何香廷，楊再福，張琪悅，侯振宇

(東華大學環(huán)境科學與工程學院，上海 201620)

重金屬和抗生素是當今世界最為嚴重的污染物。中國是Sb儲備量和使用量最高的國家[1]，也是抗生素生產(chǎn)和使用的第一大國[2]。人們對汞、鉻、鉛等重金屬的研究頗多，對重金屬銻的報道較少。近年來印染行業(yè)等工業(yè)生產(chǎn)排放的大量Sb導致了多次污染事故[3]，使土壤、水、大氣中的銻濃度顯著增加，如太浦河流域飲用水和廣元銻污染事件等。同時，具有殺菌消毒作用的四環(huán)素已經(jīng)被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖等行業(yè)[4]。由于抗生素類不易吸收，所以動物體攝入的大部分抗生素以原藥或其代謝產(chǎn)物形式排出體外，導致耐藥性和抗性基因的污染[5]。近幾年有研究表明，土壤、地表水、底泥中等均已檢測到了抗生素的存在[6-8],給生存環(huán)境和人類健康帶來了嚴重危害，但有關銻和四環(huán)素的聯(lián)合研究未見報道。

本實驗選取四環(huán)素和銻作為目標化合物，分析兩種目標化合物對中華圓田螺肝胰臟酶活性的單一及聯(lián)合影響，為水環(huán)境中四環(huán)素和Sb對底棲生物的生態(tài)風險評價提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用中華圓田螺為受試生物。選用大小均勻、行動活潑、反應靈敏的健康田螺，質量為(3.28±0.05)g。田螺經(jīng)5%食鹽水消毒后進入實驗室，在2L的大燒杯中馴養(yǎng)5d后進行實驗。

1.2 儀器與試劑

儀器：Spectrumlab752S紫外分光光度計(上海棱光)；FSH-2A組織勻漿機(上海旌派)；SC-3612低速離心機(北京格瑞恩)。

試劑：鹽酸四環(huán)素(Signa-Ardrich Co.LLC, USA)，蛋白質定量測試試劑盒，CAT試劑盒，GSH試劑盒(試劑盒均來自南京建成生物工程研究所)。

1.3 實驗方法

1.3.1 田螺急性毒性試驗

四環(huán)素單一毒性試驗：將中華圓田螺暴露于5個不同的濃度梯度(0、1、10、100、500mg/L)，并設置3組平行實驗。每只2L的燒杯中放入10只大小均勻、行動活潑的田螺，進行96h急性毒性試驗并獲得四環(huán)素對田螺的半致死濃度(LC50四環(huán)素)。

銻單一毒性試驗：將中華圓田螺暴露于8個不同的濃度梯度(0、8、12、18、24、32、64、128mg/L)，并設置3組平行實驗。每只2L的燒杯中放入10只大小均勻、行動活潑的田螺，進行96h急性毒性試驗并獲得四環(huán)素對田螺的半致死濃度(LC50銻)。

四環(huán)素和銻聯(lián)合急性毒性試驗：將中華圓田螺暴露于9個不同的濃度梯度，其中四環(huán)素和銻的濃度為(0、12.5+3.38、25.0+6.75、50.0+13.50、100.0+27.00、150.0+40.50、200.0+54.00、300.0+81.00、400.0+108.00mg/L)，并設置3組平行實驗。每只2L的燒杯中放入10只大小均勻、行動活潑的田螺，進行96h急性毒性試驗并獲得四環(huán)素和銻聯(lián)合對田螺的半致死濃度(LC50聯(lián)合)。

1.3.2 培養(yǎng)及實驗條件

進行目標化合物對田螺體內蛋白質的影響、目標化合物對田螺肝胰臟GSH活性的影響、目標化合物對田螺肝胰臟CAT活性的影響3組實驗，培養(yǎng)168h。設置的濃度梯度為0%、10%、40%、70%、90% LC50四環(huán)素，0%、10%、40%、70%、90% LC50銻和0%、10%、40%、70% LC50聯(lián)合。實驗開始時，每個培養(yǎng)缸放入10只大小均勻、行動活潑的田螺；實驗開始后，每個培養(yǎng)缸于24h、72h、168h分別隨機抽取2只田螺進行后續(xù)實驗。

1.3.3 蛋白質、GSH、CAT樣本制備

準確稱取各濃度組待測田螺的重量。按照質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下用組織勻漿機研磨均勻，冷凍離心機4℃、4500rpm條件下離心10min后，取上清液用生理鹽水按1∶9比例稀釋成1%濃度組織勻漿，待測。

1.3.4 測定方法

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量；采用紫外分光光度法測定GSH和CAT的活性，具體測定操作和計算按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行。GSH和CAT活性分別以mgGSH/gprot、U/mgprot活力單位表示。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Origin8.0軟件對實驗進行作圖，SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與討論

2.1 田螺急性毒性試驗結果

四環(huán)素單一毒性試驗：田螺在72h時有明顯死亡跡象，根據(jù)田螺的死亡數(shù)采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)得知四環(huán)素的LC50 =100mg/L。

銻單一毒性試驗：田螺在48h時表現(xiàn)出行動遲緩等輕微中毒跡象；96h時田螺縮回殼內，幾乎無行動力，根據(jù)田螺的死亡數(shù)采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)得知Sb的LC50 =27mg/L。

四環(huán)素和銻聯(lián)合急性毒性試驗：暴露條件為四環(huán)素+Sb(100mg/L+27mg/L)的田螺在72h及96h時肌肉松軟，部分田螺因中毒而亡，根據(jù)田螺的死亡數(shù)采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)得知聯(lián)合四環(huán)素的LC50 =93.53mg/L、聯(lián)合Sb的LC50 =25.25mg/L。

表1 卡方測試

由此可知，四環(huán)素和銻的聯(lián)合效應為輕微的拮抗作用。

根據(jù)急性毒性試驗的結果設置各實驗組目標化合物的濃度見表2。

表2 實驗組目標化合物的濃度

2.2 目標化合物對田螺體內蛋白質的影響

圖1顯示了田螺體內的蛋白質含量隨著時間及暴露條件的變化。由圖可知，隨著時間的增加，在不同濃度的四環(huán)素、Sb以及四環(huán)素和Sb聯(lián)合條件下暴露的田螺體內的蛋白質含量均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，在實驗結束即168h時測定的田螺體內蛋白質含量低于對照組田螺體內的蛋白質含量。由此可知，無論在四環(huán)素暴露條件下，還是重金屬Sb暴露條件下，最終均會使田螺體內的蛋白質含量降低。王雅慧[9]等研究發(fā)現(xiàn)在大菱鲆幼魚的飼料中添加姜黃素后，會使該種魚體內的蛋白質含量有所下降。

該圖還顯示出在同一測定時間下，田螺體內的蛋白質含量隨著目標化合物濃度的變化。由圖3可知，在同一測定時間，Sb暴露條件下的田螺體內蛋白質含量隨著濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢；四環(huán)素暴露條件下的田螺體內蛋白質的含量為先增加后減少而后繼續(xù)增加，在四環(huán)素含量為40mg/L和90mg/L時，其體內的蛋白質含量較高；對于在四環(huán)素和Sb聯(lián)合條件下生長的田螺，其體內的蛋白質含量呈現(xiàn)出先降后升的趨勢，在37.41mg/L四環(huán)素+10.1mg/L Sb條件下生長的田螺體內蛋白質含量最低。由此也可以看出，四環(huán)素和重金屬Sb的聯(lián)合效應為拮抗。

2.3 目標化合物對田螺肝胰臟GSH活性的影響

GSH是機體內廣泛存在的一種重要的酶，具有抗氧化作用和解毒作用，從而維持機體正常的免疫系統(tǒng)功能。

2.3.1 Sb對田螺肝胰臟GSH活性的影響

由圖2可知，在實驗開始后24h，田螺肝胰臟的GSH活性隨著暴露濃度的增加而降低；隨著暴露時間的逐漸增長，在同一測定時間下，田螺肝胰臟的GSH活性隨著暴露濃度呈先增加后降低的趨勢，且在72～168h的增加最為顯著。由此可知，Sb在一定濃度及時間范圍內對田螺肝胰臟的GSH活性有抑制作用。

林少琴[10]等的研究表明，Zn2+、Fe3+、Mn2+在體外對蚯蚓體內的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)有抑制作用。唐浩[11]等人的研究發(fā)現(xiàn)，Hg對土壤球衣體內的GSH-Px有先促進再抑制作用。因此，不同重金屬對不同生物體內GSH活性的作用效果不同。

2.3.2 四環(huán)素對田螺肝胰臟GSH活性的影響

由圖2可知，在實驗前72h，暴露在四環(huán)素條件下的田螺肝胰臟的GSH活性隨著暴露濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高而后降低的趨勢，但在最后96h(即168h)時，趨勢變?yōu)榱讼仍龊蠼翟僭黾?。并且各時間各暴露濃度下的GSH活性均高于對照組。

2.3.3 四環(huán)素和Sb聯(lián)合對田螺肝胰臟GSH活性的影響

由圖2可知，暴露在四環(huán)素和重金屬Sb聯(lián)合作用條件下的田螺肝胰臟GSH的活性在40% LC50聯(lián)合(即37.41mg/L四環(huán)素+10.1mg/L Sb)條件下最高，呈現(xiàn)先增后減的趨勢；且在168h時田螺肝胰臟GSH的活性最高，較72h時增加了約90%，說明此時田螺體內的抗氧化作用最強。

2.4 目標化合物對田螺肝胰臟CAT活性的影響

過氧化物酶(CAT)是一種抗氧化酶，主要是在活性氧代謝過程中，將產(chǎn)生的H2O2分解為水和氧氣，有效阻止細胞的過氧化損傷[12]。CAT常被作為指示污染脅迫的重要生物標志物[13]。

2.4.1 Sb對田螺肝胰臟CAT活性的影響

由圖3可知，在前72h內Sb各濃度暴露條件對田螺肝胰臟的CAT活性有著低濃度抑制、高濃度促進的作用；但隨著培養(yǎng)時間的增加，在168h時，Sb對其CAT活性有著相反的作用——低濃度促進、高濃度抑制。其中，Sb濃度為18.9mg/L時的促進作用最為明顯。

郭婷[14]對水體中的Cr6+對草魚肝胰臟CAT活性影響的研究表明，隨著時間的延長和培養(yǎng)濃度的增加，CAT的活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；王慶偉[15]在水體中的Cu2+對斑馬魚CAT活性的研究表明，暴露7d后，斑馬魚CAT的活性被抑制，隨著暴露濃度的增大，CAT的活性降低且被抑制的程度減弱。

2.4.2 四環(huán)素對田螺肝胰臟CAT活性的影響

根據(jù)圖3的分析可知，四環(huán)素暴露條件下田螺肝胰臟CAT活性與Sb暴露條件下有著相反的趨勢，在前24h田螺的CAT活性先增加后降低；而后，隨著時間的增長，田螺肝胰臟CAT活性呈現(xiàn)低濃度抑制、高濃度促進的趨勢。說明田螺的肝胰臟細胞對四環(huán)素的脅迫作用產(chǎn)生了應激反應。

2.4.3 四環(huán)素和Sb聯(lián)合對田螺肝胰臟CAT活性的影響

與單一的四環(huán)素或Sb對田螺的肝胰臟CAT活性的影響不同，四環(huán)素和Sb復合污染物對田螺CAT活性的影響為低濃度促進，高濃度抑制。在暴露條件為37.41mg/L四環(huán)素+10.1mg/L Sb時的促進效果最為明顯，在24h時CAT的活性約為對照組的2倍，而在168h時約為對照組的3倍。

四環(huán)素和Sb聯(lián)合暴露條件與單一暴露條件對田螺肝胰臟CAT活性影響相同的是，在同一濃度條件下，72h時CAT的活性最低，四環(huán)素對CAT的活性有低濃度抑制、高濃度促進的作用。

3 小結

(1)四環(huán)素與重金屬Sb有輕微拮抗作用。

(2)暴露在四環(huán)素、Sb污染條件下的田螺體內蛋白質含量較正常條件下生活的田螺有所減少。

(3)隨著時間的延長，各暴露條件下的田螺肝胰臟GSH的活性都有顯著的升高。

(4)田螺肝胰臟CAT活性與培養(yǎng)時間和暴露濃度都相關。在前72h Sb對田螺肝胰臟CAT的活性有著低濃度抑制、高濃度促進的作用，隨著暴露時間的增加有著完全相反的作用；四環(huán)素對田螺肝胰臟的CAT有著低濃度抑制、高濃度促進的作用；而Sb和四環(huán)素聯(lián)合條件對田螺肝胰臟的CAT活性有著低濃度促進、高濃度抑制的作用。