溫玉瑩 鐘燕南 梁佳欣 周競揚 朱 桐 王賢君 符騰越 周清清 彭新生 周艷芳

(廣東醫(yī)科大學(xué)1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2 藥學(xué)院，東莞市 523808，電子郵箱：576948912@qq.com)

皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，涉及多種細胞的協(xié)同作用，修復(fù)過程中任何的失敗均可能導(dǎo)致慢性傷口和瘢痕形成，給患者帶來極大的痛苦[1]。皮膚組織工程技術(shù)可達到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的，并可解決自體植皮術(shù)來源受限的問題。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分，具有很強的生物活性及生物功能，也是一種天然的組織支架材料，被廣泛用于創(chuàng)傷修復(fù)[2]。紅景天苷是中藥紅景天的主要成分之一，可抗氧化、抗衰老，對心血管、神經(jīng)、皮膚等組織有一定的保護作用[3]。本實驗利用膠原蛋白作為天然組織支架材料和藥物載體，構(gòu)建紅景天苷-膠原蛋白海綿支架，并通過動物實驗評價其對皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的效果，為創(chuàng)傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的無特定病原體級雄性SD大鼠24只，6～8周齡，體重180～220 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(粵)2015-0147。于(25.0±2.0)℃室溫下，使用普通大鼠飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 紅景天苷(南京道斯夫生物科技有限公司，批號：190320H)；膠原蛋白(牛跟腱中提取)由本實驗室自制；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑(南京建成生物工程研究所，批號：20190321)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20181217)。高效液相色譜儀(日本島津公司，型號：LC20A)；真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技有限公司，型號：SCIENTZ-10N)；數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司，型號：KQ5200DB)；掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司，型號：JSM-6390LV)；離子濺射儀(北京中科科儀股份有限公司，型號：SBC-12)。

1.3 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架及膠原蛋白海綿支架的制備 按文獻[4-5]的方法提取純化膠原蛋白。取23.88 g的8 mg/g膠原蛋白溶液與0.12 g紅景天苷混合，充分攪拌。將混合所得膠原混合物注入12孔培養(yǎng)板中，每孔2 g。隨后將其置于-20℃中冷凍12 h，取出后立即放入真空冷凍干燥機中真空干燥24 h，制成直徑約2 cm的紅景天苷-膠原蛋白海綿支架，每塊支架約含10 mg的紅景天苷。采用相同方法，將24 g的8 mg/g膠原蛋白溶液按每孔2 g注入12孔培養(yǎng)板中并冷凍干燥，制得無藥物裝載的膠原蛋白海綿支架。

1.4 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架相關(guān)檢測指標

1.4.1 支架的結(jié)構(gòu)表征：將紅景天苷-膠原蛋白海綿支架樣品撕取小塊后通過雙面導(dǎo)電膠固定在樣品臺上，然后進行濺射噴金處理，處理后采用掃描電子顯微鏡在加速電壓下觀察其表面與斷面結(jié)構(gòu)。

1.4.2 支架的孔隙率：采用乙醇滲透法測定支架的孔隙率。將體積為10 mL的離心管裝滿乙醇并稱重(記為W1)，支架稱重(記為Ws)后浸入裝滿乙醇的離心管內(nèi)，放入超聲儀超聲30 min，然后再加滿乙醇并稱重(記為W2)。將吸滿乙醇的樣品取出后，將剩余的乙醇和離心管稱重(記為W3)。同時將無藥物裝載的膠原蛋白海綿支架作為對照組,實驗重復(fù)3次取均值。計算孔隙率，孔隙率=(W2-W3-Ws)/(W1-W3)×100%。

1.4.3 支架的體外藥物釋放度：將紅景天苷-膠原蛋白海綿支架完全浸入10 mL磷酸鹽緩沖溶液中，置于37℃恒溫搖床。置于恒溫搖床后開始計時，于5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、120 min分別取樣保存。采用高效液相色譜法檢測溶液中的藥物含量，計算累積釋放度。通過梯度濃度的紅景天苷樣品的峰面積求出標準曲線(Y=3×106X+13472，其中X為濃度，Y為峰面積)，然后根據(jù)標準曲線計算不同時間的藥物釋放度，累計加和后計算累積釋放度。色譜條件：色譜柱為Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為水-甲醇(85 ∶15)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為275 nm；柱溫為30℃；進樣量5 μL。實驗重復(fù)3次取均值。

1.5 動物模型制備與分組 按隨機數(shù)字表法將24只SD大鼠分為模型組、膠原蛋白海綿支架組和紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組，每組8只。各組大鼠以10%水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20170110)腹腔注射(0.4 mL/100 g)麻醉后，背部備皮并用碘附消毒，在背部正中線兩側(cè)用手術(shù)刀各切除一個直徑為2 cm的全層圓形皮膚創(chuàng)口，并將每組切除后的正常皮膚固定包埋行HE染色。模型組創(chuàng)口不做其他處理，僅用紗布包扎，其他兩組分別用膠原蛋白海綿支架組、紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組植入大鼠皮膚創(chuàng)面，并用醫(yī)用膠布包扎。待大鼠蘇醒后分籠飼養(yǎng)，造模后3 d腹腔注射青霉素-鏈霉素雙抗0.5 mL/(100 g·次)，1次/d，連用3 d，以防止傷口感染。

1.6 大鼠的觀察指標

1.6.1 一般情況：術(shù)后觀察各組大鼠存活情況、有無感染以及創(chuàng)口愈合情況。

1.6.2 創(chuàng)傷愈合率：造模后第7、14、21、28天，每組隨機取2只大鼠測量4個創(chuàng)口面積，用半透明塑料薄膜貼附于創(chuàng)口后分別沿邊緣描記和拍照，將照片掃描入計算機，通過Image-Pro Plus軟件測算愈合面積，其中造模成功后的面積為原創(chuàng)面面積。愈合率(%)=(原創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面面積×100%。

1.6.3 組織病理學(xué)變化：造模后第7、14、21、28天，每組測量創(chuàng)傷愈合率后處死2只大鼠，取包括整個創(chuàng)面及其周邊5 mm的全層組織，將組織塊置于4%中性多聚甲醛中固定24 h。隨后常規(guī)石蠟包埋后備用。蠟塊常規(guī)脫水、包埋，切片后行HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。此外，在造模后第28天，將每組2只大鼠的4張切片，在40倍光學(xué)顯微鏡下分5個視野，每個視野測量1次新生上皮厚度，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架大體外觀及電鏡下結(jié)構(gòu) 海綿支架色澤潔白，柔軟疏松(圖1A)。電鏡下可觀察到內(nèi)部具有高度互聯(lián)的多孔結(jié)構(gòu)，孔與孔之間呈緊密排列狀態(tài)，孔徑大小在40～200 μm范圍(圖1B)。

圖1 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架外觀圖(A)與掃描電鏡圖(B)

2.2 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架孔隙率 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架與單純膠原蛋白海綿支架的孔隙率分別為(71.359±4.057)%、(64.930±2.359)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.373，P=0.077)。

2.3 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架的藥物體外累積釋放率 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架中的紅景天苷在體外能快速釋放，在30 min基本釋放完全，這說明膠原蛋白海綿支架并不影響紅景天苷藥物釋放。見圖2。

圖2 紅景天苷-膠原蛋白海綿支架體外紅景天苷累積釋放率

2.4 3組大鼠一般情況及創(chuàng)口愈合率 各組大鼠均未出現(xiàn)創(chuàng)口感染及死亡。隨著時間推移，3組的創(chuàng)口愈合率都呈增加的趨勢(均P<0.05)。在各個時間點，兩種海綿支架組的創(chuàng)口愈合率均大于模型組(均P<0.05)，在第14天紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組的創(chuàng)口愈合率高于膠原蛋白海綿支架組(P<0.05)，在第28天兩種海綿支架組大鼠的創(chuàng)口基本愈合完全。見表1及圖3。

表1 3組大鼠不同時間點創(chuàng)口愈合率比較(x±s，%)

圖3 3組大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合情況

2.5 3組大鼠皮膚創(chuàng)口組織的病理學(xué)變化比較 造模后，光鏡下可見，第7天3組大鼠的創(chuàng)面主要表現(xiàn)為炎癥細胞滲出伴隨肉芽組織生成；第14天，各組新生組織出現(xiàn)再上皮化，真皮層內(nèi)可見肉芽組織生長活躍，成纖維細胞及新生血管增多，膠原蛋白海綿支架組和紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組中的炎癥細胞較模型組少，成纖維細胞較模型組多，再上皮化程度較模型組高；第21天，模型組表皮繼續(xù)增厚，未達完全再上皮化，新生上皮下仍有肉芽組織填充，有少量炎癥細胞浸潤，膠原蛋白海綿支架組和紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組基本完全再上皮化，偶見炎癥細胞浸潤；第28天，3組達完全再上皮化，表皮和真皮分界明顯，新生表皮各層分化良好，但紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組修復(fù)效果最佳，其再上皮化形成的新生上皮厚度接近于正常皮膚(P>0.05)，有附屬器形成，而模型組及膠原蛋白海綿支架組新生上皮厚度仍厚于正常皮膚(均P<0.05)。見圖4及表2。

圖4 大鼠皮膚創(chuàng)口組織病理學(xué)改變(HE染色，×100)

表2 第28天大鼠皮膚再生上皮厚度(x±s，μm)

3 討 論

皮膚是人體最大的器官，具有重要的免疫、傳感和保護功能。皮膚由于暴露在外界環(huán)境中，容易受到各種外界因素的影響，從而導(dǎo)致不同類型的皮膚損傷。在傷口愈合過程中，敷料在傷口處理中具有重要地位，創(chuàng)口敷料的基本功能除了作為一種保護性覆蓋物外，還可以加速愈合過程[6]。近年來，隨著對藥用植物生物活性提取物的應(yīng)用研究不斷深入，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)植物源性化合物能夠賦予傷口敷料抗氧化和抗菌活性，而這有助于傷口收縮、血管化和上皮化，更能有效地促進急慢性的創(chuàng)口愈合[7-8]。膠原蛋白具有止血性能、良好的生物相容性、可控的生物降解性、低抗原性，能夠降低細胞毒性以及刺激細胞附著和生長，被廣泛用于傷口敷料和組織工程材料[9]。紅景天苷是紅景天全草或者根莖中分離出來的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化的作用[10]。因此，本實驗將兩者相結(jié)合，構(gòu)建裝載具有抗氧化能力的紅景天苷的膠原蛋白海綿支架，并探究其對皮膚創(chuàng)傷愈合的效果。

本研究中，乙醇滲透法檢測結(jié)果和掃描電鏡圖像顯示，紅景天苷-膠原蛋白海綿支架具有高互聯(lián)性和高孔隙率，其表面和內(nèi)部均具有高度互連的多孔結(jié)構(gòu)。這樣的多孔結(jié)構(gòu)特性允許氧氣、藥物、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物在細胞間來回運輸，有利于細胞的黏附和增殖，能夠在吸收傷口滲出液的同時保持濕潤環(huán)境，從而有利于傷口的恢復(fù)[11]。本研究中紅景天苷體外釋放實驗結(jié)果表明，紅景天苷能夠在短時間內(nèi)完全釋放，快速作用于創(chuàng)口部位；同時也說明膠原蛋白海綿支架并不影響紅景天苷藥物釋放，從側(cè)面驗證了該支架的高孔隙率結(jié)構(gòu)。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)成分，是構(gòu)成細胞的骨架，有利于細胞存活、增殖和分化，在創(chuàng)面愈合過程中具有重要作用[12]。這些特性表明紅景天苷-膠原蛋白海綿支架能夠促進創(chuàng)傷愈合。

本研究中，3組大鼠的創(chuàng)口愈合率均隨時間延長而增加，且在造模后各個時間點兩種海綿支架組的創(chuàng)口愈合率均高于模型組(均P<0.05)，兩種海綿支架組創(chuàng)口在造模后第28天基本愈合完全，說明兩種海綿支架對皮膚創(chuàng)傷愈合均有良好的促進作用；此外，紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組在造模后第14天的創(chuàng)口愈合率大于膠原蛋白海綿支架組(P<0.05)，前者的愈合率已接近90%，而后者仍低于80%，提示應(yīng)用紅景天苷-膠原蛋白海綿支架后大鼠的創(chuàng)口愈合速度更快。HE染色結(jié)果顯示，在造模后第28天3組大鼠達完全再上皮化，新生表皮各層分化良好，但紅景天苷-膠原蛋白海綿支架組的再上皮化形成的新生上皮厚度接近正常皮膚(P>0.05)，并有附屬器形成，而膠原蛋白海綿支架組的新生上皮結(jié)構(gòu)厚度仍大于正常皮膚(P<0.05)。這提示紅景天苷膠原蛋白海綿支架對皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)效果優(yōu)于膠原蛋白海綿支架。正常傷口修復(fù)是一個動態(tài)復(fù)雜的過程，需要適宜的環(huán)境來促進愈合過程。創(chuàng)傷愈合的生理過程涉及止血期、炎癥反應(yīng)期、增殖期、創(chuàng)面收縮和組織重塑期[13]。創(chuàng)面組織中過量氧自由基能夠干擾止血、炎癥、血管生成和再上皮化等過程，抗氧化劑是調(diào)節(jié)創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵分子[14]。本實驗制備的紅景天苷-膠原蛋白海綿支架是一個三維支架結(jié)構(gòu)，可提供一個保護屏障來保護傷口免受外界濕度和微生物的影響，其多孔結(jié)構(gòu)有利于細胞的黏附和增殖，允許氣體交換，同時也提供了細胞外基成分，符合愈合特性[7，15]。此外，紅景天苷膠原蛋白海綿支架可同時作為載體，釋放具有抗氧化和對損傷修復(fù)有一定作用的植物提取物紅景天苷[16-17]，發(fā)揮其生物特性。因此，紅景天苷-膠原蛋白海綿支架對皮膚創(chuàng)傷具有良好的促愈合作用。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建紅景天苷-膠原蛋白海綿支架，其具有修復(fù)皮膚創(chuàng)口及促皮膚再上皮化的潛力，可通過進一步研究和優(yōu)化以獲得理想的皮膚創(chuàng)傷修復(fù)支架材料。