魏萌 蔣紅利 史珂慧 王萌 孫凌霜 何荃

710061 西安，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液凈化科

慢性腎臟病患者由于腎小球?yàn)V過(guò)率持續(xù)降低，大量的尿毒癥毒素如尿素、尿酸、胺類、胍類、吲哚類、未完全代謝的激素等在體內(nèi)潴留，血液中多種代謝廢物不斷蓄積，患者逐漸產(chǎn)生尿毒癥的各種癥狀，以胃腸道癥狀尤為突出[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者存在嚴(yán)重腸道屏障功能障礙，尿毒癥大鼠出現(xiàn)腸道細(xì)菌移位且腸道通透性增高[2-3]，腸道菌群移位參與尿毒癥微炎癥狀態(tài)的產(chǎn)生和發(fā)展，而微炎癥與多種尿毒癥并發(fā)癥密切相關(guān)[4-5]。益生菌具有改善腸道屏障完整性，抑制病原菌黏附定植，調(diào)節(jié)腸道免疫力等多種有益作用[6]。動(dòng)物雙岐桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)是目前研究較多、應(yīng)用較廣泛的益生菌菌種，多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)腸道屏障功能的卓越效果[7-8]。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)尿毒癥大鼠口服補(bǔ)充益生菌動(dòng)物雙岐桿菌乳亞種Bi-07，研究益生菌是否可改善尿毒癥大鼠腸道屏障功能障礙，并同時(shí)探討益生菌對(duì)腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，以期揭示補(bǔ)充益生菌改善腸道屏障功能的作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究益生菌干預(yù)改善尿毒癥患者多種并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、尿毒癥動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

取雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)以及模型組(n=30)，模型組采用5/6腎切除法制備尿毒癥動(dòng)物模型，假手術(shù)組僅打開(kāi)腎包膜。至第10周末，模型組有20只大鼠達(dá)到尿毒癥腎功能水平，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，分為尿毒癥組(n=10)和尿毒癥+益生菌組(n=10)。將動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bi-07凍干粉接種至改良TPY培養(yǎng)基復(fù)蘇后，取少量菌液再次接種至TPY培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌液濃度至109Cfu/mL。取菌液1 mL灌胃尿毒癥+益生菌組大鼠，灌胃后給予正常飲水及飲食，每日灌胃，共持續(xù)4周。假手術(shù)組和尿毒癥組大鼠均行普通飲水飲食處理。

二、腎臟及腸道組織病理學(xué)

三組大鼠采用水合氯醛麻醉后，分別取空腸、回腸、結(jié)腸腸道組織標(biāo)本按常規(guī)脫水、透明、包埋，石蠟切片3～4 μm。按組別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

三、腸道通透性的檢測(cè)

每只大鼠均給予含有5 μCi/mL的99mTc-DTPA溶液1 mL灌胃后，置于代謝籠中，以新的清潔塑料杯收集每只大鼠24 h尿液。24 h后測(cè)定每只大鼠的尿量，取少量尿液用于檢測(cè)尿中所含的核素量。同時(shí)采用斷尾法留取大鼠血液用于測(cè)定殘留在血液中的核素濃度。通過(guò)估算每只大鼠的血液量換算出殘留在其體內(nèi)的核素量。核素的檢測(cè)在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程由其臨檢人員執(zhí)行。腸道的通透性以24 h尿液中所含的99mTc-DTPA總量及殘留在血液中的核素量之和占灌胃給予的99mTc-DTPA量的百分比表示，計(jì)算公式如下：

大鼠總血量(mL)=0.06×體質(zhì)量(g)+0.77[9]

放射劑量(血)=核素濃度×總血量(mL)

放射劑量(尿)=核素濃度×總尿量(mL)

四、免疫比濁法檢測(cè)超敏C反應(yīng)蛋白

采用散射免疫比濁法測(cè)定血清超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)。檢測(cè)操作委托西安交通大學(xué)醫(yī)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科。檢測(cè)嚴(yán)格按照hs-CRP試劑盒說(shuō)明操作。

五、血清中炎癥因子白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子α水平檢測(cè)

所有樣品血清均進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

六、硝酸鑭示蹤法觀察腸上皮細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)

各組隨機(jī)選取5只大鼠，分別留取回腸組織標(biāo)本0.5 cm，生理鹽水充分漂洗去除黏附的腸道內(nèi)容物。迅速將標(biāo)本置入3%硝酸鑭-0.1 mol/L二甲胂酸鈉-3%戊二醛的固定液中，固定2 h。取出標(biāo)本，于3%硝酸鑭-0.1 mol/L二甲胂酸鈉的緩沖液漂洗2次，每次10 min。再經(jīng)含2%硝酸斕-1%四氧化鋨固定液作后固定2 h，0.1 mol/L二甲胂酸鈉的緩沖液浸洗后，常規(guī)電鏡梯度丙酮或乙醇脫水，Epon812包埋。超薄切片機(jī)切片，每份標(biāo)本在透射電鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野。

七、腸組織丙二醛含量及超氧化物歧化酶活力檢測(cè)

將凍存于-80 ℃的回腸組織取出，稱重后置入4 ℃生理鹽水中勻漿。以1 500 rpm離心15 min，取上清。勻漿液蛋白定量采用考馬氏亮蘭蛋白法。采用硫代巴比妥酸縮合法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，MDA測(cè)試盒由南京建成生物公司提供，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采取黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力，SOD測(cè)試盒由南京建成生物公司提供，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠一般情況及生化指標(biāo)比較

術(shù)后三組大鼠傷口無(wú)出血和感染。尿毒癥組大鼠逐漸表現(xiàn)出活動(dòng)量減少、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，喜拱背蜷縮，食物攝入量減少，且體質(zhì)量增長(zhǎng)速度減緩，毛色轉(zhuǎn)黃干枯，疏松不齊，眼、耳、尾逐漸變蒼白。假手術(shù)組活動(dòng)靈活，毛色、眼、耳及尾部均無(wú)異常變化，食量隨體質(zhì)量增長(zhǎng)不斷增加，尿量無(wú)異常改變。尿毒癥+益生菌組大鼠基本情況同尿毒癥組。

術(shù)后7天模型組大鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿素氮、血肌酐水平逐漸升高，術(shù)后第10周，5/6腎切除建模大鼠共有20只存活且血肌酐水平達(dá)到尿毒癥標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組10只大鼠全部存活。尿毒癥組、尿毒癥+益生菌組大鼠紅細(xì)胞比容均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，尿毒癥組大鼠尿量有減少趨勢(shì)，但與假手術(shù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(表1)

表1 三組大鼠基本生物學(xué)參數(shù)

二、光鏡下各組大鼠腸道病理情況比較

假手術(shù)組大鼠各腸段呈正常腸組織形態(tài)，腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰飽滿，炎性細(xì)胞數(shù)量較少且分布均勻，絨毛部腸上皮細(xì)胞間可見(jiàn)大量吸收細(xì)胞。

尿毒癥組空腸、回腸明顯可見(jiàn)腸絨毛萎縮變細(xì)、倒塌，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，吸收細(xì)胞減少，空腸、回腸固有層及黏膜下層可見(jiàn)局部水腫，部分腸黏膜見(jiàn)淺表的潰瘍形成。結(jié)腸亦見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但與假手術(shù)組相比差異較小。

尿毒癥+益生菌組空腸、回腸仍可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度較尿毒癥組減輕，空腸、回腸固有層及黏膜下層可見(jiàn)局部水腫，幾乎不可見(jiàn)腸黏膜淺表潰瘍。結(jié)腸亦見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但與假手術(shù)組差異較小。(圖1)

圖1 三組大鼠空腸、回腸、結(jié)腸病理圖(HE染色) A.假手術(shù)組空腸(×100)；B.假手術(shù)組回腸(×200)；C.假手術(shù)組結(jié)腸(×100)；D.尿毒癥組空腸(×100)；E.尿毒癥組回腸(×200)；F.尿毒癥組結(jié)腸(×100)；G.尿毒癥+益生菌組空腸(×100)；H.尿毒癥+益生菌組回腸(×200)；I.尿毒癥+益生菌組結(jié)腸(×100)

三、各組大鼠腸道通透性比較

尿毒癥組腸道通透性顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與尿毒癥組相比較，尿毒癥+益生菌組腸道通透性顯著降低(P<0.05)；尿毒癥+益生菌組與假手術(shù)組相比較，腸道通透性無(wú)顯著差異(P>0.05)。(表2)

四、各組大鼠炎癥介質(zhì)水平比較

尿毒癥組hs-CRP、IL-6、TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與尿毒癥組相比較，尿毒癥+益生菌組hs-CRP、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；尿毒癥+益生菌組與假手術(shù)組相比，hs-CRP、IL-6、TNF-α水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。(表2)

表2 三組大鼠血炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素及腸道通透性

五、電鏡下各組大鼠腸道病理情況比較

假手術(shù)組回腸上皮細(xì)胞微絨毛表面少見(jiàn)鑭顆粒附著，腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)高電子致密物硝酸鑭滲入。

尿毒癥組回腸上皮細(xì)胞微絨毛表面附著大量鑭顆粒，高電子致密物硝酸鑭清晰分隔所有細(xì)胞外膜，不僅上皮細(xì)胞間緊密連接破壞可容硝酸鑭滲入，細(xì)胞之間所有接觸部位均有大量硝酸鑭滲入。

尿毒癥+益生菌組回腸上皮細(xì)胞微絨毛表面有少量鑭顆粒附著，可見(jiàn)少量示蹤劑滲入細(xì)胞間隙，極少部分細(xì)胞間隙呈高電子密度影，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)模糊。盡管硝酸鑭可通過(guò)連接復(fù)合體，但是并未見(jiàn)硝酸鑭下行滲入深面細(xì)胞膜。(圖2)

注：箭頭示硝酸鑭染料聚集

六、各組大鼠腸組織MDA含量及SOD活力比較

回腸組織MDA含量及SOD活力反映組織氧化損傷程度。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，尿毒癥組回腸組織中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活力顯著降低(P<0.05)。與尿毒癥相比較，尿毒癥+益生菌組SOD活力顯著升高(P<0.05)，與假手術(shù)組相比較，尿毒癥+益生菌組SOD活力無(wú)顯著差異(P>0.05)。與尿毒癥組相比較，尿毒癥+益生菌組MDA含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表3)

表3 三組大鼠腸組織SOD活力及MDA含量

討 論

本研究中我們對(duì)尿毒癥大鼠補(bǔ)充益生菌動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bi-07，并從腸道通透性、血炎癥因子、腸道氧化應(yīng)激水平以及腸道超微結(jié)構(gòu)多個(gè)方面研究益生菌對(duì)尿毒癥腸屏障的保護(hù)作用，結(jié)果顯示尿毒癥大鼠補(bǔ)充益生菌后，腸上皮細(xì)胞間緊密連接完整性恢復(fù)，腸道通透性下降、腸道氧化應(yīng)激減輕，血中炎癥因子水平改善，提示補(bǔ)充益生菌動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bi-07可改善腸道屏障功能，其機(jī)理與降低腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，并能夠在一定程度上改善尿毒癥微炎癥狀態(tài)。

正常情況下，腸道正常菌群之間保持著相當(dāng)穩(wěn)定的比例關(guān)系，它們與腸道黏膜結(jié)合，以黏附或嵌合的方式形成有一定規(guī)律的膜菌群，與宿主的微空間結(jié)構(gòu)形成一個(gè)既相互依賴又相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)，這種微生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了腸道的微生物屏障。在構(gòu)成腸道生物屏障的眾多細(xì)菌中，雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是主要的共生菌類，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌被認(rèn)為是人類宿主最重要的有益菌[10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)終末期腎病患者及大鼠腸道菌群譜發(fā)生了改變，乳酸桿菌、雙歧桿菌及擬桿菌門(mén)等益生菌減少，梭狀芽胞桿菌、腸桿菌科、產(chǎn)氣莢膜梭菌等致病菌增多[2-3]。腸道菌群譜的改變使得腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物發(fā)生改變，也使得腸道來(lái)源的尿毒癥毒素譜發(fā)生改變。

益生菌是指“對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生有益影響的微生物”。目前，益生菌在炎癥性腸病[11]、肝硬化[12]、腸易激綜合征[13]、抗生素相關(guān)性腹瀉[14]等疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，主要作用機(jī)制包括維持腸道屏障完整性，調(diào)節(jié)腸道局部免疫力，保持正常菌群結(jié)構(gòu)，降低病原體對(duì)腸道附著力并抑制其繁殖。研究證明尿毒癥患者及動(dòng)物較常出現(xiàn)腸道黏膜局部水腫糜爛、腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙、腸道局部及全身免疫力低下，腸道黏膜屏障損害普遍存在[15]。因此，針對(duì)性的給予尿毒癥大鼠補(bǔ)充其明確缺乏的益生菌，可能起到穩(wěn)定腸道屏障功能的作用。

益生菌攝入機(jī)體后，其自身或表面成分作為抗原物質(zhì)刺激機(jī)體免疫。腸道內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞對(duì)其水解、消化、加工，繼之與Th細(xì)胞相互作用，最終激活腸道固有層內(nèi)B淋巴細(xì)胞。在益生菌的不斷刺激下，B淋巴細(xì)胞分化增強(qiáng)，大量的成熟漿細(xì)胞可分泌sIgA、IgG、IgM。益生菌能夠?qū)δc黏膜中免疫細(xì)胞刺激、誘導(dǎo)分化，而免疫細(xì)胞充分發(fā)揮其攝取、抗原呈遞的作用，故產(chǎn)生大量的免疫效應(yīng)因子，抵抗外源性致病菌對(duì)機(jī)體損害，進(jìn)而保護(hù)腸道的免疫屏障。

腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)在維持腸黏膜的通透性和完整性方面起著重要作用，是構(gòu)成腸黏膜機(jī)械屏障的重要組成部分。硝酸鑭是一種高密度的重金屬，分子量為433，其顆粒大小約為1～4 nm，不能穿過(guò)正常的細(xì)胞間緊密連接和細(xì)胞膜，故其常用于判斷組織細(xì)胞間是否存在緊密連接、屏障功能及細(xì)胞膜通透性改變，是超微結(jié)構(gòu)水平常用的示蹤物[16]。硝酸鑭染色結(jié)合透射電鏡方法觀察緊密連接其結(jié)果直觀反映腸道機(jī)械屏障完整性。本研究采用硝酸鑭示蹤劑染色觀察腸上皮細(xì)胞間緊密連接，發(fā)現(xiàn)尿毒癥組大鼠的腸黏膜細(xì)胞間緊密連接間隙明顯增寬，示蹤劑有不同程度的滲透現(xiàn)象。在尿毒癥+益生菌組大鼠腸組織中示蹤劑滲透減少，提示益生菌干預(yù)可改善腸上皮細(xì)胞間緊密連接完整性，保護(hù)腸道的機(jī)械屏障功能。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)最終代謝產(chǎn)物，反映了機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的速度和強(qiáng)度，SOD是體內(nèi)主要的自由基清除劑，保護(hù)機(jī)體組織和細(xì)胞DNA免受氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)：尿毒癥大鼠腸道組織MDA含量增加，SOD活性降低，表明尿毒癥大鼠腸道過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，大量的氧自由基可能參與腸道屏障功能損傷。脂質(zhì)過(guò)氧化作用可引起細(xì)胞損傷及功能障礙，大量的氧自由基能攻擊生物膜中的多聚不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并形成過(guò)氧化產(chǎn)物。尿毒癥時(shí)SOD等抗氧化酶減少，使機(jī)體不能有效清除脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基，脂質(zhì)雙層在氧自由基的作用下膜表面糖蛋白結(jié)構(gòu)含量出現(xiàn)改變，脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)生理性穩(wěn)態(tài)異常。另外，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞內(nèi)多種酶活性，如三磷酸腺苷酶、堿性磷酸酶和核苷酸酶結(jié)構(gòu)異常，三磷酸腺苷生成減少使得細(xì)胞膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙[17-18]。因此我們推測(cè)腸道中過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)可能與腸道屏障功能障礙有關(guān)。本項(xiàng)目在對(duì)尿毒癥大鼠補(bǔ)充益生菌動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bi-07后，結(jié)果顯示腸組織中SOD活力顯著增強(qiáng)，MDA呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明補(bǔ)充益生菌后腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，提示益生菌動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bi-07保護(hù)腸道屏障完整性的機(jī)理為抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。動(dòng)物雙歧桿菌不表達(dá)尿素酶基因，因此可避免尿素衍生的胺類和細(xì)菌尿素酶催化的氨對(duì)腸屏障的破壞作用。

本項(xiàng)目補(bǔ)充益生菌后大鼠血液中IL-6、TNF-α、hs-CRP等微炎癥指標(biāo)也顯著改善，提示益生菌可改善尿毒癥大鼠微炎癥反應(yīng)。增加有益菌數(shù)量，可減少潛在致病菌數(shù)量，可以競(jìng)爭(zhēng)性的阻止病原菌黏附定植在腸黏膜。雙歧桿菌通過(guò)維持腸上皮細(xì)胞間緊密連接的蛋白表達(dá)，維持腸屏障的完整性[19]，能夠調(diào)節(jié)非特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，增加粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬活力，移位的細(xì)菌因此可以被俘獲和清除[20]。

綜上所述，尿毒癥大鼠補(bǔ)充益生菌動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bi-07保護(hù)腸道屏障功能，可減輕尿毒癥微炎癥狀態(tài)，其機(jī)理與降低腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，然而在尿毒癥狀態(tài)下，益生菌動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bi-07改善腸道屏障功能的分子機(jī)制還值得進(jìn)一步探討。