王 耀 陳 曦 武漢良 衛(wèi) 星張國慶 張淑霞 劉勝男

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽 471031；3. 三門峽市檢驗(yàn)檢疫中心，河南 三門峽 472000；4. 鄭州海關(guān)技術(shù)中心，河南 鄭州 450002;5. 三門峽海關(guān)，河南 三門峽 472000；)

近年來，食物過敏患病率日趨上升[1-2]，由于目前仍缺乏致敏閾值研究以及過敏癥狀有效治療方法研究，食物過敏患者只能通過藥物緩解過敏癥狀，并避免接觸致敏食物以保護(hù)自身[3]。因此，許多國家已通過制定法規(guī)或標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)制要求在食品標(biāo)簽中標(biāo)識致敏物質(zhì)[4]。中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)審評委員會在2018年底公布的《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》(GB 7718)修訂草案征求意見稿中也已將致敏物質(zhì)標(biāo)示作為預(yù)包裝食品標(biāo)簽標(biāo)示的基本內(nèi)容?；ㄉ前舜蟪Ｒ娭旅羰澄镏籟5]，也是諸多食品標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)中要求標(biāo)示的主要致敏成分?；ㄉ卸喾N致敏蛋白，其中Ara h 1是主要致敏蛋白之一，能被大部分的過敏患者血清識別[6]。Ara h 1約占花生蛋白總量的12%～16%，也是花生中含量最多的致敏蛋白[7]，其三聚體具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，胃腸道的消化作用和加熱均難以破壞其致敏性[8]。因此，為了更好地保障過敏消費(fèi)者的食品安全，研究食品中花生致敏物質(zhì)的靈敏、特異、高效檢測方法尤為必要。目前，用于花生致敏物質(zhì)檢測的方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)[9-10]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[11-12]和質(zhì)譜法(Mass spectrometry，MS)[13-14]，其中PCR和ELISA是實(shí)驗(yàn)室、食品企業(yè)及監(jiān)管機(jī)構(gòu)篩查食品致敏成分最常用的快速定性和定量分析方法[15]。PCR是基于致敏蛋白標(biāo)志性基因的檢測方法，不能直接反映是否含有致敏物質(zhì)[16]，而ELISA是基于蛋白質(zhì)的檢測方法，可利用抗體針對性的檢測致敏蛋白?，F(xiàn)有用于花生致敏物質(zhì)檢測的ELISA法?；诙嗫菇?，而利用多抗進(jìn)行檢測時(shí)存在特異性不足的問題[17]。試驗(yàn)擬利用所制備的Ara h 1鼠源單抗提高致敏蛋白捕獲特異性，再通過Ara h 1兔源多抗進(jìn)行夾心檢測，建立花生致敏蛋白Ara h 1的雙抗體夾心ELISA法并對其檢測特性進(jìn)行鑒定，以期為食品中花生致敏蛋白的快速篩查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑溶液

花生致敏蛋白Ara h 1和Ara h 2：美國INDOOR公司；

大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白4種常見致敏蛋白，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethyl benzidine，TMB)：美國Sigma-Aldrich公司；

HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(GaRIgG-HRP)：索萊寶生物科技公司；

其他試劑均為市售分析級；

Ara h 1兔源多抗(Polyclonal antibody，pAb)、Ara h 1 鼠源單抗(Monoclonal antibody，mAb)及超純水：實(shí)驗(yàn)室制備；

ELISA包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，CBS)、稀釋液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)、洗滌液(含0.05% Tween-20的PBS，PBST)、封閉液(含5%脫脂奶的PBST溶液)、顯色液(TMB緩沖液)、終止液(2 mol/L H2SO4)等溶液：實(shí)驗(yàn)室配置。

1.2 主要儀器

電子天平：BSA224S型，德國Sartorius公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan FC型，美國Thermo Scientific公司；

振蕩器：Vortex2型，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；

控溫磁力攪拌器：SZCL-2型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

恒溫培養(yǎng)箱：HPX-9052MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pAb與mAb的制備 pAb為Ara h 1免疫新西蘭白兔，經(jīng)純化血清制備，其效價(jià)達(dá)2.56×105以上；mAb為Ara h 1免疫BLAB/c小鼠，通過細(xì)胞融合篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)體外誘生腹水法制備[18]，其效價(jià)達(dá)5.12×105以上，親和常數(shù)Ka為2.65×108L/mol，親和力較高且具有良好的特異性。

1.3.2 雙抗體夾心ELISA步驟 將Ara h 1 鼠源mAb作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，首先用CBS稀釋mAb，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，在4 ℃條件下過夜包被，用PBST洗板4次后拍干，再向酶標(biāo)板加入封閉液200 μL/孔，在37 ℃條件下封閉1 h，洗板(同上)后備用。

檢測時(shí)首先將樣液100 μL/孔加入酶標(biāo)板，并設(shè)置陰性孔(PBS 100 μL/孔加入)，在37 ℃條件下孵育1 h后洗板；將Ara h 1 兔源pAb作為檢測抗體，用封閉液稀釋pAb，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，在37 ℃條件下孵育30 min后洗板；用封閉液1∶5 000倍稀釋GaRIgG-HRP，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，在37 ℃條件下孵育30 min后洗板；顯色液100 μL/孔加入酶標(biāo)板，室溫反應(yīng)顯色10 min；最后加入終止液100 μL/孔終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。

1.3.3 捕獲抗體和檢測抗體工作濃度的優(yōu)化 采用棋盤法優(yōu)化抗體工作濃度[19]。將mAb用CBS稀釋為1∶5 000，1∶7 500，1∶10 000，1∶12 500的稀釋度，每個(gè)稀釋度100 μL/孔包被酶標(biāo)板兩行；第1行加入100 μL/孔確定濃度的Ara h 1標(biāo)準(zhǔn)溶液，第2行加入100 μL/孔PBS作為陰性對照；孵育、洗板后，將pAb用封閉液稀釋為1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000的稀釋度，每個(gè)稀釋度100 μL/孔加入酶標(biāo)板3列；孵育、洗板后，加入封閉液稀釋的GaRIgG-HRP進(jìn)行孵育，然后顯色、終止，并測定OD450 nm值。當(dāng)所測定的OD450 nm值(P)和陰性對照OD450 nm值(N)的比值(P/N)最大時(shí)，其所對應(yīng)的捕獲抗體mAb和檢測抗體pAb的稀釋度分別作為最優(yōu)工作濃度。

1.3.4 雙抗體夾心ELISA法的特性鑒定

(1) 靈敏度：通過檢測限(Limit of detection，LOD)的確定以鑒定方法的靈敏度。用PBS配制不同濃度的Ara h 1 標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用優(yōu)化抗體工作濃度的雙抗體夾心ELISA法進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測所得OD450 nm值為縱坐標(biāo)，繪制雙抗體夾心ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將空白樣品進(jìn)行20次重復(fù)測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到對應(yīng)濃度，計(jì)算重復(fù)測定結(jié)果的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以X+3SD作為檢測限[20]。

(2) 特異性：通過交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定檢測方法的特異性[21]。利用雙抗體夾心ELISA法分別檢測高濃度的其他致敏蛋白(花生致敏蛋白Ara h 2、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白)。若測定OD450 nm值(P)和陰性對照OD450 nm值(N)的比值P/N<2.1，則說明方法與其他致敏蛋白無交叉反應(yīng)，特異性良好。

(3) 準(zhǔn)確度：通過添加回收試驗(yàn)鑒定方法的準(zhǔn)確度[22]。在5%脫脂奶中添加Ara h 1，分別配制成10，100，200 ng/mL添加濃度的樣品，每個(gè)濃度的添加樣品利用雙抗體夾心ELISA法重復(fù)檢測6次，通過計(jì)算每個(gè)添加濃度樣品的平均回收率以及變異系數(shù)(CV)以鑒定方法的準(zhǔn)確度。

(4) 穩(wěn)定性：在4 ℃條件下避光密封保存已包被捕獲抗體的酶標(biāo)板，利用雙抗體夾心ELISA法分別在保存前和保存的第30，60，90天檢測同一濃度Ara h 1標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過對比不同保存時(shí)間測定同一濃度溶液的P/N值的差異，以鑒定方法的穩(wěn)定性[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度

用PBS配制100 ng/mL的Ara h 1標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用已包被不同稀釋度mAb的酶標(biāo)板進(jìn)行棋盤試驗(yàn)，通過不同稀釋度的pAb對Ara h 1標(biāo)準(zhǔn)溶液及陰性對照進(jìn)行檢測，得到不同抗體稀釋度下的各孔OD450 nm值。結(jié)果如表1 所示，當(dāng)捕獲抗體mAb以1∶10 000的稀釋度包被ELISA板，檢測抗體pAb以1∶8 000的稀釋度作為工作濃度時(shí)，計(jì)算所得P/N值最大，所以捕獲抗體mAb和檢測抗體pAb最佳工作濃度分別為1∶10 000和1∶8 000稀釋。

表1 捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度的優(yōu)化

2.2 靈敏度鑒定

配制濃度分別為2，4，8，16，32，64，128，256，512 ng/mL的Ara h 1標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)雙抗體夾心ELISA法檢測后，以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以檢測所得OD450 nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為4～256 ng/mL，線性回歸方程為y=1.145 7x-0.587 5，R2=0.991 1。重復(fù)測定空白樣品20次，將測定所得OD450 nm值代入線性回歸方程求得測定濃度，計(jì)算平均值(X)+3×標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，得到方法檢測限為4.16 ng/mL，表明所建立的雙抗體夾心ELISA法具有良好的靈敏度。

圖1 雙抗體夾心ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性鑒定

利用雙抗體夾心ELISA法分別檢測濃度為500 ng/mL的花生致敏蛋白Ara h 2、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和牛血清蛋白。所得測定OD450 nm值(P)和陰性對照OD450 nm值(N)結(jié)果如表2所示，P/N值均<2.1，表明雙抗體夾心ELISA法與其他常見致敏蛋白無交叉反應(yīng)。由于方法建立所使用的捕獲抗體為特異性良好的鼠源mAb，因此能夠?qū)我恢旅舻鞍鬃R別捕獲，使檢測方法顯示出良好的特異性。

表2 雙抗體夾心ELISA法特異性鑒定結(jié)果

2.4 準(zhǔn)確度鑒定

將Ara h 1添加至5%脫脂奶中，分別配制成10，100，200 ng/mL 3個(gè)添加濃度的樣品，通過利用雙抗體夾心ELISA法重復(fù)檢測6次，計(jì)算每個(gè)添加濃度樣品的平均回收率及CV，結(jié)果如表3所示，平均回收率為85.9%～94.5%，CV為6.1%～8.7%，表明檢測方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表3 雙抗體夾心ELISA法準(zhǔn)確度鑒定結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性鑒定

將已包被捕獲抗體的酶標(biāo)板在4 ℃條件下避光密封保存，分別在保存的不同時(shí)間利用雙抗體夾心ELISA法檢測100 ng/mL的Ara h 1標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如表4所示，不同保存時(shí)間測定所得的P/N值均無明顯變化，說明4 ℃ 避光密封保存條件下，酶標(biāo)板至少可穩(wěn)定保存90 d，表明方法的穩(wěn)定性良好。

表4 雙抗體夾心ELISA法穩(wěn)定性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)依據(jù)雙抗體夾心檢測原理，利用Ara h 1 鼠源mAb作為捕獲抗體，Ara h 1 兔源pAb作為檢測抗體，通過棋盤法優(yōu)化抗體工作濃度，建立Ara h 1的雙抗體夾心ELISA法。通過對方法檢測特性進(jìn)行鑒定，其檢測限為4.16 ng/mL，具有較高的靈敏度；交叉反應(yīng)試驗(yàn)表明與其他致敏蛋白無交叉，特異性強(qiáng)；添加回收試驗(yàn)平均回收率為85.9%～94.5%，具有較高的準(zhǔn)確度；且在4 ℃條件下避光密封保存90 d內(nèi)檢測結(jié)果穩(wěn)定；能夠?qū)焖凫`敏、準(zhǔn)確特異的對花生致敏蛋白Ara h 1進(jìn)行檢測。與已有的一些基于多抗研制的商品化ELISA試劑盒相比[24]，試驗(yàn)方法通過mAb提高對于單一致敏蛋白的高親和力特異性捕獲能力，再以pAb作為夾心檢測抗體，進(jìn)一步增強(qiáng)對致敏蛋白的高效識別，在檢測特異性和靈敏度上表現(xiàn)出了一定優(yōu)勢。能夠用于食品標(biāo)簽中致敏物質(zhì)標(biāo)示信息的快速篩查，提升花生過敏患者的飲食安全性。