張凱 陶立峰 韋芬 都偉欣 仇晶晶 陳偉 陳保文 朱銀猛 程興 蘇城 鐘再新 盧錦標(biāo) 蒲江

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。據(jù)WHO[1]估計(jì)，全球潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)人群約17億，約占全人群的1/4左右。2018年全球結(jié)核病新發(fā)患者約1000萬(wàn)例，約145萬(wàn)例死于結(jié)核病[2]。WHO[3]提出了2035年“終止結(jié)核病”戰(zhàn)略目標(biāo)，將結(jié)核病發(fā)病率控制在10/10萬(wàn)以下。WHO 2018年發(fā)布的LTBI管理指南及關(guān)于結(jié)核病發(fā)病率低的國(guó)家及地區(qū)消滅結(jié)核病的新框架文件中，都將LTBI者的篩查與預(yù)防作為控制結(jié)核病疫情的重要手段[4]。因此，如何簡(jiǎn)便、高通量診斷結(jié)核感染者并實(shí)施預(yù)防是結(jié)核病防治工作的關(guān)鍵。

差異區(qū)域1(region of difference-1，RD-1)是結(jié)核分枝桿菌在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中丟失的重要保護(hù)性抗原，RD-1僅存在于致病性分枝桿菌中，而在卡介苗及環(huán)境分枝桿菌中缺失。目前，國(guó)內(nèi)外均以RD-1基因編碼的結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)為研究熱點(diǎn)[5]，制成的結(jié)核感染鑒別用變態(tài)反應(yīng)原皮膚試驗(yàn)(IST)，既有γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)特異性又有結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)適合大規(guī)模篩查的簡(jiǎn)便性，是極具潛力的新一代結(jié)核分枝桿菌感染篩查試劑。本研究的重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)(該制品名稱(chēng)是國(guó)家藥典委員會(huì)確定的藥品中文通用名稱(chēng)，“EC”為重組融合蛋白“ESAT-6和CFP-10”)(簡(jiǎn)稱(chēng)“EC”)，有望應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷和結(jié)核病的輔助診斷。

資料和方法

一、 材料

(一) 菌株

結(jié)核分枝桿菌H37Ra，上海復(fù)旦大學(xué)三級(jí)安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供并開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)；卡介菌，安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供。

(二) 主要試劑

EC原液，安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司生產(chǎn)；TB-PPD (50 IU/ml，批號(hào)：20171010)，北京祥瑞生物制品有限公司生產(chǎn)。

(三) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特殊病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)白色豚鼠，34只，雌性22只，雄性12只，體質(zhì)量300～400 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；新西蘭兔，6只，雌雄各半，體質(zhì)量2 ～3 kg，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；ICR[(美國(guó))Institute of Cancer Research]小鼠，80只，雌雄各半，體質(zhì)量17～19 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、方法

(一) 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

1. 動(dòng)物篩選(TB-PPD)皮膚試驗(yàn)：將體質(zhì)量合格豚鼠背部局部去毛，用酒精棉消毒去毛部位皮膚，用1 ml注射器吸取 50 IU/ml 的TB-PPD，在去毛部位皮內(nèi)注射 0.2 ml TB-PPD，注射部位應(yīng)有皮丘凸起，旋轉(zhuǎn)180°拔出針頭。于注射后48 h觀察局部硬結(jié)或紅暈反應(yīng)的縱徑與橫徑(以硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者為準(zhǔn))，平均硬結(jié)或紅暈反應(yīng)直徑[(縱徑+橫徑)/2]≥5 mm判為陽(yáng)性，<5 mm判為陰性；TB-PPD 皮膚試驗(yàn)陰性豚鼠留做試驗(yàn)用。

2. 效價(jià)測(cè)定：選取6只經(jīng)TB-PPD皮膚試驗(yàn)陰性的300～400 g SPF級(jí)雌性豚鼠，每只豚鼠大腿腹股溝內(nèi)側(cè)皮下注射結(jié)核分枝桿菌H37Ra活菌菌液0.5 ml，致敏5周后，將豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛后每只豚鼠于背部脊柱兩側(cè)以輪圈法皮內(nèi)注射2.5 μg/ml EC原液0.2 ml。于注射后24 h觀察局部硬結(jié)或紅暈的縱徑與橫徑(以硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者為準(zhǔn))，平均硬結(jié)或紅暈反應(yīng)直徑[(縱徑+橫徑)/2]≥5 mm判為陽(yáng)性，<5 mm判為陰性。

3. 鑒別試驗(yàn)：選取4只經(jīng)TB-PPD皮膚試驗(yàn)檢測(cè)陰性的300～400 g SPF級(jí)雌性豚鼠，豚鼠大腿腹股溝內(nèi)側(cè)皮下注射卡介菌活菌菌液0.5 ml，致敏5周后，將豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛后每只豚鼠于背部脊柱兩側(cè)以輪圈法皮內(nèi)注射20 μg/ml EC原液和50 IU/ml TB-PPD各0.2 ml，于注射后48 h觀察局部硬結(jié)或紅暈的縱徑與橫徑(以硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者為準(zhǔn))，平均硬結(jié)或紅暈反應(yīng)直徑[(縱徑+橫徑)/2)]≥5 mm判為陽(yáng)性，<5 mm判為陰性。

(二) EC臨床前安全性研究

將EC原液送浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)和兔皮內(nèi)刺激試驗(yàn)進(jìn)行臨床前安全性研究。

1. 急性毒性試驗(yàn)：取80只健康ICR小鼠，分為背部皮膚單次單點(diǎn)肌內(nèi)注射組和皮內(nèi)注射組，每組40只，雌雄各半；每組再分為4組，每組10只，雌雄各半。高劑量組(注射EC 53.61 μg/0.1 ml)、低劑量組(注射EC 0.2 μg/0.1 ml)、溶劑對(duì)照組(注射EC稀釋液0.1 ml)、空白對(duì)照組(不給予任何受試物)。給藥前禁食，給藥后立即觀察小鼠的外觀、運(yùn)動(dòng)功能、排便、尿、皮膚、口、眼、鼻等一般情況。給藥第一天每隔0.5 ～1.0 h觀察1次，以后每天觀察1次，連續(xù)觀察14 d。在此期間，觀察記錄所有出現(xiàn)的癥狀、癥狀起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間及死亡分布情況，并在0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、8 d、10 d、12 d、14 d稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠通過(guò)頸椎脫臼安樂(lè)處死，并進(jìn)行大體解剖，觀察各臟器和藥物注射部位皮膚是否有異常病變。

2. 豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)：取健康無(wú)傷白色普通級(jí)豚鼠24只，分為4組，每組6只，雌雄各半，各組豚鼠分別隔日腹腔注射高劑量(5 μg/kg)、低劑量(0.5 μg/kg)EC，牛血清白蛋白(60 mg)(陽(yáng)性對(duì)照組)和0.9%NaCl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液)注射液(2 ml)(陰性對(duì)照組)，連續(xù)3次。致敏結(jié)束，末次致敏后第12天靜脈快速注射2倍致敏劑量對(duì)以上相應(yīng)的各組致敏豚鼠進(jìn)行激發(fā)。致敏期間，每天觀察豚鼠的癥狀，并于初次和最后一次致敏及激發(fā)當(dāng)日測(cè)定豚鼠的體質(zhì)量。靜脈注射激發(fā)后即刻至30 min，觀察并記錄豚鼠反應(yīng)癥狀，并評(píng)價(jià)豚鼠全身致敏反應(yīng)，過(guò)敏反應(yīng)陰性(-)：正常；過(guò)敏反應(yīng)弱陽(yáng)性(+)：出現(xiàn)不安寧、豎毛、發(fā)抖、搔鼻；過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性(++)：出現(xiàn)噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚；過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：出現(xiàn)呼吸困難、哮鳴音、皮膚紫癜、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、喘息、痙攣、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸；過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性(++++)：死亡。

3. 兔皮內(nèi)刺激試驗(yàn)：取健康皮膚無(wú)傷新西蘭兔6只，試驗(yàn)前24 h，剃毛刀剔除每兔脊椎兩側(cè)的毛。兔背部左右側(cè)去毛區(qū)分別單次皮內(nèi)注射EC 10 μg(0.2 ml)/點(diǎn)和相同容量的0.9% NaCl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液)注射液0.2 ml/點(diǎn)劑量，每側(cè)5個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2 cm，注射后即刻、24 h、48 h和72 h 觀察注射局部及其周?chē)つw組織反應(yīng)，包括紅斑、水腫和壞死等。于末次給藥后72 h由耳靜脈注入空氣處死兔，解剖觀察注射部位的皮膚組織的變化，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

EC原液誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌H37Ra活菌致敏豚鼠的24 h皮膚試驗(yàn)，陽(yáng)性為6只(表1)；TB-PPD誘導(dǎo)卡介菌活菌致敏豚鼠的48 h皮膚試驗(yàn)，陽(yáng)性為4只；EC誘導(dǎo)卡介菌活菌致敏豚鼠的48 h皮膚試驗(yàn)，陽(yáng)性為0只(表2)。

表1 EC對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Ra活菌致敏豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

二、 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，高劑量組、低劑量組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組小鼠的外觀、運(yùn)動(dòng)功能、排便、排尿、皮膚、口、眼、鼻等一般情況未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)和死亡。小鼠皮內(nèi)注射EC在不同觀察時(shí)間點(diǎn)，即注射前、注射后1 d、3 d、5 d、7 d、8 d、10 d、12 d、14 d EC高劑量組、低劑量組小鼠平均體質(zhì)量分別為(20.6±1.3) g～(24.9±2.1) g、(20.5±1.6) g～(26.0±3.1) g；注射后不同觀察時(shí)間各組平均體質(zhì)量和相應(yīng)時(shí)間的空白對(duì)照組[(21.0±1.1) g～(25.3±2.3) g]比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。小鼠肌內(nèi)注射EC在不同觀察時(shí)間點(diǎn)，即注射前、注射后1 d、3 d、5 d、7 d、8 d、10 d、12 d、14 d EC高劑量組、低劑量組小鼠平均體質(zhì)量分別為(21.0±1.5) g～(26.2±1.9) g、(20.5±2.1) g～(25.8±3.8) g；注射后不同觀察時(shí)間各組平均體質(zhì)量和相應(yīng)時(shí)間的空白對(duì)照組[(21.2±1.7) g～(25.8±3.1) g]比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表4)。試驗(yàn)結(jié)束后解剖所有試驗(yàn)小鼠，各臟器和藥物注射部位皮膚均未發(fā)現(xiàn)任何肉眼可見(jiàn)的異常病變。

表3 皮內(nèi)注射EC前后不同觀察時(shí)間各組小鼠的體質(zhì)量比較

表4 肌內(nèi)注射EC前后不同觀察時(shí)間各組小鼠的體質(zhì)量比較

三、 豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果

各試驗(yàn)組豚鼠在致敏期間均未見(jiàn)明顯異常反應(yīng)，體質(zhì)量也均隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。高劑量組、低劑量組豚鼠首次致敏、末次致敏、激發(fā)時(shí)的平均體質(zhì)量分別為(327.5±24.3) g、(347.2±32.7) g、(402.2±34.9) g；(331.3±26.7) g、(346.2±32.0) g、(411.3±38.9) g，與相應(yīng)時(shí)間的0.9% NaCl注射液陰性對(duì)照組[(329.5±27.4) g、(348.3±27.0) g、(399.4±25.4) g]比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表5)。末次致敏后第12天給予激發(fā)劑量后，高劑量組、低劑量組與相應(yīng)時(shí)間陰性對(duì)照組均無(wú)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生。而陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠均出現(xiàn)明顯的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，主要表現(xiàn)為不安寧、豎毛、發(fā)抖、搔鼻、噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、流淚、呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、痙攣，甚至死亡，死亡時(shí)間在給藥后5 min左右，有過(guò)敏反應(yīng)的存活豚鼠在給藥后30 min內(nèi)逐漸恢復(fù)正常，其發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的豚鼠有6只，死亡數(shù)為3只，過(guò)敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽(yáng)性(表6)。

表5 注射EC全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)致敏后不同時(shí)間各組豚鼠的體質(zhì)量比較

表6 EC不同劑量組豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果

四、 兔皮內(nèi)刺激試驗(yàn)結(jié)果

兔背部分別單次皮內(nèi)注射0.9%NaCl、 EC后，在各觀察時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)皮膚紅斑、水腫現(xiàn)象。停藥72 h后解剖，可見(jiàn)兔左、右側(cè)給藥局部皮膚色澤均勻、紅潤(rùn)，無(wú)紅斑、水腫、突起、潰瘍等異常。鏡下檢查，兔左、右側(cè)給藥局部皮膚各層均未見(jiàn)充血、水腫、變性和炎性浸潤(rùn)等病理變化(圖1，2)。

皮膚各層未見(jiàn)充血、水腫、變性和炎性浸潤(rùn)等病理變化圖1 兔皮內(nèi)注射0.9%NaCl注射液后局部皮下組織學(xué)切片(HE ×400)

皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，各層未見(jiàn)充血、水腫、變性和炎性浸潤(rùn)等病理變化圖2 兔皮內(nèi)注射EC后局部皮下組織學(xué)切片(HE ×400)

討 論

結(jié)核病作為單病因致死率最高的傳染性疾病，由于人口流動(dòng)、耐藥結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌與人獲得性免疫缺陷病毒雙重感染等因素，結(jié)核病防治工作面臨巨大的挑戰(zhàn)[6]。因此，如何早期發(fā)現(xiàn)高危人群并給予預(yù)防是結(jié)核病控制的重要問(wèn)題，而其中尋找能診斷和確定患者體內(nèi)是否留有存活結(jié)核分枝桿菌應(yīng)該是實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵。目前對(duì)于LTBI患者的診斷手段主要有IGRA及PPD皮膚試驗(yàn)，但I(xiàn)GRA檢測(cè)費(fèi)用昂貴、檢測(cè)技術(shù)高等實(shí)際問(wèn)題，難以在結(jié)核病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家實(shí)施；PPD皮膚試驗(yàn)不能有效區(qū)分卡介苗接種與結(jié)核感染，更不能鑒別結(jié)核感染者體內(nèi)有無(wú)存活的結(jié)核分枝桿菌[7]。因此，研制一種特異性強(qiáng)、方便使用的結(jié)核病診斷試劑對(duì)控制我國(guó)結(jié)核病傳染具有重要價(jià)值。

結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期間分泌的蛋白對(duì)結(jié)核病的保護(hù)性免疫作用非常重要。迄今為止，大量結(jié)核分枝桿菌的抗原被作為結(jié)核病疫苗的候選蛋白。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已用基因工程技術(shù)研究了分枝桿菌的多種抗原蛋白，比如CFP-10、ESAT-6和Ag85家族蛋白[8-9]。ESAT-6蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生明顯的T細(xì)胞免疫應(yīng)答和釋放高水平γ-干擾素(IFN-γ)，具有良好的抗原刺激性并能被大多數(shù)結(jié)核病患者所識(shí)別；CFP-10與ESAT-6 同屬于ESAT-6家族，也是免疫優(yōu)勢(shì)抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

根據(jù)Swissprot和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析，ESAT-6和CFP-10基因嚴(yán)格限制于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和4種非結(jié)核分枝桿菌(堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、微黃分枝桿菌和蘇加分枝桿菌)中，卡介苗和大部分非結(jié)核分枝桿菌缺失[10-12]，因此ESAT-6和CFP-10蛋白不受卡介苗和絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌的影響，具有很好的特異性。EC對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Ra活菌致敏豚鼠的皮膚試驗(yàn)，陽(yáng)性為6只；對(duì)卡介菌活菌致敏豚鼠的皮膚試驗(yàn)，陽(yáng)性為0只。遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)表明，EC能夠鑒別結(jié)核感染與卡介苗免疫。

臨床前動(dòng)物安全性研究表明，采用不同注射方式(單次皮內(nèi)注射和單次肌內(nèi)注射)，EC在每只鼠注射高劑量(53.61 μg)和等效劑量(0.2 μg)的條件下，所有小鼠未出現(xiàn)明顯的急性中毒反應(yīng)和顯示有急性中毒的靶器官。采用3次腹腔注射致敏和1次靜脈注射激發(fā)的模式，豚鼠在致敏期間均未見(jiàn)明顯異常反應(yīng)，體質(zhì)量隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)；激發(fā)后，注射EC高劑量組、低劑量組均無(wú)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，表明EC對(duì)豚鼠無(wú)過(guò)敏反應(yīng)。采用單次皮內(nèi)注射方式，EC在試驗(yàn)劑量[10 μg(0.2 ml)/點(diǎn)，每側(cè)5個(gè)點(diǎn)]條件下，對(duì)兔皮內(nèi)無(wú)明顯刺激反應(yīng)。 EC臨床前動(dòng)物試驗(yàn)安全性好，能夠鑒別結(jié)核感染與卡介苗免疫，有望應(yīng)用于人群結(jié)核感染的診斷與鑒別診斷。