何呂芬 李沙 利振坤 李歡 王立程 符曉瑩 黎元莉 陳海 陳少金 朱雄

2019年12月以來(lái)，湖北省武漢市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多起新型冠狀病毒［后來(lái)更新為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）］感染后引起新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease2019，COVID-19）的病例，隨后疫情迅速蔓延至全國(guó)各省市。SARSCoV-2屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm。其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARSCoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV）有明顯區(qū)別。目前研究顯示SARS-CoV-2與蝙蝠SARS樣冠狀病毒（bat-SL-COVZC45）同源性達(dá)85%以上［1］。該病作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，按甲類管理。隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的不斷深入，我國(guó)先后發(fā)布了《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》及《新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案》等規(guī)范性文件，并已進(jìn)行了多次更新［2-3］。

病原學(xué)檢測(cè)是診斷COVID-19的金標(biāo)準(zhǔn)。由于病毒測(cè)序技術(shù)對(duì)人員、設(shè)備要求較高［4］，因此采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)核酸是目前確診SARS-CoV-2最為廣泛的方法。ISO15189是國(guó)際醫(yī)學(xué)界普遍承認(rèn)并遵照?qǐng)?zhí)行的關(guān)于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力方面要求的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。2019年2月15日最新發(fā)布的CNAS-GL039［5］文件由中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)制定，是對(duì)CNAS-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》中有關(guān)分子診斷相關(guān)檢驗(yàn)程序進(jìn)行性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所做的具體解釋和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選取2020年1月25日至2020年2月24日在三亞市人民醫(yī)院檢測(cè)的SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性和陰性樣本所有患者均已鑒知情同意書及通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)。

1.2 試劑與儀器

核酸提取或純化試劑盒（批號(hào)：2019004）、2019新型冠狀病毒（ORF1ab/N）核酸檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20200123）、DA3200核酸提取儀，均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；ABI 7500型PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.3 檢測(cè)方法

按試劑盒說(shuō)明書操作，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50℃15 min；95℃15 min；94℃15 s；55℃45 s；共45個(gè)循環(huán)，在55℃采集熒光信號(hào)。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)試劑盒要求，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①如果檢測(cè)樣本在ORF1ab和N基因通道無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值＞38，判為SARS-CoV-2陰性；②如果檢測(cè)樣品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明顯的擴(kuò)增曲線，判為SARS-CoV-2陽(yáng)性；③如果檢測(cè)樣品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道無(wú)擴(kuò)增曲線，建議復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果與原結(jié)果一致，判為SARS-CoV-2陽(yáng)性。

1.5 性能驗(yàn)證方法及指標(biāo)

1.5.1 精密度評(píng)估

選取4例咽拭子，其中SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性3例（S1、S2、S3），陰性1例（S4）。批內(nèi)精密度試驗(yàn)，在同一批試驗(yàn)中重復(fù)檢測(cè)20次；批間精密度試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定4 d，共計(jì)測(cè)定20次。要求變異系數(shù)（CV）≤5%，陰陽(yáng)性符合率均＞95%，則精密度符合要求。

1.5.2 準(zhǔn)確度評(píng)估

選取經(jīng)海南省COVID-19診斷專家組確診為COVID-19患者的咽拭子10例和三亞市疾控中心已確認(rèn)的5例咽拭子（SARS-CoV-2陽(yáng)性3例、陰性2例）進(jìn)行檢測(cè)，分析結(jié)果的一致程度，陰陽(yáng)性符合率＞95%，則準(zhǔn)確度符合要求。

1.5.3 最低檢測(cè)下限評(píng)估

將1例SARS-CoV-2核酸濃度為2.33×106copies/mL的咽拭子樣本分別稀釋為1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/mL，核酸提取后，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度測(cè)試，初步測(cè)試該方法的靈敏度范圍，再進(jìn)一步各進(jìn)行10個(gè)重復(fù)測(cè)試確定最低檢測(cè)下限，計(jì)算各濃度檢出率，100%檢出率的最小值為檢測(cè)下限。

1.5.4 特異性評(píng)估

將冠狀病毒（OC43、NL63、229E、HKU1）、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、人巨細(xì)胞病毒、MERS冠狀病毒樣顆粒、SARS冠狀病毒樣顆粒分別加入到SARS-CoV-2陰性的咽拭子樣本中，同時(shí)各以1例陰性和陽(yáng)性樣本為陰陽(yáng)性對(duì)照，各重復(fù)檢測(cè)3次?？山邮苄阅軜?biāo)準(zhǔn)：不應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線或Ct值。

1.5.5 內(nèi)源性干擾評(píng)估

選取1例SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性的咽拭子樣本分成4份，各200μL，每份樣本加入正常人紅細(xì)胞0、6、10、12μL，紅細(xì)胞濃度分別是0%、3%、5%、6%，提取核酸后進(jìn)行復(fù)孔擴(kuò)增，重復(fù)5次，要求變異度（CV）≤5%，并評(píng)判符合性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算計(jì)量資料的均數(shù)、方差、標(biāo)準(zhǔn)差和CV值。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證

批內(nèi)精密度試驗(yàn)中，SARS-CoV-2樣本陽(yáng)性3例（S1、S2、S3），重復(fù)測(cè)定20次，ORF1ab基因通道的Ct值的平均值分別是23.19、30.06、33.87，其變異系數(shù)CV分別是1.21%、1.52%、1.49%；N基因通道的Ct值的平均值分別是23.19、29.07、33.11，其變異系數(shù)CV分別是1.34%、1.54%、1.46%。批間精密度試驗(yàn)中，SARS-CoV-2樣本陽(yáng)性3例（S1、S2、S3），重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定4 d，ORF1ab基因通道的Ct值的平均值分別是23.30、30.01、33.98，其變異系數(shù)CV分別是2.05%、1.97%、2.05%；N基因通道的Ct值的平均值分別是23.16、28.96、33.07，其變異系數(shù)CV分別是2.09%、1.92%、1.91%。精密度試驗(yàn)的陰性、陽(yáng)性符合率均為100%，所有通道的Ct值的變異系數(shù)CV＜5%，精密度符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

15例樣本進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示：13例為SARS-CoV-2陽(yáng)性，ORF1ab基因通道的Ct值為22.40～35.62，N基因通道的Ct值為21.31～37.25，Ct值均＜38，且有明顯的擴(kuò)增曲線；2例陰性，在ORF1ab和N基因通道均無(wú)擴(kuò)增曲線。與海南省COVID-19診斷專家組和三亞市疾控中心的結(jié)果一致，陽(yáng)性和陰性樣本符合率均為100%，其準(zhǔn)確性符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 最低檢測(cè)下限

濃度為10倍差梯度（1×106～1×103copies/mL）的SARS-CoV-2樣本，ORF1ab和N基因檢測(cè)通道均有明顯擴(kuò)增曲線，且Ct值均＜38；1×102copies/mL SARS-CoV-2樣本，雙基因通道雖然存在熒光信號(hào)和擴(kuò)增曲線，但ORF1ab和N基因Ct值分別是：38.23、40.75，見(jiàn)圖1。因此，采用濃度為1×103、5×102、2×102copies/mL的SARS-CoV-2樣本，各重復(fù)測(cè)試10次。1×103copies/mL SARS-CoV-2樣本雙基因通道的Ct值均＜38，檢出率均為100%，見(jiàn)圖2；5×102copies/mL SARS-CoV-2樣本雙基因通道雖然存在熒光信號(hào)和擴(kuò)增曲線，但ORF1ab和N基因檢出率分別是90%、80%。見(jiàn)圖3。

2.4 特異性驗(yàn)證

除SARS-CoV-2陽(yáng)性樣本有擴(kuò)增曲線外，其它均無(wú)擴(kuò)增曲線，表明該檢測(cè)體系具有較好的特異性，見(jiàn)圖4。

圖1 雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系靈敏度測(cè)試擴(kuò)增曲線Figure 1 Amplification curves of dual real-time fluorescent RT-PCRsystem sensitivity

圖2 1×103 copies/mL SARS-CoV-2樣本雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線Figure 2 Dual real-time fluorescence RT-PCRamplification curves of 1×103 copies/mL SARS-CoV-2 samples

圖3 5×102 copies/mL SARS-CoV-2樣本雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線Figure 3 Dual real-time fluorescence RT-PCR amplification curves of 5×102 copies/mL SARS-CoV-2 nucleic samples

2.5 內(nèi)源性干擾

圖4 雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)特異性擴(kuò)增曲線Figure 4 Amplification curves of dual real-time fluorescent RT-PCR reaction specificity

紅細(xì)胞濃度分別為0%、3%、5%、6%的SARSCoV-2的陽(yáng)性樣本，復(fù)孔擴(kuò)增，重復(fù)5次，ORF1ab基因通道的Ct值的平均值分別是32.10、33.44、32.94、30.68，其變異系數(shù)CV分別是1.37%、2.57%、2.29%、2.00%；N基因通道的Ct值的平均值分別是30.81、32.03、31.56、29.18，其變異系數(shù)CV分別是1.03%、2.72%、2.05%、0.88%。所有通道Ct值的變異系數(shù)CV＜5%，符合率均為100%，表明不存在明顯的內(nèi)源性干擾，驗(yàn)證結(jié)果通過(guò)。

3 討論

分子生物學(xué)方法敏感性高，特異性強(qiáng)，已逐漸成為病毒檢測(cè)的主要方法。RT-PCR是最常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法之一，廣泛應(yīng)用于臨床疾病的診斷、療效評(píng)估和預(yù)后檢測(cè)［6-8］。依據(jù)ISO15189和CNAS-GL039性能評(píng)價(jià)，新試劑和新項(xiàng)目應(yīng)用于臨床檢測(cè)前必須對(duì)其檢測(cè)體系進(jìn)行嚴(yán)格的方法學(xué)評(píng)價(jià)和性能驗(yàn)證，定性項(xiàng)目至少對(duì)準(zhǔn)確度、檢測(cè)下限、特異性及抗干擾能力進(jìn)行驗(yàn)證。

檢測(cè)系統(tǒng)良好的精密度是進(jìn)行其他方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的前提［9-10］。本研究結(jié)果顯示，精密度試驗(yàn)的陰性和陽(yáng)性符合率均為100%，ORF1ab和N基因通道的Ct值的CV值均小于5%，表明試劑盒重復(fù)性高，隨機(jī)誤差小。內(nèi)源性抗干擾能力CV值均小于5%，表明試劑盒抗干擾能力良好。與冠狀病毒（OC43、NL63、229E、HKU1）、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、人巨細(xì)胞病毒等無(wú)交叉反應(yīng)，因條件限制，未能獲取MERS-CoV和SARS-CoV，使用MERS和SARS冠狀病毒樣顆粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，尚不能說(shuō)明與MERS-CoV和SARS-CoV無(wú)交叉反應(yīng)，但試劑廠家前期的研發(fā)結(jié)果顯示：與MERS-CoV和SARS-CoV無(wú)交叉反應(yīng)。因此，RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度高，重復(fù)性好，抗干擾力強(qiáng)，檢測(cè)下限和特異性均符合要求，可用于臨床檢測(cè)。

SARS-CoV-2核酸結(jié)果受多因素影響，如采樣標(biāo)本是否合格、操作是否規(guī)范、檢測(cè)試劑盒本身敏感性等問(wèn)題，臨床上若出現(xiàn)鼻、咽拭子陰性而流行病學(xué)史、癥狀或影像學(xué)表現(xiàn)高度疑似COVID-19的患者，建議同時(shí)采下呼吸道樣本進(jìn)行核酸檢測(cè)，選擇不同的檢測(cè)試劑，或者增加檢測(cè)次數(shù)［11-12］。

綜上所述，本研究依據(jù)ISO 15189和CNASGL039文件，對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行性能驗(yàn)證，嚴(yán)把質(zhì)量控制關(guān)，有助于規(guī)范SARSCoV-2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理，提高SARS-CoV-2檢測(cè)結(jié)果的可靠性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。