陳怡文，郭冰沁，李洪濤

（1.贛州市第三人民醫(yī)院/贛南醫(yī)學(xué)院附屬老年醫(yī)院 老年科，江西 贛州 341000；蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 2.病理科 3.腫瘤外科，安徽 蚌埠 233004）

肝細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌）是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)肝癌患者病死率在世界上占較高比例，癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要原因[1-2]。細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控的失衡是引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[3]；肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲是導(dǎo)致癌其轉(zhuǎn)移的重要因素[4]。然而，介導(dǎo)肝癌增殖、遷移、侵襲和凋亡的潛在分子機(jī)制尚未完全不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度＞200 nt的非編碼RNA，其可通過(guò)多種方式發(fā)揮其生物學(xué)功能，研究[5-7]表明lncRNA可以作為一種競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用，參與調(diào)控靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。大量研究[8-10]表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等過(guò)程。既往研究發(fā)現(xiàn)敲除lncRNACASC15可以通過(guò)Y染色體上的性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族盒蛋白4（sexdertermining region of Y chromosome related high mobility group box 4，SOX4）/Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，并在體外促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。沉默lncRNA LEF1-AS1可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，且可抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[12]。RUSC1-AS1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)的lncRNA，研究[13]表明RUSC1-AS1在乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤大小和臨床等級(jí)呈正相關(guān)，而與患者的整體生存呈負(fù)相關(guān)；沉默RUSC1-AS1顯著抑制了乳腺癌MCF-7和BT549細(xì)胞的活力、克隆能力及細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)了其凋亡。RUSC1-AS1在喉鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)表達(dá)，非甲基化可調(diào)節(jié)RUSC1-AS1的表達(dá)，且RUSC1-AS1與可能是喉鱗狀細(xì)胞癌的重要預(yù)后生物標(biāo)志物[14]。然而lncRNA RUSC1-AS1在肝癌中的表達(dá)和功能?chē)?guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者前期采用Starbase預(yù)測(cè)顯示，lncRNA RUSC1-AS1和微小RNA-326（miR-326）存在結(jié)合位點(diǎn)。因此，本研究檢測(cè)lncRNA RUSC1-AS與miR-326在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)，通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分析lncRNA RUSC1-AS表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其與miR-326的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月—2019年12月收治的肝癌患者經(jīng)手術(shù)切除的肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距離腫瘤邊緣2～5 cm）標(biāo)本41例，其經(jīng)病理檢測(cè)確認(rèn)為肝癌，患者手術(shù)前未進(jìn)行過(guò)手術(shù)及放化療，所有患者均知情且簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要材料

肝癌MHCC97-H細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-326模擬物/抑制物、lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)抑制質(zhì)粒及各自陰性對(duì)照購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-world公司；聚偏二氟乙烯膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Advansta公司；cyclin D1抗體購(gòu)自美國(guó)Biorbyt公司；P21、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abbiotec公司；Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海BestBio貝博生物公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組肝癌MHCC97-H 細(xì)胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，2 d 換液1 次，待細(xì)胞融合至80%～90% 左右時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97-H 細(xì)胞，按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)LipofectamineTM2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)抑制質(zhì)粒（si-RUSC1-AS1 組）/ 陰性對(duì)照質(zhì)粒（si-NC 組）、miR-326 模擬物（miR-326組）/ 陰性對(duì)照序列（miR-NC 組）分別轉(zhuǎn)染至MHCC97-H 細(xì)胞中；將lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)抑制質(zhì)粒分別與miR-326 抑制物（si-RUSC1-AS1+anti-miR-326 組）及其陰性對(duì)照序列（si-RUSC1-AS1+anti-miR-NC 組）轉(zhuǎn)染至MHCC97-H細(xì)胞中。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 的表達(dá)水平用TRIzol 試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95 ℃ 5 min，95℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，lncRNA RUSC1-AS1 上游引物序列：5'-CAG GGT CCC ACT ATG TTG CT-3'，下游引物序列：5'-CCA TTT TAT AGG CGG GGA GT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGT TGC CAT CAA TCA CCC CTT-3'，下游引物序列：5'-CTC CAC GAC GTA CTC AGCG-3'；miR-326 上游引物序列：5'-CAT CTG TCT GTT GGG CTG GA-3'，下游引物序列：5'-AGG AAG GGC CCA GAG GCG-3'；U6 上游引物序列：5'-CGG GTT TGT TTT GCA TTT CT-3'，下游引物序列：5'-AGT CCC AGC ATG AAC AGC TT-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97-H 細(xì)胞，按照每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，每孔分別加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩反應(yīng)10 min 使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)吸光度（OD）值。

1.3.4 Western blot 法檢測(cè)cyclin D1、P21、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)用RIPA 蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白上樣量60 μg，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用5% 脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的一抗（1:800），4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3 次，每次5 min；再加入二抗（1:1 200）室溫孵育2 h，PBS 洗滌3 次，每次10 min，后在暗室中用ECL 發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+ 系統(tǒng)成像，再用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：分別將600 μL 含胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液和200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室的下室和上室中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，吸去培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀(guān)察并拍照，計(jì)算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將60 μL Matrigel 與300 μL 無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中混勻，然后取100 μL 平鋪于Transwell小室的上室，凝固后按細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡取轉(zhuǎn)染48 h 后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，吸棄上清液，PBS 漂洗細(xì)胞2 次，吸棄PBS 液，加1～2 mL 胰酶消化細(xì)胞使之脫壁，靜置5～8 min，輕搖使之形成均勻細(xì)胞懸液，結(jié)合緩沖液終止消化，分別加annexin V-FITC和PI 各5 μL，輕搖混勻，常溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Results of qRT-PCR detection

1.3.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 的靶向關(guān)系構(gòu)建lncRNA RUSC1-AS1 的野生型和突變型的熒光素酶表達(dá)載體質(zhì)粒WT-RUSC1-AS1 和MUT-RUSC1-AS1，用LipofectamineTM2000 將WT-RUSC1-AS1 和MUTRUSC1-AS1 質(zhì)粒分別與miR-326 模擬物及相應(yīng)的對(duì)照序列共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 在肝癌組織中的表達(dá)

應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)41例肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA RUSC1-AS1和miR-326的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織中RUSC1-AS1表達(dá)水平明顯升高，miR-326表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞增殖的影響

與si-NC組比較，si-RUSC1-AS1組MHCC97-H細(xì)胞中RUSC1-AS1表達(dá)水平明顯降低，24、48、72 h細(xì)胞OD值明顯降低，cyclin D1蛋白表達(dá)水平明顯降低，P21 蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05）（圖2）。

圖2 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference on proliferation of MHCC97-H cells

2.3 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)對(duì)MHCC97-H細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與si-NC組比較，si-RUSC1-AS1組MHCC97-H細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)明顯降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97-H 細(xì)胞遷移、侵襲的影響Figure 3 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference on migration and invasion of MHCC97-H cells

2.4 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)對(duì)MHCC97-H細(xì)胞凋亡的影響

與si-NC組比較，si-RUSC1-AS1組MHCC97-H細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05） （圖4）。

圖4 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97-H 細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference on apoptosis of MHCC97-H cells

2.5 miR-326 過(guò)表達(dá)對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

與miR-NC組比較，miR-326組MHCC97-H細(xì)胞中miR-326表達(dá)水平明顯升高，24、48、72 h細(xì)胞OD值明顯降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，P21、Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖5）。

2.6 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)同時(shí)抑制miR-326 表達(dá)對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用

與si-RUSC1-AS1+anti-miR-NC組比較，si-RUSC1-AS1+anti-miR-326組MHCC97-H細(xì)胞中miR-326表達(dá)水平明顯降低，24、48、72 h細(xì)胞OD 值明顯升高，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，cyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，P21、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）（圖6）。

圖5 miR-326 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Figure 5 Influence of miR-326 overexpression on proliferation,migration,invasion and apoptosis of MHCC97-H cells

圖6 干擾lncRNA RUSC1-AS1 表達(dá)同時(shí)抑制miR-326 表達(dá)對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用Figure 6 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference with miR-326 inhibition on proliferation,migration,invasion and apoptosis of MHCC97-H cells

2.7 lncRNA RUSC1-AS1 靶向調(diào)控miR-326 的表達(dá)

StarBase在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)顯示lncRNA RUSC1-AS1與miR-326存在互補(bǔ)的核苷酸序列（圖7A）。在MHCC97-H細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-326模擬物或陰性對(duì)照序列和WT-RUSC1-AS1或MUT-RUSC1-AS1，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖7B），過(guò)表達(dá)miR-326明顯降低包含WT-RUSC1-AS1質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜0.05），但不影響包含MUTRUSC1-AS1質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＞0.05）。qRT-PCR檢測(cè)測(cè)轉(zhuǎn)染lncRNA RUSC1-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照序列的MHCC97-H細(xì)胞中miR-326 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)RUSC1-AS1導(dǎo)致miR-326表達(dá)水平明顯降低，抑制RUSC1-AS1表達(dá)導(dǎo)致miR-326表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05）（圖7C）。

圖7 lncRNA RUSC1-AS1 與miR-326 的關(guān)系分析Figure 7 Analysis of relationship between lncRNA RUSC1-AS1 and miR-326

3 討 論

越來(lái)越多的研究[15-17]表明lncRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，其可能通過(guò)調(diào)控抑癌或致癌基因起作用。因此，研究影響肝癌的lncRNA對(duì)于揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。已有大量研究表明多種lncRNA影響肝癌的進(jìn)展，如lncRNA LBX2-AS1通過(guò)充當(dāng)miR-384的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA，從而上調(diào)胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS1）的表達(dá)來(lái)驅(qū)動(dòng)肝癌的發(fā)展；敲低lncRNA LBX2-AS1會(huì)減弱肝癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，并在體外誘導(dǎo)其凋亡[18]。LINC01139通過(guò)與miR-30家族競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，通過(guò)上調(diào)成髓細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄因子第2亞型（MYB protooncogene like 2，MYBL2）來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展；LINC01139可能成為肝癌患者的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物[19]。近年來(lái)研究表明lncRNA RUSC1-AS1在人類(lèi)腫瘤中起重要作用，已有研究[13-14]報(bào)道lncRNA RUSC1-AS1在乳腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌中具有致癌作用。且有研究[20]報(bào)道lncRNA RUSC1-AS1在宮頸癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，RUSC1-AS1的高表達(dá)與宮頸癌患者的FIGO分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較短的總生存期顯著相關(guān)；干擾lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)通過(guò)上調(diào)miR-744抑制了宮頸癌細(xì)胞的體外增殖，遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；并阻礙體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。然而目前l(fā)ncRNA RUSC1-AS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究重點(diǎn)研究lncRNA RUSC1-AS1在肝癌組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步探究lncRNA RUSC1-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其潛在的作用機(jī)制。

本研究首先在20例肝癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中檢測(cè)lncRNA RUSC1-AS1的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA RUSC1-AS1在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，表明lncRNA RUSC1-AS1在肝癌組織可能起促癌作用，與在其他癌癥中的作用相同。功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)后，肝癌MHCC97-H細(xì)胞在培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)細(xì)胞OD值顯著降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高。cyclin D1、P21是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖有關(guān)，cyclin D1是正調(diào)控因子，P21是負(fù)調(diào)控因子，cyclin D1低表達(dá)，P21高表達(dá)抑制細(xì)胞增殖[21]。MMP-2、MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，其高表達(dá)可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲[22]。Bcl-2、Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，Bcl-2是抗凋亡因子，Bax是促凋亡因子，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞凋亡情況[23]。表明干擾lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)可顯著抑制MHCC97-H細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究[24-27]表明miRNA也參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，影響癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等。有研究[28]報(bào)道m(xù)iR-326在肝癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，miR-326的低表達(dá)與肝癌患者的TNM分期，分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；miR-326過(guò)表達(dá)通過(guò)直接靶向LIM和SH3蛋白1（LIM and SH3 protein 1，LASP1）在體外抑制了肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并激活了細(xì)胞凋亡。還有研究[29]表明miR-326過(guò)表達(dá)可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，集落形成，遷移和侵襲，誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。上調(diào)miR-326顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成，且阻滯了細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，miR-326在肝癌組織中表達(dá)水平顯著升高。過(guò)表達(dá)miR-326后，肝癌MHCC97-H細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)細(xì)胞OD值顯著降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-326可顯著抑制MHCC97-H細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步研究lncRNA RUSC1-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞的影響的機(jī)制是否與miR-326有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)StarBase在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)可能與lncRNA RUSC1-AS1結(jié)合的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA RUSC1-AS1與miR-326存在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)lncRNA RUSC1-AS1可靶向miR-326。且過(guò)表達(dá)lncRNA RUSC1-AS1導(dǎo)致miR-326表達(dá)水平顯著降低，抑制lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)導(dǎo)致miR-326表達(dá)水平顯著升高，表明lncRNA RUSC1-AS1確實(shí)可調(diào)控miR-326的表達(dá)。研究報(bào)道lncRNA可通過(guò)調(diào)控miR-326表達(dá)影響腫瘤進(jìn)展，如lncRNA DDX11-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-326/IRS1軸促進(jìn)胃癌的細(xì)胞進(jìn)程和奧沙利鉑耐藥性[31]。lncRNA TDRG1通過(guò)靶向miR-326調(diào)節(jié)子宮頸癌中絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[32]。LncRNA SNHG3通過(guò)靶向miR-326促進(jìn)肝細(xì)胞腫瘤的發(fā) 生[33]。lncRNA H19可以作為ceRNA海綿來(lái)修飾miR-326并調(diào)節(jié)TWIST1表達(dá)參與肝細(xì)胞癌的發(fā)展[34]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制miR-326表達(dá)的同時(shí)干擾lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)，培養(yǎng)24、48、72 h后細(xì)胞OD值顯著升高，且細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低。說(shuō)明抑制miR-326表達(dá)可能逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡促進(jìn)作用。

綜上所述，肝癌組織中l(wèi)ncRNA RUSC1-AS1異常高表達(dá)，干擾lncRNA RUSC1-AS1表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)miR-326表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。lncRNA RUSC1-AS1的異常高表達(dá)可能是促進(jìn)肝癌進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素，其可作為生物治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)。