孟磊俊，張 晶，王雪莉，李 治，張 泓，曾乃燕

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，上海 200025；2.上海市兒童醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.病理科，上海 200040）

非霍奇金淋巴瘤是兒科腫瘤中居第4位的常見惡性腫瘤，而其中伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma,BL）占兒童非霍奇金淋巴瘤的50%～60%[1]。BL是一種侵襲性疾病，起源于濾泡生發(fā)中心細(xì)胞，具有腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，BL可能具有獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制，與其他B細(xì)胞淋巴瘤不同，其形成可能并不依賴核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路[2-3]，而8號(hào)染色體上c-MYC基因易位是其特征標(biāo)志之一[4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide3-kinase,PI3K）信號(hào)通路與MYC基因的協(xié)同作用可能是導(dǎo)致BL發(fā)生的關(guān)鍵[5-6]。此外，內(nèi)源性RAS/RAF信號(hào)通路在MYC基因誘導(dǎo)的淋巴瘤形成和促進(jìn)B細(xì)胞存活中也可能發(fā)揮了重要作用[7]。因此，全面、準(zhǔn)確地鑒定這些信號(hào)通路中相關(guān)基因的變異和表達(dá)情況，可能可以為兒童BL的診治提供合適的臨床分子靶標(biāo)和方法。

近30年來(lái)，隨著高劑量、短療程的利妥昔單抗聯(lián)合多藥化療方案和系統(tǒng)的鞘內(nèi)注射被廣泛應(yīng)用，BL患兒的生存率有了很大提高，5年無(wú)事件生存率超過(guò)80%[8-9]。然而高強(qiáng)度的化療方案也會(huì)導(dǎo)致明顯的急性毒副反應(yīng)，且有部分復(fù)發(fā)和（或）難治性BL患兒對(duì)化療有很強(qiáng)的耐藥性，且很難治愈。因此，研發(fā)針對(duì)兒童BL的毒副反應(yīng)小的靶向藥物，以及建立準(zhǔn)確的診斷和預(yù)后評(píng)估方法，都是臨床改善兒童BL治療效果和提高治愈率的關(guān)鍵。

本研究對(duì)2015年至2018年間接受淋巴瘤切除術(shù)的BL患兒石蠟組織切片中的MYC與PI3K信號(hào)通路協(xié)同作用相關(guān)基因以及NF-κB和RAS/RAF信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行全面研究，從mRNA和蛋白水平比較分析這些基因在兒童BL腫瘤組織與非腫瘤患兒的正常淋巴結(jié)組織中的表達(dá)，鑒定可用于兒童BL臨床診斷的特異性分子靶點(diǎn)，并探討其與兒童BL發(fā)生、發(fā)展間的相關(guān)性，以期為BL的分子機(jī)制研究及診斷、治療、預(yù)后判斷提供新的方法和依據(jù)。

資料與方法

一、資料

收集2015年9月至2018年5月在上海市兒童醫(yī)院接受淋巴瘤切除術(shù)的18例BL患兒的淋巴瘤組織，患兒的年齡在2～11歲，中位年齡為5.5歲，男女比例為5∶1。所有病例均進(jìn)行了病理學(xué)復(fù)查，包括分析組織細(xì)胞形態(tài)和免疫組織化學(xué)（免疫組化）（CD10或BCL6、BCL2和Ki-67）的結(jié)果，并根據(jù)最新的2016版世界衛(wèi)生組織淋巴瘤分類要求進(jìn)行診斷鑒定[10]。另收集20例非腫瘤患兒的正常淋巴結(jié)組織作為對(duì)照，患兒的年齡為2～12歲，中位年齡為4歲，男女比例為7∶3。2組患兒間的年齡、性別比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究在上海市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下，按照倫理要求對(duì)樣本進(jìn)行研究。

二、方法

1.樣本處理：收集18例兒童BL淋巴瘤組織標(biāo)本和20例兒童正常淋巴結(jié)組織樣本，經(jīng)4%甲醛溶液浸泡后進(jìn)行石蠟包埋。

2.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)標(biāo)本中相關(guān)基因表達(dá)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)BL組織及正常淋巴結(jié)組織中共27個(gè)候選基因的mRNA水平表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析，包括MYC靶點(diǎn)與PI3K信號(hào)通路協(xié)同作用相關(guān)基因TCF3、ID3、CDK6等，NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因CD44、C-FLIP、BCL2、CCND2等，以及RAS/RAF1信號(hào)通路相關(guān)基因KRAS、NRAS、RAF1等。

（1）核酸提取：從每個(gè)樣本蠟塊上切取10 μm切片，取2～3片，用常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，分別置于1.5 mL離心管中，使用RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）提取RNA。用NanoDrop2000超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定核酸質(zhì)量和純度后，置于-80 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

（2）實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）：用DNA-free Kit DNase Treatment and Removal Reagents（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）處理RNA中殘留的DNA，用SuperScript?ⅢFirst-Strand Synthesis Super Mix（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）進(jìn)行cDNA合成，用2×SsoFastTMEvagreen?Supermix with Low Rox（BioRad，美國(guó)）檢測(cè)基因的表達(dá)水平?；蛱禺愋砸镄蛄校ㄒ姳?）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以18S rRNA作為內(nèi)參基因，用ABI QuantStudio Dx實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共45個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃10 s，65 ℃60 s，97 ℃1 s。

所有樣品均進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)，取循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）的平均值，確認(rèn)靶基因和內(nèi)參基因的cDNA擴(kuò)增效率是相同的，用目的基因與內(nèi)參基因的比值（ΔCt）來(lái)計(jì)算每個(gè)靶基因的相對(duì)表達(dá)量。

3.免疫組化分析：對(duì)于兒童BL組織中在mRNA水平上有明顯變化的目的基因，采用免疫組化技術(shù)，從蛋白水平上進(jìn)行分析，比較18例BL組織與隨機(jī)選取的5例正常淋巴結(jié)組織中以上基因的蛋白水平表達(dá)差異。切取4 μm厚的組織白片進(jìn)行脫蠟和水化、抗原修復(fù)、抗體孵育及顯色[11]。免疫組化分析的目標(biāo)蛋白和抗體見表2。由2位對(duì)患者治療和預(yù)后不知情的病理醫(yī)師，分別對(duì)切片的免疫染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。在顯微鏡下根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)估蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果計(jì)為無(wú)表達(dá)（-）、弱陽(yáng)性（+）、陽(yáng)性（++）和強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。用KF-PRO-005數(shù)字掃描儀（寧波江豐生物信息技術(shù)公司），在40倍鏡下進(jìn)行全片掃描，獲得數(shù)字圖像并保存。

表2 免疫組化抗體

4.熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測(cè)c-MYC基因：BL所用探針為c-MYC（8q24）基因斷裂探針（廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司），實(shí)驗(yàn)室操作參照說(shuō)明書。使用Leica DM6000B熒光顯微鏡觀察結(jié)果，用CytoVision軟件采集圖像。在1個(gè)細(xì)胞核中，當(dāng)2對(duì)綠色和紅色熒光信號(hào)均發(fā)生融合時(shí)，提示c-MYC基因未發(fā)生斷裂；當(dāng)至少有1對(duì)綠色和紅色熒光信號(hào)未發(fā)生融合時(shí)，則提示c-MYC基因發(fā)生斷裂。計(jì)數(shù)至少100個(gè)腫瘤細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生c-MYC基因斷裂的腫瘤細(xì)胞大于10%時(shí)，則判定為陽(yáng)性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SAS 9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用t檢驗(yàn)對(duì)目的基因在腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)進(jìn)行比較，采用Fisher's精確檢驗(yàn)進(jìn)行臨床特征及指標(biāo)的相關(guān)性分析。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、臨床分析

18例BL患兒中，臨床分期為Ⅱ期者為3例，Ⅲ期為13例，Ⅳ期為2例。18例BL患兒均無(wú)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的臨床表現(xiàn)，但有2例累及骨髓；發(fā)病部位主要為腹腔（9例），其次為鼻咽部（3例）。18例BL患兒均進(jìn)行了c-MYC基因易位的FISH檢測(cè)，其中13例發(fā)生斷裂，5例正常。18例BL患兒中有1例未完成化療，1例發(fā)生腫瘤溶解綜合征（見表3）。

二、兒童BL相關(guān)基因的mRNA水平表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BL組織與正常淋巴結(jié)組織中27個(gè)相關(guān)基因的mRNA水平表達(dá)差異，結(jié)果顯示MYC基因在BL組織中顯著高表達(dá)（P<0.05）。

1.MYC基因與PI3K信號(hào)通路協(xié)同作用相關(guān)基因的表達(dá)情況：與正常淋巴結(jié)組織相比，BL組織內(nèi)MYC基因與PI3K信號(hào)通路協(xié)同作用的目的基因中CDK4、ID3、TCF3、CCND3、CDK6呈現(xiàn)出了類似的高水平表達(dá)（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而PTPN6的表達(dá)則受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但2組間比較，在實(shí)體瘤發(fā)生、發(fā)展中經(jīng)常起抑制作用的基因TP53、PTEN、CDKN2A的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表4）。

2.NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況：與正常淋巴結(jié)組織相比，BL組織中NF-κB信號(hào)通路的目的基因BCL2、CD44、C-FLIP、CCND2、A20的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而2組間IRF4、CD69、CCR2A、IκB-ɑ、TLR6及 ABIN家族基因（ABIN1、ABIN2、ABIN3）的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表5）。

表3 18例兒童BL的臨床特征

表4 兒童BL組織與正常淋巴結(jié)組織中MYC基因與PI3K信號(hào)通路協(xié)同作用相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

3.RAS/RAF信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況：在RAS/RAF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，NRAS和RAF1在BL組織中顯著高表達(dá)，與正常淋巴結(jié)組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而RAS家族的另一個(gè)成員KRAS，其在2組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表6）。

三、兒童BL相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)

對(duì)于上述兒童BL組織中mRNA表達(dá)水平上有明顯變化的目的基因，包括MYC、ID3、TCF3、CCND3、CDK4、CDK6、PTPN6、NRAS、RAF1、A20、BCL2、CD44、C-FLIP、CCND2共計(jì)14個(gè)，進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果顯示，MYC、ID3、TCF3、CCND3、CDK4、CDK6、PTPN6、NRAS、RAF1、A20、BCL2、CD44的蛋白水平與其mRNA水平的表達(dá)一致。其中MYC、ID3、CCND3、CDK4、CDK6、NRAS在T中的表達(dá)升高，而PTPN6、CD44、C-FLIP在BL組織中的表達(dá)下降。BL組織與正常淋巴結(jié)組織中的CCND2蛋白水平表達(dá)量差異則無(wú)明顯變化（見圖1～4）。

表5 兒童BL組織與正常淋巴結(jié)組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

四、兒童BL的分子靶標(biāo)與臨床數(shù)據(jù)間的相關(guān)性

對(duì)兒童BL的相關(guān)基因表達(dá)分子指標(biāo)與其臨床特征指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，c-MYC基因易位或BCL2蛋白水平表達(dá)與BL患兒的性別、臨床分期、預(yù)后、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平及尿酸（uric acid，UA）水平間均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。

表6 兒童BL組織與正常淋巴結(jié)組織中RAS/RAF1信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)

然而，本研究在預(yù)后不良的4例BL患兒中都檢出了c-MYC基因易位，而預(yù)后較好的13例BL患兒中有4例沒(méi)有c-MYC基因易位。將c-MYC基因易位與BCL2等相關(guān)基因的蛋白表達(dá)結(jié)果相結(jié)合進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在c-MYC基因易位同時(shí)伴有BCL2表達(dá)（BCL2+）與高LDH水平、LDH和UA聯(lián)檢呈高水平這2個(gè)臨床指標(biāo)之間具有顯著相關(guān)性（P<0.05）（見表7）；而c-MYC基因易位聯(lián)合其他蛋白表達(dá)與上述臨床特征及指標(biāo)間均無(wú)關(guān)系（P>0.05）。進(jìn)一步分析帶有c-MYC基因易位但BCL2表達(dá)不同的13例BL患兒，其中6例有BCL2表達(dá)（BCL2+），7例BCL2無(wú)表達(dá)（BCL2-），結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有c-MYC基因易位伴BCL2+的BL患兒，其血清LDH水平高于正常（P<0.05），但與其他臨床特征間無(wú)相關(guān)性（P>0.05）（見表8）。

圖1 MYC、ID3、TCF3、CCND3蛋白在兒童BL組織與正常淋巴結(jié)組織中的表達(dá)情況

圖2 CDK4、CDK6、PTPN6、A20蛋白在兒童BL組織與正常淋巴結(jié)組織中的表達(dá)

圖3 BCL2、CCND2、CD44、C-FLIP蛋白在兒童BL組織與正常淋巴結(jié)組織中的表達(dá)

圖4 RAF1、NRAS蛋白在兒童BL組織與正常淋巴結(jié)組織中的表達(dá)情況

討論

BL是一種高度侵襲性淋巴瘤，是兒童和青少年侵襲性淋巴瘤中較為常見的非霍奇金淋巴瘤之一。盡管目前的多藥聯(lián)合化療方案可使BL患者的5年無(wú)事件生存率達(dá)到80%以上[8-9]，然而對(duì)于部分復(fù)發(fā)和（或）難治性兒童BL的治療效果仍不甚理想。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)及免疫組化技術(shù)，分析MYC與PI3K協(xié)同調(diào)控相關(guān)基因以及NF-κB和RAS/RAF信號(hào)通路相關(guān)基因在兒童BL組織與兒童正常淋巴結(jié)組織中的mRNA和蛋白水平表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其與臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系。

一、臨床資料特點(diǎn)

本研究的兒童BL病例中，男女比例為5∶1，顯示本組兒童BL多發(fā)于男性。兒童BL常出現(xiàn)在腹部臟器，包括回盲部、卵巢等[4]，本研究中發(fā)病部位在腹部為9例，其中主要為回盲部，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究的18例兒童BL病例中，Ⅲ～Ⅳ期者為15例，其中2例累及骨髓，比例均低于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[9,12]，但仍以晚期患兒居多。

二、各通路基因

本研究顯示，MYC基因作為BL的分子標(biāo)志在BL中高表達(dá)，與之前Lee等[12]用DNA微陣列技術(shù)分析BL分子表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)MYC基因在BL中呈高表達(dá)水平的描述一致。MYC致癌基因?qū)?xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移等過(guò)程起關(guān)鍵性的調(diào)控作用。

1.PI3K：MYC基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可激活CCND2以及CDK4，并下調(diào)細(xì)胞周期抑制劑，最終誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)[13]。然而，本研究顯示，在mRNA水平上CCND2表達(dá)在BL中被抑制，而CDK4則在BL中高表達(dá)，提示CDK4可不依賴于CCND2而直接通過(guò)MYC驅(qū)動(dòng)來(lái)促進(jìn)BL細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)。

ID3是MYC的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，ID3在BL組織中高表達(dá)，與之前的研究結(jié)果一致[2]。在正常B細(xì)胞中，ID3可通過(guò)負(fù)調(diào)控TCF3發(fā)揮抑制腫瘤的作用，從而抑制細(xì)胞循環(huán)發(fā)展和細(xì)胞增殖[14]。TCF3功能獲得性突變和ID3功能缺失性突變是BL的特征之一[6,15-16]，這些突變打破了ID3負(fù)反饋環(huán)，使TCF3表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)BCR信號(hào)，并激活PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，維持細(xì)胞存活[6]。在本研究的兒童BL病例中，TCF3呈現(xiàn)高表達(dá)，提示其不受高表達(dá)的ID3所抑制。這可能由于ID3在這些病例中并不是功能健全的蛋白，或TCF3存在功能獲得性突變，使其不受ID3負(fù)調(diào)控，需要從基因?qū)用孢M(jìn)行ID3和TCF3的突變分析以及蛋白的功能分析來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

Lee等[12]在BL分子表達(dá)譜分析中發(fā)現(xiàn)PTPN6呈高表達(dá)，而本研究則發(fā)現(xiàn)PTPN6在BL中被抑制。有研究認(rèn)為，TCF3可通過(guò)抑制PTPN6轉(zhuǎn)錄，下調(diào)BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子磷酸酶SHP-1以增強(qiáng)BCR信號(hào)，從而激活PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]，這與本研究發(fā)現(xiàn)PTPN6在BL中被抑制的結(jié)果相符合。此外，有研究報(bào)道TCF3還可直接反式激活CCND3，促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。CDK6受CCND3調(diào)節(jié)，兩者相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的G1期和G1/S期的轉(zhuǎn)變[6]。本研究的18例BL患兒中CCND3和CDK6均呈高表達(dá)，表明TCF3高表達(dá)可上調(diào)CCND3和CDK6表達(dá)。CDK家族異?；罨墒辜?xì)胞周期失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖及DNA突變、染色體畸變、染色體數(shù)目變異等[18]。因此，CCND3和CDK6表達(dá)增加有助于BL細(xì)胞增殖，并可能導(dǎo)致細(xì)胞惡性發(fā)展。此外，本研究的兒童BL病例中CDK4的蛋白表達(dá)強(qiáng)度多為-或+，相較于正常淋巴結(jié)組織表達(dá)強(qiáng)度-，升高并不多；而CDK6在兒童BL病例中表達(dá)強(qiáng)度為++～+++，遠(yuǎn)高于正常淋巴結(jié)組織的表達(dá)強(qiáng)度+，提示兒童BL細(xì)胞增殖可能更依賴于CCND3和CDK6，而非CDK4。

2.NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：本研究結(jié)果顯示，NFκB信號(hào)通路目的基因A20、BCL2、CD44、C-FLIP、CCND2在BL組織中多被抑制，或與正常淋巴結(jié)組織中的表達(dá)相當(dāng)（如IRF4、CD69、CCR2A、IκB-ɑ、TLR6等），提示NF-κB信號(hào)通路在兒童BL中的活性可能并不高。Dave等[2]研究發(fā)現(xiàn)，BL的形成可能并不依賴于NF-κB信號(hào)通路，與本研究結(jié)果一致。

3.RAS/RAF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：RAS/RAF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞存活至關(guān)重要，其可調(diào)節(jié)下游靶基因MYC mRNA表達(dá)并促進(jìn)其穩(wěn)定[7]。Lee等[12]在BL的MAPK信號(hào)通路研究中發(fā)現(xiàn)RAF1高表達(dá)，而在本研究的BL患兒中RAF1也呈現(xiàn)了同樣的高表達(dá)趨勢(shì)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)NRAS在BL中顯著高表達(dá)，而BL與正常淋巴結(jié)組織中KRAS表達(dá)則無(wú)差異，提示在RAS家族中NRAS可能是BL的重要靶點(diǎn)，RAS/MAPK信號(hào)通路可通過(guò)NRAS/RAF1途徑使MYC磷酸化，促進(jìn)BL細(xì)胞增殖和抗凋亡。

三、本研究結(jié)果中基因靶點(diǎn)及預(yù)測(cè)意義

近年來(lái)，已有幾項(xiàng)藥物臨床試驗(yàn)使用BL靶向基因抑制劑，如抑制MYC表達(dá)的NCT01897012，針對(duì)MYC基因易位的NCT02700022、NCT02481310和NCT01897012等。本研究結(jié)果支持了針對(duì)兒童BL的靶向PI3K激酶途徑、MYC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、TCF3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、CCND3/CDK6途徑以及NRAS/RAF途徑的藥物開發(fā)（見圖5），為這些信號(hào)通路抑制劑在BL治療中的研發(fā)的應(yīng)用提供了新的線索和證據(jù)。

“雙打擊”是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的特征，主要為MYC基因和BCL2基因易位[19]，而在BL病例中BCL2基因易位的發(fā)生率很低，僅為3.5%[20]。但有研究報(bào)道，33%的BL病例表達(dá)BCL2蛋白[20]。本研究中亦有9例BL患兒存在BCL2蛋白表達(dá)，高于之前的文獻(xiàn)報(bào)道。Strasser等[21]使用Em-Myc模型進(jìn)行研究，證明MYC和BCL2可在功能上合作以加速淋巴瘤的發(fā)展。因此，本研究進(jìn)一步分析了c-MYC基因易位及BCL2蛋白水平表達(dá)與臨床特征及指標(biāo)間的關(guān)系，結(jié)果顯示，當(dāng)c-MYC基因易位與BCL2表達(dá)分別作為獨(dú)立因素時(shí)，與臨床特征及指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性。c-MYC基因易位是BL的特征標(biāo)志，本研究BL患兒的FISH檢測(cè)結(jié)果中，c-MYC基因易位占72.2%（13/18），低于楊文萍等[22]在BL分子遺傳特征研究中報(bào)道的93.1%。盡管本研究顯示，c-MYC基因易位與臨床特征及指標(biāo)間無(wú)相關(guān)性，但本研究在4例預(yù)后不良的兒童BL病例中均檢測(cè)出了c-MYC基因易位（陽(yáng)性為4/4），而預(yù)后較好的13例病例中有4例無(wú)c-MYC基因易位，提示c-MYC基因易位可能與兒童BL的預(yù)后有關(guān)，而由于本研究納入的病例數(shù)較少，可能無(wú)法獲取統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，c-MYC基因易位伴BCL2+與血清LDH升高顯著相關(guān)。LDH在腫瘤分期、腫瘤負(fù)荷、治療和預(yù)后判斷等臨床表現(xiàn)中均具有重要指示意義。本研究結(jié)果表明，c-MYC基因易位伴BCL2+可能與BL患兒較晚的腫瘤分期、較大的腫瘤負(fù)荷以及不良的預(yù)后等臨床表現(xiàn)密切相關(guān)。有研究報(bào)道，在BL中，UA升高與腫瘤溶解綜合征有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，c-MYC基因易位伴BCL2+雖與UA升高間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，但與LDH和UA同時(shí)升高有關(guān)，在發(fā)生LDH、UA同時(shí)升高的4例兒童BL病例中有1例發(fā)生了腫瘤溶解綜合征，提示當(dāng)兒童BL的病理診斷結(jié)果出現(xiàn)c-MYC基因易位伴BCL2+時(shí)，在臨床治療中需要預(yù)防腫瘤溶解綜合征的發(fā)生。

總之，本研究通過(guò)對(duì)上述信號(hào)通路的相關(guān)基因在mRNA和蛋白水平上表達(dá)情況的分析，發(fā)現(xiàn)MYC、TCF3、CCND3、CDK6、NRAS和RAF1等基因可能是兒童BL的重要治療靶點(diǎn)，而檢出c-MYC基因易位伴BCL2+對(duì)BL的臨床腫瘤分期、腫瘤負(fù)荷以及治療和預(yù)后判斷具有輔助診斷作用。由于本研究的樣本數(shù)量有限，以上研究結(jié)果還需通過(guò)更多臨床病例樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，并進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和修訂。