周燕 郭珊嵐 蘭秀君 鄭紅

641300 資陽，四川省資陽市第一人民醫(yī)院腎病內(nèi)科(周燕，蘭秀君),病理科(郭珊嵐),檢驗(yàn)科(鄭紅)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的并發(fā)癥之一，腎小管上皮細(xì)胞損傷在DN發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，而腎小管上皮細(xì)胞損傷主要包括炎性損傷、細(xì)胞凋亡等[1]。研究表明高糖環(huán)境可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷[2]。目前關(guān)于腎小管上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制尚未完全闡明，國(guó)外研究表明miR-29c、miR-216a-5p等miRNA可通過調(diào)控靶基因表達(dá)從而參與DN發(fā)生及發(fā)展過程[3-4]。但仍有部分miRNA在DN發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚未闡明。因而探究其發(fā)生機(jī)制有助于診斷及治療DN。miR-4429在DN患者中呈高表達(dá)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明[5-6]。生物信息學(xué)分析顯示依賴還原型輔酶/醌氧化還原酶1(NADH quinone dehydrogenase 1，NQO1)可能是miR-4429的靶基因，研究表明NQO1屬于抗氧化基因，并可拮抗高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7-8]。但miR-4429是否可通過調(diào)控NQO1從而參與腎小管上皮細(xì)胞損傷過程尚未可知。本研究通過高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，觀察細(xì)胞中miR-4429與NQO1的表達(dá)，分析miR-4429與NQO1對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷及炎性因子分泌的影響，旨在為進(jìn)一步揭示腎小管上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料與試劑

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自上海通派生物科技有限公司；D-葡萄糖購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購自美國(guó)Thermo Fisher公司；Lipofectamine2000購自上海潤(rùn)成生物科技有限公司；miR-4429特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-4429)及陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC)、miR-4429寡核苷酸模擬物(miR-4429 mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、NQO1小干擾RNA(si-NQO1)及陰性對(duì)照序列(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自上海澤葉生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海朗智生物科技有限公司；RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司；二喹啉甲酸蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自武漢卡諾斯科技有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗體購自美國(guó)CST公司；兔抗人NQO1抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；丙二醛(malondialedhyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Abnova公司；白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

二、方法

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×104個(gè)/mL，按照每孔100 μL的密度接種于6孔板，用含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記作高糖組(HG組)[9]；用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記作正常對(duì)照組(Control 1組)；用含有50 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記作高滲對(duì)照組(Control 2組)。取對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，分別將anti-miR-NC、anti-miR-4429、anti-miR-4429與si-NC、anti-miR-4429與si-NQO1轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記作HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-4429組、HG+anti-miR-4429+si-NC組、HG+anti-miR-4429+si-NQO1組。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000試劑說明書，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-4429、NQO1 mRNA的表達(dá)水平 收集各組腎小管上皮細(xì)胞，采用Trizol法提取腎小管上皮細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。miR-4429正向引物5′-TCTCTCCAACTCAGACTGCC-3′，反向引物5′-AAAGCAAGTCAGGGAAGCCT-3′；NQO1正向引物5′-TCCCAGGTTCCAGCAATTCT-3′，反向引物5′-CACTTTGGGAGGCTGAGGTA-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2 μL，正反向引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)。miR-4429以U6為內(nèi)參，NQO1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-4429、NQO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組對(duì)數(shù)期腎小管上皮細(xì)胞接種于96孔板(3×104個(gè)/孔)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 300 r/min離心5 min，棄上清液，按照每孔150 μL的密度加入二甲基亞砜(DMSO)，室溫避光振蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率(%)=[(各實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(正常對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組對(duì)數(shù)期腎小管上皮細(xì)胞，1 000 r/min離心6 min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素，充分混勻，加入5 μL碘化丙啶，室溫振蕩孵育10 min，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

5.檢測(cè)MDA含量與SOD活性 收集各組對(duì)數(shù)期腎小管上皮細(xì)胞，按照試劑盒說明書分別檢測(cè)MDA含量與SOD活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

6.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-1β、TNF-α濃度 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

7.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-4429的靶基因 starBase預(yù)測(cè)顯示NQO1的3′UTR含有miR-4429的互補(bǔ)序列，將結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)分別插入熒光素酶報(bào)告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-NQO1與突變型載體MUT-NQO1，分別將WT-NQO1、MUT-NQO1與miR-NC、miR-4429 mimics共轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞，按照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。參照Lipofectamine2000說明書分別將miR-NC、miR-4429、anti-miR-NC、anti-miR-4429轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞，通過qRT-PCR與蛋白免疫印跡法(western blot)檢測(cè)各組細(xì)胞中NQO1 mRNA及蛋白表達(dá)量。

8.Western blot檢測(cè)NQO1、Caspase-3蛋白表達(dá) 收集各組對(duì)數(shù)期腎小管上皮細(xì)胞，加入蛋白裂解液(1 mL RIPA、1%苯甲基磺酰氟、0.1% 抑肽酶)，冰上裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min(離心半徑6 cm)離心15 min，吸取上清液。采用二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液，高溫煮沸，蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入NQO1(稀釋比1∶1 000)、Caspase-3(稀釋比1∶1 000)與內(nèi)參GAPDH(稀釋比1∶2 000)一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(稀釋比1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，應(yīng)用Quantityone軟件檢測(cè)條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、miR-4429、NQO1 mRNA在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

與Control 1組、Control 2組相比，HG組細(xì)胞中miR-4429的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，NQO1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。(表1)

表1 miR-4429、NQO1 mRNA在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)量比較(n=9)

二、抑制miR-4429對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞存活率及凋亡的影響

與Control 1、Control 2組相比，HG組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-4429組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。(圖1、表2)

注：與Control 1組和Control 2組比較，aP<0.05；與HG+anti-miR-NC組比較，bP<0.05

表2 抑制miR-4429對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞存活率及凋亡的影響(n=9)

三、抑制miR-4429對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響

相較于Control 1、Control 2組，HG組細(xì)胞中MDA、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-4429組細(xì)胞中MDA、IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。(表3)

表3 抑制miR-4429對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中炎癥因子分泌的影響

四、miR-4429靶向調(diào)控NQO1的表達(dá)

starBase預(yù)測(cè)顯示NQO1的3′UTR含有miR-4429的互補(bǔ)序列，見圖2A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型載體WT-NQO1的細(xì)胞中，miR-4429組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-NQO1的細(xì)胞中，miR-4429組與miR-NC組熒光素酶活性相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。qRT-PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-4429組細(xì)胞中NQO1 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-4429組細(xì)胞中NQO1 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(圖2B、表5)。

圖2 miR-4429對(duì)NQO1靶向調(diào)控作用 A.NQO1的3’UTR含有miR-4429的互補(bǔ)序列；B.4組細(xì)胞NQO1蛋白的表達(dá)情況

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表5 miR-4429調(diào)控NQO1的表達(dá)(n=9)

五、抑制NQO1聯(lián)合抑制miR-4429對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥因子分泌的影響

與HG+anti-miR-4429+si-NC組相比，HG+anti-miR-4429+si-NQO1組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)，IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。(圖3、表6)

表6 兩組細(xì)胞存活率、凋亡率、氧化應(yīng)激及炎癥因子比較(n=9)

圖3 抑制NQO1聯(lián)合抑制miR-4429對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及NQO1、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響A.兩組腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況；B.兩組NQO1、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

討 論

DN的主要病理特征是腎小球病變，而腎功能損傷與腎小球病變密切相關(guān)，研究表明腎小管上皮細(xì)胞凋亡是促使腎小球病變的重要原因之一，同時(shí)炎性損傷與氧化損傷等多種因素也可促使腎小球病變[10]。研究表明miRNA可參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程[11]。相關(guān)報(bào)道指出高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞是DN腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，并可用于體外實(shí)驗(yàn)研究[12]。本研究結(jié)果顯示高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯增多，提示成功構(gòu)建DN腎小管上皮細(xì)胞損傷模型。

本研究結(jié)果顯示高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中miR-4429的表達(dá)水平明顯升高。研究表明miR-4429在急性缺血性中風(fēng)、肥胖相關(guān)疾病中表達(dá)上調(diào)，并可能參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過程[13-14]。但miR-4429在DN腎小管上皮細(xì)胞損傷發(fā)生過程中的調(diào)控機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果提示miR-4429表達(dá)量升高可能促進(jìn)DN腎小管上皮細(xì)胞損傷的發(fā)生進(jìn)而參與DN的發(fā)生過程，進(jìn)一步分析顯示抑制miR-4429表達(dá)后可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，降低Caspase-3表達(dá)量，提示抑制miR-4429表達(dá)可能通過下調(diào)Caspase-3表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷并減緩DN的發(fā)展進(jìn)程。

有研究表明糖尿病引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)可加重腎小管上皮細(xì)胞損傷，降低MDA含量，增強(qiáng)SOD活性可明顯提高細(xì)胞抗氧化能力[15]。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低，而抑制miR-4429表達(dá)可明顯提高SOD活性，減低MDA含量，提示抑制miR-4429表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷。相關(guān)報(bào)道指出腎小管上皮細(xì)胞凋亡與腎臟組織炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，IL-1β、TNF-α可引起細(xì)胞損傷從而間接促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示,抑制miR-4429表達(dá)可減少高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α，提示抑制miR-4429表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷。

本研究通過生物信息學(xué)分析顯示NQO1可能是miR-4429的靶基因，進(jìn)一步分析顯示miR-4429能夠靶向結(jié)合NQO1，并可負(fù)向調(diào)控NQO1的表達(dá)。研究表明NQO1可催化醌類化合物形成水合醌類，還可與葡萄糖醛酸等形成共軛鍵而穩(wěn)定存在于細(xì)胞中，其發(fā)生反應(yīng)的過程中沒有自由基等氧化產(chǎn)物形成從而可保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[17]。研究表明上調(diào)NQO1表達(dá)可減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞氧化損傷[18]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中NQO1表達(dá)量明顯降低，提示miR-4429可能通過調(diào)控NQO1的表達(dá)從而參與腎小管上皮細(xì)胞損傷過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，抑制NQO1表達(dá)后可明顯減弱抑制miR-4429表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用,提示抑制miR-4429表達(dá)可靶向上調(diào)NQO1表達(dá)從而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，減輕炎癥損傷，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。

綜上所述，在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中，miR-4429表達(dá)上調(diào)，NQO1表達(dá)下調(diào)，miR-4429可能靶向調(diào)控NQO1的表達(dá)從而加重高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷；抑制miR-4429表達(dá)可明顯減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷及氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，可為揭示DN發(fā)生機(jī)制提供新方向。