（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥230009）

羊肚菌是一種名貴食用藥用真菌，于1818年被發(fā)現(xiàn)，由于菌蓋表面凹凸不平，具有很多褶皺，形似羊肚而得名。羊肚菌不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，滋味鮮美，而且還具有較高的藥用價(jià)值。中醫(yī)理論認(rèn)為羊肚菌具有“益腸胃，化痰理氣”的功效[1]?，F(xiàn)代研究也顯示，羊肚菌具有一定的調(diào)節(jié)人體免疫能力，預(yù)防感冒等效果。因此，有必要對(duì)羊肚菌活性物質(zhì)展開(kāi)深入研究。

羊肚菌子實(shí)體主要通過(guò)野外采集獲得，資源有限，價(jià)格也較高。目前羊肚菌的人工栽培技術(shù)還不成熟，同時(shí)培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成本較高，限制了對(duì)于羊肚菌活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究。采用液體深層發(fā)酵的技術(shù)可以大量、低成本獲得真菌菌絲體，同時(shí)有利于分離提取純化包括胞外多糖在內(nèi)的多種活性物質(zhì)，因此可以利用液體深層發(fā)酵技術(shù)研究羊肚菌活性產(chǎn)物[2]。前期研究結(jié)果顯示，利用羊肚菌子實(shí)體獲得的子實(shí)體多糖具有較強(qiáng)的降血脂活性[3]。而羊肚菌胞內(nèi)多糖可以顯著降低四氯化碳引起的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度上升，降低肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，具有較強(qiáng)的肝臟保護(hù)能力[4]。羊肚菌多糖還可以有效刺激淋巴細(xì)胞的增殖，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。前期研究表明粒毛盤菌等真菌通過(guò)深層發(fā)酵可以產(chǎn)生大量的胞外多糖，并具有抗氧化、降血糖等生物活性[6-8]。也有相關(guān)研究指出，深層發(fā)酵羊肚菌可以獲得大量胞外多糖，同時(shí)有不少文獻(xiàn)對(duì)羊肚菌深層發(fā)酵的工藝參數(shù)進(jìn)行了調(diào)查和優(yōu)化[9-10]。但是對(duì)于羊肚菌胞外多糖的生物活性的研究報(bào)道較少。

本研究采用液體深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)羊肚菌菌絲體，分離純化獲得羊肚菌胞外多糖，研究羊肚菌胞外多糖的降血糖和降血脂活性，為開(kāi)發(fā)相關(guān)保健食品或藥品提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌由上海農(nóng)科院食用菌研究所提供，保藏于合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯仿、正丁醇：天津市博迪化工有限公司；可溶性淀粉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitro salicylic acid，DNS）、四水合酒石酸鉀鈉、?；悄懰徕c（sodium taurocholate，ST）、甘氨膽酸鈉（sodium glycocholate，SG）、聚乙烯醇、橄欖油、胰脂肪酶（30 000 U/g）、胃蛋白酶（2 500 U/mg）、α-淀粉酶（2 000 U/g）、阿卡波糖：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶（300 000 U/g）、對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷（4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：阿拉丁試劑公司；濃鹽酸、濃硫酸、苯酚：上海中成化學(xué)試劑有限公司；化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華儀器有限公司；AR1140型電子分析天平：奧毫斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；TDL-50B型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SW-CJ-ICU型超凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；250 D數(shù)顯光照培養(yǎng)箱：江蘇省正基儀器有限公司；RE-85旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；FD-1B-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；680 i－Mark酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌發(fā)酵液的制備以及發(fā)酵條件

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，確定發(fā)酵液配方和發(fā)酵條件[11]。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L。配制3 L，分裝于20個(gè)250 mL錐形瓶中，用高壓蒸汽滅菌鍋121℃下滅菌20 min。待冷卻至室溫（25℃），在超凈工作臺(tái)內(nèi)將保藏良好的羊肚菌菌種接種于裝有液體培養(yǎng)液的錐形瓶中，置于搖床內(nèi)在25℃條件下?lián)u動(dòng)4 d，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

1.3.2 生物量測(cè)定

在250 mL錐形瓶中接種定量的羊肚菌，搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)期，將發(fā)酵液抽濾，菌絲體用蒸餾水清洗2次～3次后于60℃干燥箱中烘干至恒重，稱重?fù)Q算為菌體干重，并記錄不同發(fā)酵時(shí)間的生物量結(jié)果（生物量=菌體干重/發(fā)酵液體積）。

1.3.3 羊肚菌粗多糖（Morchella esculenta polysaccharides，MEP）分離與純化

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液抽濾，濾液抽入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，利用真空泵抽真空于60℃條件下濃縮，直到留下100 mL左右的濃縮液。向得到的發(fā)酵液濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇溶液，在4℃條件下醇沉24 h。然后在25℃條件下在4 000 r/min離心10 min，取沉淀物，即為羊肚菌粗多糖。

粗多糖脫蛋白采用Sevage法。向多糖溶液中加入1/3體積的Sevage試劑（氯仿、正丁醇溶液體積比5∶1），混合物劇烈振搖20 min，靜置20 min，反復(fù)操作5次～6次。之后置于分液漏斗中靜置分液，分去水層與溶劑層交界處的變性蛋白。重復(fù)以上操作至水相與溶劑相的交界面無(wú)膠狀變性蛋白質(zhì)（即乳白色分界）時(shí)，即為脫蛋白結(jié)束。

脫蛋白結(jié)束后，用H2O2對(duì)多糖溶液進(jìn)行脫色處理，向多糖溶解液中加入其體積1/10的濃度為30%的H2O2，50℃保溫脫色1 d，期間每隔12 h補(bǔ)充一次H2O2，脫色最終得到淡黃色的溶液。

將脫蛋白、脫色處理后的多糖水溶液放進(jìn)透析袋（直徑25 mm、截留分子量3 500 Da）中，用自來(lái)水反向流動(dòng)透析48 h。自來(lái)水透析之后再用蒸餾水透析24 h。最后將透析后的多糖溶液進(jìn)行旋蒸器濃縮，體積濃縮到100 mL以下，多糖溶液放入-80℃冰箱中冷凍24 h。之后將冷凍24 h的多糖溶液置于凍干機(jī)中處理24 h，最終得到羊肚菌多糖。

MEP過(guò)DEAE-纖維素52凝膠柱處理，對(duì)羊肚菌胞外多糖進(jìn)行分級(jí)分離。采用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，取 40 μL 羊肚菌多糖溶液、40 μL 6%的苯酚、200 μL濃硫酸于96孔板中混勻，靜置10 min，在25℃中保溫20 min，490 nm處測(cè)吸光度。對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得多糖含量。

1.3.4 MEP對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性

參照文獻(xiàn)檢測(cè)MEP對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性[12]。將 100 μL 的 α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）添加到50 μL的樣品溶液中，并在37℃下孵育10 min。然后向每個(gè)樣品溶液中加入100 μL的PNPG（5 mmol/L），并在37℃下孵育20 min。加入1 mL的碳酸鈉溶液（1 mol/L）終止反應(yīng)。阿卡波糖作正對(duì)照。在405 nm處測(cè)量了吸光度，并使用以下方程計(jì)算α-葡萄糖苷酶的抑制率：

式中：A對(duì)照1是PNPG溶液和樣品的混合物的吸光度；A對(duì)照2是PNPG和酶的混合物的吸光度。

參照文獻(xiàn)檢測(cè)MEP對(duì)α-淀粉酶抑制活性[12]。首先將0.4 mL的α-淀粉酶（2 U/mL）溶液在37℃下與0.2 mL多糖溶液預(yù)混合10 min。然后，加入0.3 mL的淀粉溶液（5%），反應(yīng)10 min后，加入2 mL的DNS試劑（10 mg/mL 3，5-二硝基水酸和120 mg/mL酒石酸鉀鈉溶于0.4 mol/L的氫氧化鈉溶液）以終止試驗(yàn)，并在100℃加熱15 min。冷卻后，在540 nm處測(cè)量吸光度。α-淀粉酶抑制活性的計(jì)算如下：

式中：A樣品、A對(duì)照和 A空白對(duì)照分別定義為樣品、對(duì)照和樣品空白對(duì)照的吸光度；阿卡波糖作為對(duì)照。

1.3.5 MEP對(duì)脂肪酶抑制活性

參照相關(guān)文獻(xiàn)測(cè)得MEP對(duì)胰脂肪酶活性的抑制能力[13]。在試管中加入5 mL磷酸緩沖鹽溶液（pH7.4）、4 mL聚乙烯醇為乳化劑和橄欖油為油相的底物乳化液（0.229 g/mL），同時(shí)加入一定濃度的MEP多糖溶液進(jìn)行混合，混合液37℃水浴孵育10 min，然后加入1 mL胰脂肪酶液（2 mg/mL），反應(yīng) 15 min，加 95%乙醇15 mL終止酶反應(yīng)。滴加酚酞，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色?？瞻自囼?yàn)的酶液在反應(yīng)終止后加入。脂肪酶抑制活性的計(jì)算如下：

脂肪酶活性抑制率/%=（不加MEP酶活性-加入MEP酶活性）/不加MEP酶活性×100

1.3.6 MEP對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力試驗(yàn)（模擬腸道環(huán)境）

根據(jù)前期研究方法，檢測(cè)MEP對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力判斷其降血脂活性[6]。首先利用甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c繪制膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在模擬腸道環(huán)境下檢測(cè)MEP與膽酸鹽結(jié)合能力，判斷其體外降血脂活性。

取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L，牛磺膽酸鈉 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L）2 mL 于具塞試管中，加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4，于70℃水浴20 min，后冰浴5 min，在387 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

以膽酸鹽含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪得膽酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取3 mL MEP溶液于具塞錐形瓶中，加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶（溶于pH 6.3的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液），1 mL0.01mol/L的HCl，在37℃下恒溫振蕩消化1 h，模擬胃消化過(guò)程。隨后，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至6.3，后加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶，在37℃條件下，恒溫振蕩消化1 h，模擬腸道環(huán)境進(jìn)行消化。每個(gè)樣品中加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉、0.5 mmol/L?；悄懰徕c，在37℃條件下恒溫振蕩1 h后混合物轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min離心20 min，取上清液，比色法測(cè)定甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c含量，每個(gè)樣品平行3次。膽酸鹽結(jié)合率計(jì)算方法如下：

膽酸鹽結(jié)合率/%=（膽酸鹽加入量-膽酸鹽剩余量）/膽酸鹽加入量×100

1.3.7 MEP對(duì)葡萄糖在溶液中擴(kuò)散的抑制作用

參照文獻(xiàn)，檢測(cè)MEP對(duì)葡萄糖擴(kuò)散抑制作用[14]。在密封透析袋（截留分子量1 000 Da）中加入含有約0.5 g MEP的葡萄糖溶液（25 mmol/mL）。該混合物浸入含有200 mL的去離子水的燒杯中，將燒杯置于37℃水浴鍋中。經(jīng)過(guò) 15、30、60、120、150 min 的透析，采用苯酚-硫酸法檢測(cè)外部溶液中的葡萄糖量，無(wú)樣品的混合物作為對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)最少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用Excel處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 深層發(fā)酵條件下羊肚菌菌絲體生物量變化

液體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)發(fā)酵液抽濾獲得菌絲體并干燥稱重，計(jì)算生物量。液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程中羊肚菌生物量的變化見(jiàn)圖1。

圖1 液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程中羊肚菌生物量的變化Fig.1 Biomass change of Morchella esculenta under depth fermentation

由圖1可知，在發(fā)酵進(jìn)行的1 d～6 d，羊肚菌發(fā)酵液中的生物量緩慢上升，到第6天達(dá)到最大值，之后基本穩(wěn)定在最大值附近。在第6天的時(shí)候，羊肚菌生物量最高，為3.2 g/L。本課題組前期研究顯示深層發(fā)酵條件下粒毛盤菌生物量最大為6 g/L～8 g/L[15]。趙春艷等報(bào)道了不同液體培養(yǎng)基配方對(duì)于羊肚菌菌絲體生物量的影響，結(jié)果顯示主要成分為麥麩、黃豆粉、麥芽糖、可溶性淀粉和葡萄糖的培養(yǎng)基中的生物量最大，每200 mL培養(yǎng)基可以獲得干重8.48 g的菌絲體[9]。劉生梅報(bào)道了不同微量元素對(duì)于羊肚菌菌絲體生物量的影響，結(jié)果顯示，Zn、Cu、Se等微量元素對(duì)羊肚菌生長(zhǎng)具有刺激作用，生物量可達(dá)4 g/L左右，和本試驗(yàn)得到的結(jié)果比較接近[16]。因此，認(rèn)為液體培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)到第6天時(shí)即可以結(jié)束，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 MEP的分級(jí)分離

對(duì)MEP進(jìn)行脫蛋白、脫色和透析一系列處理后，再使用DEAE-纖維素52進(jìn)行初步分離純化。MEP經(jīng)凝膠柱層析洗脫后得到3個(gè)主要的洗脫峰，分別是用蒸餾水、0.2、0.4 mol/L NaCl，3種溶液洗脫得到的多糖曲線見(jiàn)圖2。

由圖2可知蒸餾水洗脫條件下所得多糖峰面積最大即洗脫含量最多，在0.2 mol/L NaCl洗脫條件下獲得的多糖峰面積次之，而0.4 mol/L NaCl洗脫條件下獲得的多糖峰面積最小。根據(jù)洗脫結(jié)構(gòu)，可以判斷MEP主要由不帶電荷的中性多糖（即蒸餾水洗脫部分）和帶有少量負(fù)電荷的酸性多糖（0.2 mol/L NaCl洗脫部分）組成，且MEP中中性多糖的含量要多于酸性多糖的含量。

圖2 羊肚菌胞外多糖（MEP）的分級(jí)分離洗脫曲線Fig.2 Elution curve of MEP using different elution phase

2.3 MEP對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率

α-葡萄糖苷酶可以水解葡萄糖苷鍵，釋放葡萄糖，提高血糖濃度等。抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以有效抑制飯后體內(nèi)血糖上升，同時(shí)這也是篩選降血糖藥物的常規(guī)檢測(cè)方法，羊肚菌胞外多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率見(jiàn)圖3。

圖3 羊肚菌胞外多糖（MEP）對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.3 Inhibition rate of MEP to α-glucosidase

由圖3可知，MEP可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，但不如常規(guī)藥品阿卡波糖抑制率高。需要注意由于阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果較強(qiáng)，本研究中MEP的濃度為0.1 mg/mL～0.8 mg/mL，而阿卡波糖的濃度為0.01 mg/mL～0.08 mg/mL。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著MEP濃度增大，其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制效果越來(lái)越明顯，但是最后隨著濃度增加，其抑制增長(zhǎng)率趨于穩(wěn)定，推測(cè)是由于MEP的抑制作用趨于穩(wěn)定或者飽和導(dǎo)致。多種真菌的多糖都對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用。朱振等報(bào)道了蛹蟲草多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其多糖的抑制作用低于阿卡波糖，半數(shù)抑制的時(shí)候濃度為4.22 mg/mL，而且當(dāng)濃度較高時(shí)其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用同樣會(huì)趨于平緩甚至下降，呈現(xiàn)出飽和的狀態(tài)，這與本研究結(jié)果較為一致[17]。魯梅等研究了灰樹(shù)花多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，報(bào)道的半數(shù)抑制濃度為35.79 mg/mL[18]。

α-淀粉酶可以水解食物中的淀粉類物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖，之后被小腸吸收進(jìn)入血液，提高血糖濃度。研究表明，抑制α-淀粉酶的活性也是抑制血糖升高和篩選降血糖藥物的有效方法之一，羊肚菌胞外多糖（MEP）對(duì)α-淀粉酶抑制率見(jiàn)圖4。

圖4 羊肚菌胞外多糖（MEP）對(duì)α-淀粉酶抑制率Fig.4 Inhibition rate of MEP to α-amylase

由圖4可知MEP具有抑制α-淀粉酶活性的作用，而且在一定范圍內(nèi)，隨著多糖濃度增大，其抑制作用越明顯。這與圖3中顯示的結(jié)果相似。之后再隨著MEP濃度的增加，其對(duì)α-淀粉酶的活性的抑制率不再上升，說(shuō)明MEP對(duì)α-淀粉酶的活性抑制作用有飽和效應(yīng)。影響多糖對(duì)α-淀粉酶抑制活性的因素較多，不僅有多糖自身的分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象，同時(shí)還包括多糖中雜質(zhì)的含量。尤玲玲等報(bào)道了黃秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制活性，研究結(jié)果表明相比于粗多糖，經(jīng)過(guò)脫蛋白處理后的多糖其對(duì)α-淀粉酶的抑制活性顯著降低[19]。

2.4 MEP對(duì)脂肪酶抑制率

本研究中MEP的降血脂活性通過(guò)對(duì)脂肪酶抑制率和膽酸鹽結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定。脂肪酶抑制試驗(yàn)原理是脂肪酶水解油脂產(chǎn)生脂肪酸，游離脂肪酸再與NaOH結(jié)合，通過(guò)滴定來(lái)確定消耗NaOH的量間接確定脂肪酶的活性。多種活性多糖在脂肪酶水解甘油三酸酯反應(yīng)中起抑制劑作用。羊肚菌胞外多糖（MEP）對(duì)脂肪酶抑制率見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著MEP濃度增加，其對(duì)脂肪酶的抑制作用也增強(qiáng)。在MEP濃度達(dá)到5 mg/mL后，其對(duì)脂肪酶活性的抑制率達(dá)到30%，表現(xiàn)出一定的飽和效應(yīng)。冉琳等研究了黑木耳多糖對(duì)脂肪酶的抑制作用，研究結(jié)果顯示黑木耳多糖對(duì)脂肪酶的最高抑制率為47%左右，之后提高多糖濃度，也沒(méi)有觀測(cè)到脂肪酶活性受到進(jìn)一步的抑制，所以推測(cè)黑木耳多糖只是改變脂肪酶的構(gòu)象，從而達(dá)到影響其催化活性的目的，但是不使脂肪酶失活[20]。由于試驗(yàn)結(jié)果與冉琳等的試驗(yàn)結(jié)果相似，所以推測(cè)羊肚菌多糖只是通過(guò)改變脂肪酶的構(gòu)象而不是使脂肪酶失活來(lái)達(dá)到降低脂肪酶活性的目的。

圖5 羊肚菌胞外多糖（MEP）對(duì)脂肪酶抑制率Fig.5 Inhibition rate of MEP to lipase

2.5 MEP的膽酸鹽結(jié)合率

膽酸鹽是體內(nèi)排泄膽固醇的主要途徑，大部分膽酸鹽經(jīng)過(guò)腸道-肝臟進(jìn)行回收。而通過(guò)結(jié)合膽酸鹽可以有效排除體內(nèi)膽汁酸，間接降低膽固醇含量，達(dá)到降低血脂的目標(biāo)。本研究中以甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在387 nm下測(cè)定其吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖6。得到回歸方程，分別為y=2.319 4x+0.096 81和y=2.234 5x+0.078 1，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.996 4和R2=0.991 9。

圖6 ?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of sodium taurocholate（ST）and sodium glycocholate（SG）

分別制備 1.6 μmol/mL和2.0 μmol/mL的甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c溶液作為檢測(cè)MEP對(duì)膽酸鹽結(jié)合率的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見(jiàn)圖7。

如圖7所示，MEP對(duì)兩種膽酸鹽都有一定的結(jié)合能力，當(dāng)MEP的濃度達(dá)5 mg/mL時(shí)，牛黃膽酸鈉的結(jié)合率達(dá)到了35%左右，甘氨膽酸鈉也達(dá)到了30%左右。羊肚菌多糖的膽酸鹽結(jié)合率和楊青松等報(bào)道的水溶性紅雪茶多糖結(jié)合膽酸鹽率相似[21]，但是要低于王振宇等報(bào)道的黑木耳多糖的膽酸鹽結(jié)合率[22]。

圖7 羊肚菌胞外多糖（MEP）與?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率Fig.7 Binding rate of MEP with sodium taurocholate（ST）and sodium glycocholate（SG）

2.6 MEP對(duì)葡萄糖擴(kuò)散的影響

葡萄糖在小腸中的擴(kuò)散速率對(duì)其吸以及血糖升高均有影響。部分多糖溶液可以延緩葡萄糖在血液中的擴(kuò)散，從而達(dá)到抑制血糖升高的作用。MEP對(duì)葡萄糖擴(kuò)散的抑制作用見(jiàn)圖8。

圖8 羊肚菌胞外多糖（MEP）對(duì)葡萄糖擴(kuò)散的抑制作用Fig.8 Inhibition ability of MEP on glucose

由圖8可知，與對(duì)照組相比，MEP可以有效抑制葡萄糖擴(kuò)散速率，說(shuō)明MEP具有抑制葡萄糖吸收的功能。前期對(duì)于粒毛盤菌多糖的研究結(jié)果顯示粒毛盤菌多糖可以抑制葡萄糖的擴(kuò)散，同時(shí)通過(guò)化學(xué)修飾，可以提高其對(duì)于葡萄糖擴(kuò)散的抑制作用，說(shuō)明多糖的結(jié)構(gòu)對(duì)葡萄糖的結(jié)合或者擴(kuò)散抑制具有一定的影響[23]。

3 結(jié)論

本研究對(duì)羊肚菌胞外多糖進(jìn)行了分離純化，并對(duì)其體外降血糖和降血脂活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示通過(guò)液體深層發(fā)酵可以獲得羊肚菌胞外多糖（MEP），在脫蛋白和脫色透析后，MEP主要成分為中性多糖，且包含少量的酸性多糖。同時(shí)，MEP對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性具有一定的抑制作用，在較高濃度條件下，MEP對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分別達(dá)到53.13%和54.76%，MEP對(duì)兩種膽酸鹽也具有一定的結(jié)合能力，并且呈現(xiàn)計(jì)量依賴效應(yīng)，MEP對(duì)胰脂肪酶的抑制率在較高濃度（5 mg/mL）也可以接近30%，并且可以在一定程度上抑制葡萄糖的擴(kuò)散。以上結(jié)果顯示，MEP具有較強(qiáng)的降血糖和降血脂活性，但其在體內(nèi)的作用效果和機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。