個濃度(0、1/2IC50、IC50、2IC50)，分別處理5種肺癌細胞，于細胞孵育箱中培養(yǎng)48 h。于倒置顯微鏡下觀察加藥前后肺癌細胞形態(tài)變化。

2.5 Hoechst 33258染色

取潔凈蓋玻片，70%乙醇中浸泡5 min后晾干，用磷酸鹽緩沖液洗滌1次，接種細胞于六孔板內(nèi)培養(yǎng)。細胞密度約70%時，取濃度為IC50的魚腥草生物堿工作液處理細胞，培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液吸出，加入固定液0.5 mL，固定10 min，吸出固定液，用磷酸鹽緩沖液洗滌。加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，5 min后吸去染色液，加磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，用抗熒光淬滅封片液封片，于倒置顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 22.0對實驗結(jié)果進行分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標準差(mean±SD)表示，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 研究結(jié)果

3.1 魚腥草生物堿對5種肺癌細胞體外增殖的影響

抑制曲線如圖1(SigmaPlot 14繪制)，由圖1可以看出，魚腥草生物堿對這5種肺癌細胞的體外增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，不同肺癌細胞對魚腥草生物堿的耐受程度不同，其中人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞95D對該藥最為敏感，人大細胞肺癌細胞H460對該藥耐受程度最高，相差約4倍。(95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460的IC50分別為29.51 μg/mL、72.04 μg/mL、67.94 μg/mL、54.00 μg/mL、130.17 μg/mL)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 細胞形態(tài)學觀察

如圖2所示，正常生長狀態(tài)下的腫瘤細胞，其形態(tài)呈現(xiàn)一定規(guī)則，鏡下視野光亮明晰，細胞貼壁牢固，邊緣充分伸展，少量空泡，使用魚腥草生物堿處理之后，較低濃度下，可見細胞開始萎縮，細胞體積開始變小，細胞形態(tài)開始呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，偽足部分消失。95D細胞是人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞，遷移性較強，由于其自身偽足發(fā)達，加藥處理之后其萎縮變化最顯著。隨著魚腥草生物堿的濃度逐步增大，細胞進一步萎縮變小，不貼壁的細胞增多，部分細胞脫落死亡，細胞數(shù)量減少，同時可以觀察到細胞折光性開始降低，固縮黑斑也增多，這些形態(tài)變化證實了魚腥草生物堿可以抑制肺癌細胞的體外增殖，且呈濃度依賴性。

圖2 魚腥草生物堿處理5種肺癌細胞48 h后形態(tài)變化(100×，μg/mL)

3.3 Hoechst 33258染色觀察魚腥草生物堿對肺癌細胞細胞核的影響

Hoechst 33258是一種DNA熒光染料,具有膜透性，與DNA雙鏈中的小溝結(jié)合后，在熒光顯微鏡350 nm紫外光激發(fā)下，可以檢測到藍色的細胞核，正常腫瘤細胞經(jīng)該染料染色后，細胞核呈淺藍色，圓形或類圓形，可以觀察到藍色顆粒，發(fā)生凋亡的腫瘤細胞，其胞膜的通透性增加，程度介于正常細胞核壞死細胞之間，使得染料可以進入細胞，使胞核著染。Hoechst 33258可以使核內(nèi)凝聚的染色質(zhì)呈現(xiàn)高亮度的藍色熒光[10]。從圖3染色結(jié)果可以看出，正常情況下的腫瘤細胞的細胞核呈藍色，具有一定規(guī)則形狀，分別經(jīng)魚腥草生物堿以IC50濃度處理48 h后，細胞核碎裂，固縮，致密濃染，呈藍白色熒光，不同種類的肺癌腫瘤細胞其碎片數(shù)、濃染程度不同，其中H1975表現(xiàn)得尤為明顯。該染色提示魚腥草生物堿有可能通過誘導肺癌細胞發(fā)生凋亡來抑制其增殖。

圖3 魚腥草生物堿處理5種肺癌細胞48 h后Hoechst染色圖(μg/mL)

4 討論

肺癌是一種對人民群眾生命健康構成最大威脅的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[11]。中醫(yī)藥在治療肺癌方面發(fā)揮著獨特作用，尤其是減輕放化療毒副作用、預防復發(fā)轉(zhuǎn)移、提高生活質(zhì)量以及生存期等方面有顯著優(yōu)勢[12]，與表皮生長因子絡氨酸激酶抑制劑聯(lián)用可逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌獲得性耐藥[13]。魚腥草含有揮發(fā)油、黃酮、生物堿、多糖以及有機酸等生物活性物質(zhì)，常應用于抗菌、抗炎以及抑制腫瘤細胞的治療，研究表明其提取物對多種腫瘤細胞有抑制作用[14-16]。本研究對魚腥草中生物堿類成分的抗肺癌作用進行了初步探究，選取了臨床常見的5種肺癌細胞，證實了其對肺癌細胞的廣泛抑制作用，并對抑制的量效關系進行了研究，結(jié)果表明，魚腥草生物堿類成分對人巨細胞肺癌細胞95D的抑制作用最為明顯，95D細胞為為人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞，提示該類成分有可能通過抑制肺癌細胞轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用。

細胞凋亡是細胞的一種生理性死亡，屬基因控制的主動死亡過程[17],當細胞凋亡過程受到影響，細胞群增殖和凋亡平衡被打破，異常細胞增殖速度快于凋亡速度，腫瘤便會形成。細胞凋亡可以反向調(diào)控腫瘤的進展過程，通過誘導腫瘤細胞啟動凋亡被認為是富有前景的治療手段[18]。細胞凋亡過程中，核染色質(zhì)斷裂成不同大小的片段，與線粒體等細胞器聚集，被細胞膜包圍以后，有許多芽狀或者泡狀的突起，逐漸分開后，形成凋亡小體[19]。Hoechst 33258染色結(jié)果表明加藥處理過的腫瘤細胞均出現(xiàn)了凋亡小體，配合加藥后腫瘤細胞形態(tài)變化，證實魚腥草生物堿類成分有可能通過誘導肺癌腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抑制作用，其具體機制有待進一步研究。