丁紅珂 余麗華 曾玉坤 劉玲 尹愛華 盧建 張彥 蘭菲菲

外胚層發(fā)育不良（Ectodermal dysplasia，EDs）是一種遺傳性人類疾病，會(huì)影響外胚層起源的結(jié)構(gòu)，是一組臨床和先天異質(zhì)性的疾病，其特征是兩個(gè)或兩個(gè)以上的外胚層結(jié)構(gòu)發(fā)育障礙，包括頭發(fā)、牙齒、指甲或汗腺的異常，這類疾病降低了患者的生活質(zhì)量。還有其他外胚層結(jié)構(gòu)可能與EDs有關(guān)，如乳腺、甲狀腺、胸腺、垂體前葉，腎上腺髓質(zhì)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，黑色素細(xì)胞，外耳，淚腺和導(dǎo)管，結(jié)膜，角膜和瞼板腺［1］。研究報(bào)道的已有200多種EDs類型［1-2］，最常見的表型是無(wú)汗或少汗型外胚層發(fā)育不良（HED/EDA）。盡管存在常染色體隱性和顯性形式，但X連鎖隱性遺傳是該病最常見的遺傳方式，在普通人群中，每17 000個(gè)新生兒中就有一個(gè)患有此?。?］。

EDA基因（OMIM ID：300451）是X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良1型（OMIM ID：305100，中文名稱來(lái)源于CHPO數(shù)據(jù)庫(kù)：http：//chinahpo.org/）的主要致病基因。人類EDA基因有5種轉(zhuǎn)錄本，其中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本編碼由391個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，其余4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，編碼缺少膠原結(jié)構(gòu)域的截短蛋白［4］。Kere等報(bào)道了EDA1基因的定位克隆，他們從一個(gè)成年人的汗腺cDNA文庫(kù)中鑒定出一個(gè)代表全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的cDNA，該轉(zhuǎn)錄本由2個(gè)外顯子組成。推測(cè)基因產(chǎn)物是135個(gè)殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)計(jì)包含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。該基因表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞、毛囊、汗腺，表達(dá)的EDA1蛋白通過(guò)EDA受體在皮膚附件的形成過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。Kere等還在幾例EDA患者中，發(fā)現(xiàn)了EDA1基因的缺失和突變［5］。Srivastava等克隆了小鼠的“Tabby”（Ta）基因，并鑒定出3種不同的轉(zhuǎn)錄亞型，分別編碼391、177和220個(gè)氨基酸。所有轉(zhuǎn)錄本都具有共同的第1外顯子，與人EDA的前132個(gè)氨基酸顯示88%的同源性［6］，這提示第1外顯子對(duì)于野生蛋白功能的發(fā)揮具有中重要作用。本文通過(guò)先證者家系致病基因的檢測(cè)和缺失斷裂位點(diǎn)的驗(yàn)證及胎兒的產(chǎn)前診斷，為先證者母親生育健康孩子提供遺傳咨詢。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

患兒，男，13歲，足月順產(chǎn)，臨床表現(xiàn)為皮膚干燥，少汗（腳底可少量出汗），毛發(fā)稀少（無(wú)眉毛，睫毛稀少），牙齒發(fā)育不良（共出牙4顆），具有外胚層發(fā)育不良的特殊面容?；純耗赣H孕3產(chǎn)3，曾生育一名男嬰出生后不明原因夭折?；純耗赣H未見明顯異常。

1.2 標(biāo)本采集

經(jīng)簽署知情同意書及廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，采集先證者及其父母外周血2 mL（EDTA抗凝）進(jìn)行相關(guān)分子遺傳學(xué)檢測(cè)。經(jīng)過(guò)知情同意，母親于孕13周時(shí)在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行絨毛穿刺抽取術(shù)抽取胎兒絨毛。使用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的Qiamp DNA Blood Mini Kit提取劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。

1.3 方法

1.3.1 高通量測(cè)序

先證者DNA進(jìn)行與外胚層發(fā)育不良的相關(guān)基因高通量測(cè)序，由廣州嘉檢醫(yī)學(xué)檢測(cè)公司完成。高通量測(cè)序結(jié)果分析包含相 關(guān)的EDA、EDAR、ABCC9、DSP、EVC2等38個(gè)基因，630個(gè)編碼區(qū)，99 981個(gè)堿基，平均覆蓋深度183+/-89×，大于10×覆蓋區(qū)間占99.4%，大于20×覆蓋區(qū)間占98.9%。參考序列版本號(hào)：GRCh37/hg19。

1.3.2 高通量測(cè)序CNV計(jì)算

使用CASAVA v1.7（美國(guó)，Illumina公司）軟件將原始圖像轉(zhuǎn)換為堿基序列并按樣本特異的DNA條碼進(jìn)行拆分。拆分后的序列數(shù)據(jù)由NextGENe軟件（SoftGenetics，State College，PA）進(jìn)一步處理進(jìn)行比對(duì)。刪除低質(zhì)量的reads（Phred分?jǐn)?shù)＜Q25）。每個(gè)外顯子的平均覆蓋率使用特定捕獲基因的bed文件數(shù)據(jù)中提取。通過(guò)分析檢測(cè)到的可能具有拷貝數(shù)變化的外顯子會(huì)被自動(dòng)描繪出來(lái)，以供進(jìn)一步驗(yàn)證。檢測(cè)CNV的腳本存放于https：//sourceforge.net/projects/cnvanalysis。

1.3.3 染色體微陣列分析（Chromosomal Microarray Analysis，CMA）

使用美國(guó)Affymetrix公司生產(chǎn)的CytoScan750 k芯片和擴(kuò)增、雜交試劑盒進(jìn)行CMA檢測(cè)。參照Infinium HD Assay標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行操作，檢測(cè)結(jié)果使用Chromosome Analysis Suite（Ch AS；version 2.1）軟件進(jìn)行分析。結(jié)果判讀參照DGV、ISCA、OMIM、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.4 斷裂位點(diǎn)PCR檢測(cè)

根據(jù)CMA檢測(cè)結(jié)果提示的CNV缺失區(qū)域，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，其中引物L(fēng)FS2-LR1配對(duì)擴(kuò)增出1 061 bp片段，上游引物5′-GTCAGGCAGGCTTACTACCCA-3′，下游引物5′-ACCAGACAATGTATACGTTAAGTGC-3′。同時(shí)用LFS2-LR1擴(kuò)增200例正常對(duì)照。將1 061 bp擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)分析，判斷EDA基因第一外顯子缺失斷裂位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置。

2 結(jié)果

2.1 分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果及分析

2.1.1 高通測(cè)序結(jié)果

未發(fā)現(xiàn)38個(gè)相關(guān)基因的致病/疑似致病點(diǎn)突變。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)先證者EDA基因第一外顯子編碼區(qū)（396bp）信號(hào)缺失，正常對(duì)照可檢測(cè)到序列信息（圖1）。

圖1 高通量測(cè)序提示EDA基因第一外顯子信號(hào)缺失Figure 1 Absent signal of the EDA gene exon 1 detected by next generation sequencing

2.1.2 染色體微陣列分析

CMA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)X染色體存在約267 kb片段缺失（chrX：68，801，113-69，068，115），其中包含了EDA基因第一外顯子及上下游區(qū)域（圖2）。

2.1.3 斷點(diǎn)PCR檢測(cè)

LFS2-LR1引物對(duì)在先證者及其母親樣本中擴(kuò)增出1 061 bp片段，正常對(duì)照未擴(kuò)增出相應(yīng)片段（圖3）。并對(duì)包含可疑斷點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了Sanger測(cè)序，提示先證者EDA基因缺失范圍為chrX：68，800，768-69，068，576，缺失片段總長(zhǎng)267 808 bp，包含了EDA基因上游35 143 bp，第一外顯子638 bp以及第一內(nèi)含子區(qū)域的232 027 bp（圖4）。

圖2 先證者染色體微陣列檢測(cè)結(jié)果Figure2 Chromosomal Microarray Analysisresultof the proband

圖3 斷點(diǎn)PCR檢測(cè)電泳圖Figure 3 Electrophoretogram results of the breakpoint PCR detection

圖4 EDA基因缺失范圍示意圖和包含斷點(diǎn)的PCR產(chǎn)物測(cè)序圖Figure 4 The diagram of the EDA gene deletion fragments and the PCR products sequencing result containing breakpoint

2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果

對(duì)胎兒絨毛DNA進(jìn)行斷裂位點(diǎn)PCR檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)先證者的1 061 bp片段，同時(shí)對(duì)胎兒進(jìn)行CMA檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)異常。提示胎兒未遺傳來(lái)自母親的EDA基因第一外顯子拷貝數(shù)缺失。胎兒分娩后隨訪結(jié)果，女嬰，生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)異常，8個(gè)月大出牙2顆，頭發(fā)生長(zhǎng)正常。

3 討論

少汗型外胚層發(fā)育不良（Hypohidrotic Ectodermal Dysplasia，HED）的發(fā)病機(jī)制與編碼皮膚附件分化相關(guān)信號(hào)通路上的基因突變有關(guān)，可導(dǎo)致牙齒發(fā)育不全或其他外胚層結(jié)構(gòu)缺陷［1，3］。EDA基因包括8個(gè)外顯子，編碼391個(gè)氨基酸［7］，是HED最常見的致病基因，目前報(bào)道有200多個(gè)突變［8］，以編碼區(qū)的單堿基突變居多［9］。

近年來(lái)EDA基因CNV也有報(bào)道［10-13］。本文利用高通量測(cè)序檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)先證者EDA基因第一外顯子編碼區(qū)信號(hào)缺失，結(jié)合先證者典型的HED表型，提示EDA上游區(qū)域存在CNV可能。通過(guò)CMA檢測(cè)提示存在大片段缺失，為尋找精確缺失范圍，通過(guò)斷點(diǎn)PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)先證者存在約267 kb的缺失片段，包含了EDA基因第一外顯子及其上下游區(qū)域，遺傳自母親。該CNV使野生蛋白丟失了轉(zhuǎn)錄翻譯起始區(qū)，推測(cè)無(wú)法正常產(chǎn)生野生型EDA蛋白。野生蛋白的破壞情況以及是否存在新的轉(zhuǎn)錄本需要更一步的實(shí)驗(yàn)研究。有研究指出非等位基因同源重組和復(fù)制機(jī)制在解釋多種生殖系和體細(xì)胞重排事件中發(fā)揮了重要作用［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該家系CNV斷點(diǎn)上下游存在一些repeat masker序列，這些同源性較高的序列很可能是通過(guò)以上機(jī)制介導(dǎo)了CNV的發(fā)生。

本次實(shí)驗(yàn)明確先證者的可能致病原因及其母親為攜帶者后，經(jīng)過(guò)充分知情告知，對(duì)家系第三胎進(jìn)行CMA和斷裂位點(diǎn)PCR檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶該缺失區(qū)域，胎兒出生后未見異常。該病表型嚴(yán)重的成年男性患者生存質(zhì)量較差，少數(shù)EDA基因突變的女性攜帶者有輕微癥狀［15］。本研究明確了先證者HED表型的病因，并且找到了缺失CNV的精確斷裂位點(diǎn)，可以快速進(jìn)行家系其他成員的檢測(cè)，為先證者母親提供了準(zhǔn)確的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷信息，豐富了我國(guó)X連鎖的HED患者EDA基因外顯子的缺失數(shù)據(jù)庫(kù)，為該疾病篩查、診斷和產(chǎn)前診斷提供遺傳學(xué)參考數(shù)據(jù)，并為可能的EDA基因第一外顯子缺失的發(fā)生機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。