楊蕾 韋芬 張凱 仇晶晶 汪瑩瑩 都偉欣 盧錦標 陶立峰 蒲江

重組結核桿菌融合蛋白(EC)[該制品名稱是國家藥典委員會確定的藥品中文通用名稱，“EC”為重組融合蛋白“結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)”](以下簡稱“EC”)是安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司自主研發(fā)的產品，該產品利用基因工程技術將ESAT-6和CFP-10基因融合后表達ESAT-6與CFP-10蛋白，能有效鑒別卡介苗(BCG)接種和結核分枝桿菌(MTB)感染，是一種特異性強、使用方便的MTB感染用體內診斷試劑[1-3]。由于蛋白對溫度敏感，存放溫度不當可能導致其理化性質、免疫原性和效價發(fā)生變化，因此，該類制品的溫度穩(wěn)定性是質量控制的關鍵因素，對制品的儲存、運輸、分發(fā)和使用有重要指導作用[4-5]。筆者根據《生物制品穩(wěn)定性研究技術指導原則(試行)》[6]對EC原液、成品進行儲存穩(wěn)定性及成品使用穩(wěn)定性研究，獲得EC穩(wěn)定性試驗結果，為該產品的生產、運輸、貯存和使用方法的制訂提供了數據支持。

材料和方法

一、材料與來源

EC原液，液體劑型，規(guī)格為≥450 μg/ml，批號為M20101101、M20101102、M20101201；EC成品，液體劑型，規(guī)格為每瓶15 U/0.3 ml，批號為20150501c、20150502c、20150503c；EC成品，液體劑型，規(guī)格為每瓶50 U/1.0 ml，批號為20171204、20171205、20171206；EC原液參考品，規(guī)格為≥450 μg/ml，成分與EC原液相同；EC成品參考品，規(guī)格為每瓶50 U/1.0 ml，成分與EC成品相同；EC穩(wěn)定劑為0.001 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)；均由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司研制。結核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD)，規(guī)格為50 IU/ml，北京祥瑞生物制品有限公司生產。

二、實驗動物

無特定病原體(SPF)級昆明(KM)小鼠，體質量18～20 g、雌雄不限，購自安徽醫(yī)科大學；SPF級Hartley豚鼠，體質量300～400 g，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

三、動物致敏用菌液

結核分枝桿菌減毒株(H37Ra)活菌菌液由上海復旦大學三級安全防護實驗室提供；BCG由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供。

四、主要儀器和試劑

紫外分光光度計為島津儀器(蘇州)有限公司產品；高效液相色譜儀(HPLC 1260)為安捷倫科技(中國)有限公司產品；等電點水平電泳儀為通用電氣(中國)有限公司產品；SpectraMax多功能酶標儀為美谷分子儀器(上海)有限公司產品；垂直電泳儀、小型轉印槽為伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司產品。

Quant-iTTMPicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；卡那霉素快速檢測試劑盒為北京勤邦生物技術有限公司產品；大腸埃希菌宿主菌蛋白質殘留量檢測試劑盒(E.Colihost cell protein)為美國Cygnus Techno-logies 公司產品；牛血清白蛋白購自中國食品藥品檢定研究院；重組結核分枝桿菌ESAT-6與CFP-10融合蛋白兔多抗由中國食品藥品檢定研究院分發(fā)；山羊抗兔IgG/辣根酶標記為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

五、方法

(一)原液儲存穩(wěn)定性研究

將3批EC原液(批號：M20101101、M20101102、M20101201)保存于-70 ℃，保存0、3、6、9、12、18、24、36個月時取樣檢測，檢測項目和檢測方法如下。

1. 致敏效應試驗：試驗組與對照組分別用體質量300～400 g未做過任何試驗的豚鼠各3只。試驗組每只豚鼠皮內注射0.1 ml EC原液，共3次，每次間隔5 d；對照組每只豚鼠皮內注射0.1 ml EC穩(wěn)定劑，共3次，每次間隔5 d。在第3次注射后15 d，試驗組與對照組均各皮內注射0.1 ml EC原液，觀察試驗組與對照組動物反應，連續(xù)觀察3 d。

2. 鑒別試驗：取經卡介苗致敏的豚鼠4只，以輪圈法于每只豚鼠背部脊柱兩側皮內注射20 μg/ml EC原液與50 IU/ml TB-PPD各0.2 ml；48 h后觀察測量TB-PPD局部反應硬結和EC原液局部反應硬結或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結或紅暈大者為準)，計算平均直徑(縱徑和橫徑測量值相加除以2)。

3．效價檢測：分別將EC原液及其參考品稀釋至2 μg/ml、4 μg/ml及6 μg/ml。取6只經MTB活菌致敏的豚鼠，去毛后于背部脊柱兩側以輪圈法分別皮內注射上述3種稀釋度的EC原液及其參考品各0.2 ml，分別于注射后24 h和48 h 2次測量局部反應硬結或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結或紅暈反應大者為準)，求出硬結或紅暈的平均直徑(縱徑與橫徑測量值相加除以2)；同時計算每個稀釋度注射后2次測量局部反應的平均硬結或紅暈直徑總和(每個稀釋度6只豚鼠皮內注射后24 h和48 h測量局部反應的硬結或紅暈平均直徑總和)，求出各稀釋度EC原液與相應稀釋度參考品皮內注射后2次測量局部反應的硬結或紅暈平均直徑總和的比值。

4. 理化檢定項目：EC原液外觀、蛋白質含量、純度(電泳法)、細菌內毒素檢查、無菌檢查、鑒別試驗(免疫印跡法)、分子量、等電點、紫外光譜掃描、外源性DNA殘留量、殘余抗生素活性、宿主菌蛋白殘留量、肽圖、N-端氨基酸序列，均按照《中華人民共和國藥典(2015年版 三部)》[7]所規(guī)定的方法進行。

(二)EC成品儲存穩(wěn)定性研究

將3批EC成品(批號：20150501c、20150502c、20150503c)分別保存于37 ℃和2～8 ℃。37 ℃保存0、7、14、21、28 d時取樣檢測；2～8 ℃保存0、3、6、9、12、18、24、36個月時取樣檢測。檢測項目和檢測方法如下。

1. 鑒別試驗：取經卡介苗致敏的豚鼠4只，以輪圈法于每只豚鼠背部脊柱兩側皮內注射EC成品與50 IU/ml TB-PPD各0.2 ml，48 h后觀察測量TB-PPD局部反應的硬結和EC成品局部反應的硬結或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結或紅暈大者為準)，計算平均直徑(縱徑和橫徑測量值相加除以2)。

2. 效價檢測：取4只經MTB活菌致敏的豚鼠，去毛后于背部脊柱兩側以輪圈法分別皮內注射EC成品及其參考品各0.2 ml，于注射后24、48 h分別測量局部反應硬結或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結或紅暈大者為準)，求出硬結或紅暈的平均直徑(縱徑與橫徑測量值相加除以2)，計算EC成品與其參考品皮內注射后2次的硬結或紅暈平均直徑總和(4只豚鼠皮內注射后24 h和48 h測量局部反應的硬結或紅暈平均直徑總和)，求出EC成品及其參考品皮內注射后2次測量局部反應的硬結或紅暈平均直徑總和的比值。

3. 理化檢定項目：EC成品外觀、裝量、pH值、苯酚含量、無菌檢查、異常毒性檢查，均按照《中華人民共和國藥典(2015年版 三部)》所述的方法進行。

(三)成品使用穩(wěn)定性研究

將3批EC成品(批號：20171204、20171205、20171206)開啟后分別放置溫度為(25±2) ℃、濕度為(60±5) %和溫度為(40±2) ℃、濕度為(75±5) %的條件下，分別于0、10、20、30、40、50 min取樣進行檢測。取樣方法為打開鋁塑蓋后從膠塞針刺位置使用一次性注射器多次抽取樣品進行檢測。檢測項目和檢定方法同上述“成品儲存穩(wěn)定性”，其中苯酚含量和裝量未檢驗，增加了按照《中華人民共和國藥典(2015年版 三部)》進行的不溶性微粒和滲透壓摩爾濃度檢測。

結 果

一、EC原液儲存穩(wěn)定性研究

(一)致敏效應試驗結果

檢測結果表明，3批次EC原液按照建立的致敏效應方法進行檢測，均表現為致敏后、攻擊后動物無異常反應，與對照組動物的表現無差異，符合制定的質量標準。

(二)鑒別試驗結果

檢測結果表明，3批次EC原液對BCG致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陰性，而TB-PPD對卡介苗致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陽性，符合制定的質量標準。

(三)效價檢測結果

檢測結果表明，不同稀釋度的3批次EC原液與相應稀釋度的參考品在皮內注射后24、48 h 2次所測量的硬結或紅暈平均直徑總和的比值均為1.0±0.2，符合制定的質量標準(表1)。

表1 不同儲存時間3個批次EC原液按照不同稀釋度皮內注射后的效價檢測結果(-70 ℃)

(四)理化檢測項目

檢測結果表明，3批次EC原液外觀、細菌內毒素檢查、無菌檢查、鑒別試驗(免疫印跡法)、外源性DNA殘留量、殘余抗生素活性、宿主菌蛋白殘留量、肽圖、N-端氨基酸序列、等電點、紫外光譜掃描、分子量、蛋白質含量、純度(電泳法)等指標，檢測結果均符合EC質量標準的規(guī)定。其中等電點、分子量、蛋白質含量和純度(電泳法)檢測結果見表2。

表2 不同儲存時間3個批次EC原液的理化檢測結果(-70 ℃)

二、EC成品儲存穩(wěn)定性研究

(一)鑒別試驗結果

檢測結果表明，3個批次EC成品對卡介苗致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陰性，而TB-PPD對卡介苗致敏組豚鼠的皮膚試驗呈陽性，符合制定的質量標準。

(二)效價檢測結果

檢測結果表明，3個批次EC成品與其參考品在皮內注射后24 h、48 h 2次所測量的硬結或紅暈平均直徑總和的比值均在1.0±0.2范圍內，符合制定的質量標準(表3，4)。

表3 不同儲存時間3個批次EC成品的效價檢測結果(37 ℃)

表4 不同儲存時間3個批次EC成品的效價檢測結果(2～8 ℃)

(三)理化檢測項目

檢測結果表明，3個批次EC成品外觀、裝量、無菌檢查、異常毒性檢查、pH值、苯酚等指標檢測結果均符合EC質量標準的規(guī)定，其中pH值和苯酚檢測結果見表5、6。

表5 不同儲存時間3個批次EC成品的理化檢測結果(37 ℃)

三、EC成品使用穩(wěn)定性研究

(一)鑒別試驗結果

檢測結果表明，3個批次EC成品對卡介苗致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陰性，而TB-PPD對卡介苗致敏組豚鼠的皮膚試驗呈陽性，符合制定的質量標準。

表6 不同儲存時間3個批次EC成品的理化檢測結果(2～8 ℃)

(二)效價檢測結果

檢測結果表明，3個批次EC成品與其參考品皮膚試驗局部反應的硬結或紅暈平均直徑總和(4只豚鼠皮內注射后24 h和48 h測量局部反應的硬結或紅暈平均直徑總和)的比值均為1.0±0.2，符合制定的質量標準(表7，8)。

表7 不同放置時間3個批次EC成品的穩(wěn)定性效價檢測結果 [溫度(25±2) ℃，濕度(60±5) %]

表8 不同放置時間3個批次EC成品的穩(wěn)定性效價檢測結果 [溫度(40±2) ℃，濕度(75±5) %]

(三)理化檢測項目

檢測結果表明，3個批次EC成品外觀、不溶性微粒、無菌檢查、異常毒性檢查、細菌內毒素檢查、pH值、滲透壓摩爾濃度等指標分別于溫度(25±2) ℃、濕度(60±5) %和溫度(40±2) ℃、濕度(75±5) %條件下放置0、10、20、30、40、50 min，檢測結果均符合EC質量標準的規(guī)定，其中pH值和滲透壓摩爾濃度檢測結果見表9、10。

表9 不同放置時間3個批次EC成品的穩(wěn)定性理化檢測結果 [溫度(25±2) ℃，濕度(60±5) %]

表10 不同放置時間3個批次EC成品的穩(wěn)定性理化檢測結果 [溫度(40±2) ℃，濕度(75±5) %]

討 論

穩(wěn)定性研究是藥品質量控制的重要內容，目的在于考察藥品的質量穩(wěn)定性，為藥品制定效期和臨床使用提供科學依據[8]。生物制品的活性成分一般為多肽或蛋白質，結構復雜，結構的改變可能會引起生物制品活性、效力或理化性質的改變。因此，基于生物制品的特性，在進行其穩(wěn)定性研究中應需要綜合考慮溫度、濕度、使用條件等因素的影響。另外，生物制品質量控制中生物活性/效價常作為評價質量的核心指標，反映生物制品的有效性，應保證產品生物活性測定結果的穩(wěn)定性及不同批次產品測定結果的一致性[9]。所以，本研究也重點考察了不同時間點本品的生物活性，如致敏效應試驗、鑒別試驗、效價檢測等結果的變化，進一步評估本品在儲存、使用過程中的穩(wěn)定性。

EC是單一重組的相對分子質量為23 000的蛋白產品，屬于1類治療類生物制品，目前也無相關穩(wěn)定性研究的報道。本研究結合EC特性及研究目的的不同，分別進行了原液儲存穩(wěn)定性研究、成品儲存穩(wěn)定性研究及成品使用穩(wěn)定性研究。

EC原液的常規(guī)儲存條件為-70 ℃。因此，筆者選取連續(xù)3批保存于-70 ℃的EC原液進行了本品儲存穩(wěn)定性研究，其中各檢測時間點的選擇參考了《生物制品穩(wěn)定性研究技術指導原則》及本品的特性，選取0、3、6、9、12、18、24、36個月進行取樣檢測。研究的結果顯示，3批次EC原液在不同儲存時間點取樣檢測的結果均符合制定的質量標準，進而表明當EC原液在-70 ℃的條件下儲存36個月，各項檢測指標特別是生物活性檢測結果均能保持穩(wěn)定，這也為EC原液的儲存效期提供了依據。

EC成品的常規(guī)儲存條件為2～8 ℃，筆者分別進行了37 ℃儲存條件下的加速穩(wěn)定性研究和2～8 ℃ 條件下的長期穩(wěn)定性研究。37 ℃儲存條件下的加速穩(wěn)定性研究的目的是通過加速藥品的物理和化學變化，探討藥品的穩(wěn)定性，在本品37 ℃儲存條件下的加速穩(wěn)定性研究中，筆者選取0、7、14、21、28 d 進行取樣檢測，研究結果表明3批次EC成品在不同儲存時間點取樣檢測的結果均符合制定的質量標準；這也表明本品在37 ℃儲存條件下的穩(wěn)定性，為后期運輸或使用過程中若本品儲存溫度出現短暫變化，提供了風險評估的依據。2～8 ℃儲存條件下的長期穩(wěn)定性研究結果表明，本品在2～8 ℃條件下儲存36個月后，各項檢測結果均符合制定的質量標準，為EC成品儲存效期提供了依據。

EC成品有15 U/0.3 ml、25 U/0.5 ml及50 U/1.0 ml三種規(guī)格，每人使用劑量為0.1 ml。因此，本品在實際使用過程中會出現一瓶藥品進行多人注射的情況，進而出現一次性注射器多次針刺抽取樣品和樣品長時間室溫放置的情況。因此，筆者結合本品實際應用情況，分別進行了常規(guī)使用條件[溫度為(25±2) ℃、濕度為(60±5) %)]和較為惡劣使用條件下[溫度為(40±2) ℃、濕度為(75±5) %)]的使用穩(wěn)定性研究。研究過程中檢測項目的設置參考了本品的相關要求，但由于本品中苯酚為防腐劑，主要起到抑菌的作用，并不會對本品的效價起到作用，故使用穩(wěn)定性研究中未設置對苯酚含量的檢測；另外，進行使用穩(wěn)定性研究過程中會出現多次針刺取樣的操作，不同時間點的裝量其本身就是一個變量，故使用穩(wěn)定性研究中也未設置裝量檢測。由于在多次針刺取樣過程中可能會導致硅膠塞上微粒的脫落至藥品瓶中，故在使用穩(wěn)定性研究中新增了不溶性微粒檢測；同時，由于多次取樣又可能出現取樣不均一的現象，導致藥品瓶中剩余藥液滲透壓的改變，進而危害到人身安全，故在使用穩(wěn)定性研究中又新增了滲透壓摩爾濃度的檢測。兩種使用條件下，不同取樣點的檢測結果均符合制定的質量標準，結果進一步證明了本品在常規(guī)使用條件下的穩(wěn)定性和安全性。

綜上，EC穩(wěn)定性與有效性研究結果表明，EC理化性質、生物活性/效價穩(wěn)定可控，符合《生物制品穩(wěn)定性研究技術指導原則(試行)》[6]的要求，為該產品的上市生產和使用提供了實驗室數據支撐。