王琦 謝曉佩 吳慶俠

摘要：益生枯草芽孢桿菌可以替代部分抗生素，安全無(wú)污染，在臨床上具備治療、預(yù)防細(xì)菌性腸道疾病的功效。為研究牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)大腸埃希氏菌是否具有益生作用，試驗(yàn)采用體外抑菌試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、大腸埃希氏菌攻毒和制作石蠟切片觀察腸道組織變化的方法，探究其益生作用。結(jié)果表明，在4株牦牛源枯草芽孢桿菌中，Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直徑達(dá)到（25±1） mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直徑分別達(dá)到（17±1）、（22±2）、（20±2） mm。從病理切片得出，試驗(yàn)組腸道組織較對(duì)照組大幅改善。因此，該菌具有治療大腸埃希氏菌疾病的作用，有作為益生菌株的潛能，為西藏地區(qū)益生菌種提供了參考。

關(guān)鍵詞：牦牛源枯草芽孢桿菌;益生作用;大腸埃希氏菌;治療;切片

中圖分類號(hào)： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）11-0157-09

收稿日期：2019-07-02

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)及轉(zhuǎn)化計(jì)劃（編號(hào)：XZ201902NB05）;西藏自治區(qū)科技重大專項(xiàng)（編號(hào)：XZ201901NA02）;國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：CARS-37）。

作者簡(jiǎn)介：王 琦（1997—），女，山東泰安人，從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。E-mail：1154101489@qq.com。

通信作者：吳慶俠，博士，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物疾病病理研究。E-mail：goodwqx@163.com。 ?在集約化、規(guī)?；膭?dòng)物生產(chǎn)模式下，畜禽舍諸多應(yīng)激因子富集，致使動(dòng)物機(jī)體免疫力下降，發(fā)病率大幅提高。我國(guó)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始使用抗生素，以此來(lái)預(yù)防、治療細(xì)菌感染，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，應(yīng)用抗生素治療細(xì)菌性疾病的方法雖對(duì)畜禽疾病有顯著成果，但隨著抗生素的普及甚至濫用，卻給社會(huì)帶來(lái)了藥物殘留、病菌產(chǎn)生耐藥性、環(huán)境污染等多種問(wèn)題，直接危害人類健康[2]。嚴(yán)格控制抗生素的使用，杜絕其濫用已成為各國(guó)的共識(shí)。因此，尋求無(wú)污染、無(wú)毒副作用、無(wú)藥物殘留、效果好的微生態(tài)制劑已成為研究的熱點(diǎn)[3-4]。抗生素的替代品有多種，而在眾多替代品中，益生菌作為一種無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)藥物殘留、無(wú)耐藥性的微生態(tài)制劑，有利于平衡腸道內(nèi)的菌群，可治療、預(yù)防細(xì)菌性疾病，已成為動(dòng)物疾病防治的新選擇[5]。

長(zhǎng)期以來(lái)，腹瀉一直是困擾動(dòng)物行業(yè)的一個(gè)重要問(wèn)題，大量甚至過(guò)量使用抗生素，雖然能在短期內(nèi)奏效，但缺乏長(zhǎng)期可持續(xù)效果[6]。由于抗生素的普遍使用，致使外界環(huán)境和動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)菌對(duì)現(xiàn)在所使用的抗生素都表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，因此尋求一種新的安全有效、無(wú)污染的抗生素替代物對(duì)動(dòng)物行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要[6]。與此同時(shí)，西藏牦牛多發(fā)春季腹瀉，現(xiàn)階段開(kāi)發(fā)的枯草芽孢桿菌制品并不能完全科學(xué)高效地適應(yīng)西藏牧區(qū)的需要，因此篩選出安全、科學(xué)、有效的適宜高原動(dòng)物使用的具有益生性能的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）至關(guān)重要。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株

耐腸液耐膽鹽的牦牛源枯草芽孢桿菌4株（Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7），均由西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

大腸埃希氏菌（血清型O111），由西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;金黃色葡萄球菌（ATCC29213），由南京合益生物技術(shù)有限公司供給。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

4只健康家兔購(gòu)自林芝某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.3 主要試劑及試劑盒

藥敏紙片、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、枯草芽孢桿菌選擇培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、麥康凱瓊脂均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑設(shè)備有限公司;95%乙醇、切片石蠟、二甲苯均購(gòu)自成都市聯(lián)合化工試劑研究所;蘇木精染色液（A液）、伊紅染液（醇溶型）（B液）、分化液（C液）、返藍(lán)液（D液）、10%福爾馬林中性固定液均購(gòu)自南昌雨露實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4 主要儀器

LRH-150生化培養(yǎng)箱、干熱消毒箱均購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Jan-90磁力攪拌器、電子天平、HH S-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、HNY-2112B恒溫振蕩器均購(gòu)自金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘鷹離心機(jī)有限公司;TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司;QP-3168轉(zhuǎn)輪式石蠟切片機(jī)、TEC-2800病理組織包埋冷凍臺(tái)、TEC-2800組織包埋機(jī)均購(gòu)自常州市郝思林醫(yī)用儀器有限公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌液復(fù)蘇

取于-80 ℃冰箱保存的枯草芽孢桿菌Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7的菌液各 1 mL，將其接種于B.subtilis選擇培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將菌復(fù)蘇，然后用接種環(huán)選取單個(gè)菌落，接種于100 mL NB培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h，以增強(qiáng)細(xì)菌活力[7]。

2.2 牦牛源枯草芽孢桿菌的抑菌試驗(yàn)

對(duì)復(fù)蘇的4株牦牛源枯草芽孢桿菌的12 h培養(yǎng)物3 500 r/min離心5 min。將指示菌大腸埃希菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）復(fù)蘇，指示菌菌液濃度稀釋至10萬(wàn) CFU/mL。分別取已稀釋好的大腸埃希氏菌（血清型O111）菌液 0.4 mL 和金黃色葡萄球菌菌液0.4 mL，用滅菌的三角環(huán)均勻涂布在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上，用鑷子取出已被滅菌的牛津杯，輕輕放在已涂布過(guò)大腸桿菌O111菌液的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基和涂布過(guò)金黃色葡萄球菌菌液的NA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放4只牛津杯，注意4只牛津杯的分布位置要均勻。然后將其放入4 ℃冰箱中，30 min后取出。分別吸取 0.25 mL 離心后的Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7的上清液，然后分別注入4個(gè)牛津杯中[8]，先將其放入4 ℃冰箱擴(kuò)散24 h，然后接著將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，用游標(biāo)卡尺精準(zhǔn)測(cè)量抑菌圈直徑[9]。該試驗(yàn)操作3次，取平均值。

2.3 牦牛源枯草芽孢桿菌的藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法，根據(jù)抑菌圈直徑判斷分離的菌株對(duì)于常見(jiàn)的抗菌藥物是否敏感[10]。

復(fù)蘇菌液：用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種于NB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h，進(jìn)行增菌。取0.4 mL已稀釋好的枯草芽孢桿菌菌液，用滅菌的三角環(huán)均勻涂布在枯草芽孢桿菌選擇培養(yǎng)基上，待菌液干后，用滅菌鑷子取藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。24 h后將其拿出，用游標(biāo)卡尺精準(zhǔn)測(cè)量抑菌圈直徑[11]。該試驗(yàn)操作3次，取平均值。

2.4 牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用研究

2.4.1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在林芝農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買4只狀態(tài)良好的家兔，經(jīng)臨床檢查4只家兔均健康。將家兔隨機(jī)分為2組。4只健康家兔分別編號(hào)為1#、2#、3#、4#。1#、2#為對(duì)照組，3#、4#為試驗(yàn)組。試驗(yàn)過(guò)程中，2組兔單獨(dú)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)，飼料、飲水保證充足，衛(wèi)生狀況條件良好。飼喂周期為14 d。

試驗(yàn)進(jìn)行到15 d時(shí)，將大腸埃希氏菌（血清型O111）經(jīng)37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h后離心，收集菌體，將菌液調(diào)整到攻毒濃度[12]，對(duì)4只家兔采用腹腔注射的方法注射大腸埃希氏菌（血清型O111）。每日注射濃度為10億CFU/mL的大腸埃希氏菌（血清型O111），5 mL/只，1次/d，連續(xù)注射4 d。4只家兔均腹瀉，腹瀉率為100%。對(duì)照組2只家兔不作處理，使其自然止瀉，其中1只死亡，死亡率為50%。給試驗(yàn)組2只家兔灌服牦牛源枯草芽孢桿菌菌液，灌服劑量均為20 mL/只，1次/d，連續(xù)給藥7 d，每日觀察家兔腹瀉情況以及對(duì)照組和試驗(yàn)組家兔止瀉情況，并記錄[13]。

2.4.2 腸道病理組織觀察 連續(xù)給藥7 d后給兔耳靜脈注射空氣，將3只（共4只家兔，其中1只死于腹瀉）家兔處死，取材，制作石蠟切片。取材時(shí)打開(kāi)腹腔，將整個(gè)消化管取出，觀察是否有出血斑、出血點(diǎn)等病變現(xiàn)象，找到健康組織與病變組織的交界處，10 min內(nèi)分段取材，分別取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸各1 cm3，然后用10%中性福爾馬林固定液固定。制作石蠟切片時(shí)將病變組織切成5 mm大小，制作成石蠟切片（厚度為 6 μm），最后用蘇木素-伊紅染色，用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理變化情況。石蠟切片制作過(guò)程參照《家畜組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》完成，并做部分修改[14]。

3 結(jié)果與分析

對(duì)4株枯草芽孢桿菌進(jìn)行了大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)。4個(gè)菌株對(duì)大腸埃希氏菌（血清型O111）和金黃色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同。其中，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6對(duì)致病菌的抑制能力較強(qiáng)，Yak-KC7對(duì)致病菌的抑制能力最佳。

3.1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

4株牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)大腸埃希氏菌（血清型O111）和金黃色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同[15]。對(duì)金黃色葡萄球菌，Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直徑最大，達(dá)到26 mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直徑分別達(dá)到（16±1）、（20±2）、（20±1） mm。對(duì)大腸埃希氏菌（血清型O111），Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直徑達(dá)到（25±1） mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直徑分別達(dá)到（17±1）、（22±2）、（20±2） mm。抑菌圈直徑詳見(jiàn)表1和圖1至圖9。

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用K-B紙片擴(kuò)散法，選取20種常用藥物做試驗(yàn)，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7對(duì)于鏈霉素具有中度敏感性，說(shuō)明4個(gè)株菌對(duì)鏈霉素有一定的耐受性;而對(duì)于絕大多數(shù)的藥物敏感，不具有耐受性。試驗(yàn)結(jié)果表明，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7均無(wú)耐藥性，無(wú)攜帶耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)。在使用益生枯草芽孢桿菌時(shí)，不應(yīng)與其敏感的抗生素一起使用，這是保證益生菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵[16]，這樣既可提高動(dòng)物的抵抗力，又可增強(qiáng)微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑見(jiàn)圖10至圖12。

3.3 牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用

用篩選出的益生性能最佳的枯草芽孢桿菌 Yak-KC7，探究其對(duì)被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用。

攻毒對(duì)照組2只家兔腹瀉率為100%，自然止瀉，不作任何處理，死亡率為50%，死亡前，精神狀態(tài)不佳，喜臥，被毛粗亂無(wú)光澤;死亡后，糞便有特殊氣味，惡臭，呈稀糊狀，顏色為黃綠色。家兔肛門尾部及其周圍附有黏糞，詳見(jiàn)圖13。試驗(yàn)組腹瀉率100%，死亡率0%。給藥7 d后，觀察腹瀉情況，實(shí)驗(yàn)組家兔經(jīng)Yak-KC7的治療，劑量20 mL/頭，1次/d，共給藥7 d，無(wú)死亡，詳見(jiàn)圖14。制作石蠟切片觀察腸道組織變化，結(jié)果表明牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔具有明顯的治療作用，詳見(jiàn)圖15至圖38。

由病理組織切片可觀察到，對(duì)照組十二指腸腸壁絨毛逐漸開(kāi)始溶解，絨毛變短且排列稀疏;試驗(yàn)組十二指腸絨毛排列緊密并增長(zhǎng)，似圓指狀。對(duì)照組空腸絨毛與腸壁分離，絨毛上段斷裂，細(xì)胞排列混亂;試驗(yàn)組空腸絨毛斷裂減輕，腸壁與腸絨毛未分離，細(xì)胞間連接正常。對(duì)照組回腸腸壁絨毛與腸壁分離，絨毛中段破碎嚴(yán)重，細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)發(fā)生變形;試驗(yàn)組回腸絨毛破碎減輕，未出現(xiàn)絨毛與腸壁分離現(xiàn)象。對(duì)照組盲腸部分腸壁絨毛斷裂;試驗(yàn)組盲腸破壞程度大大減輕。對(duì)照組結(jié)腸絨毛嚴(yán)重破碎，細(xì)胞排列混亂、混淆不清，絨毛與腸壁開(kāi)始

分離;試驗(yàn)組結(jié)腸絨毛破碎減輕。對(duì)照組直腸與試驗(yàn)組直腸無(wú)顯著性差異。

綜上， 試驗(yàn)組腸道病理變化較對(duì)照組腸道病理變化均大幅改善。對(duì)照組腸道損傷較大，刷狀緣損傷，微絨毛萎縮，上皮細(xì)胞排列紊亂。具體表現(xiàn)為

腸黏膜水腫、萎縮、壞死，細(xì)胞排列混亂，腸壁脫落明顯，細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)扭曲。結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致功能受損， 導(dǎo)致動(dòng)物嚴(yán)重腹瀉。試驗(yàn)組經(jīng)牦牛源枯草芽

孢桿菌Yak-KC7治療，絨毛水腫現(xiàn)象、黏膜病理變化顯著改善，絨毛高度明顯增加，排列更緊湊整齊，上皮細(xì)胞無(wú)脫落現(xiàn)象[17-21]。

4 討論

益生枯草芽孢桿菌作為一種生物拮抗劑，有利

于平衡腸道菌群，還能夠治療、預(yù)防細(xì)菌性疾病[22]。且由于能夠產(chǎn)生芽孢，在長(zhǎng)期儲(chǔ)存甚至惡劣環(huán)境中仍可以保證活菌數(shù)，因此成為了益生菌的熱選方向

之一[23]。本試驗(yàn)便是通過(guò)給被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔灌服牦牛源枯草芽孢桿菌 Yak-KC7，探究其對(duì)家兔腸道組織是否具有益生作用。

郭夢(mèng)嬌在研究中指出，盡管許多科研結(jié)果表明B.subtilis具有益生菌的潛力和功能，但B.subtilis至今在市場(chǎng)上沒(méi)有得到很好的應(yīng)用。研究表明，主要原因是沒(méi)有性能足夠優(yōu)良的菌種用于實(shí)際生產(chǎn)[21]。

4.1 抑菌試驗(yàn)

研究證明，大多數(shù)芽孢桿菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性有致病能力的菌都有抑制作用[23]，對(duì)金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等都有抑制能力。而本試驗(yàn)僅證明了Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7對(duì)大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力，因此后續(xù)還應(yīng)對(duì)更多菌種進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

4.2 藥敏試驗(yàn)

至關(guān)重要的是，益生菌須滿足不具有耐藥性這一特性，以確保食用安全性。試驗(yàn)結(jié)果表明，牦牛源枯草芽孢桿菌不具有耐藥性，不存在攜帶或轉(zhuǎn)移耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，在使用益生枯草芽孢桿菌時(shí)，不應(yīng)與其敏感的抗生素一起使用，這是保證益生菌起作用的關(guān)鍵。

4.3 牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用

動(dòng)物性試驗(yàn)的牦牛源枯草芽孢桿菌使用劑量是根據(jù)枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌O111攻毒的家兔治療使用劑量的試驗(yàn)而定。治療劑量為20 mL/頭，1次/d，持續(xù)給藥7 d。關(guān)于牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒家兔細(xì)菌性腹瀉的治療作用，筆者僅進(jìn)行了每天給藥1次的治療試驗(yàn)，而沒(méi)有做每天給藥2次和3次的試驗(yàn)，每天給藥2次和3次的治療率將大于每天給藥1次的治療率。綜上，牦牛源枯草芽孢桿菌具有治療被大腸埃希氏菌感染的細(xì)菌性腸道疾病的作用。試驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

由組織石蠟切片可看出，大腸埃希氏菌對(duì)動(dòng)物腸道造成了不同程度的破壞，回腸和結(jié)腸組織破壞程度最嚴(yán)重，十二指腸、空腸、盲腸次之，直腸變化不明顯。該試驗(yàn)攻毒是采用腹腔注射的方法，若采用灌服的方法，組織變化是否會(huì)有所不同，還需進(jìn)一步研究探討。

試驗(yàn)組家兔腸道病理變化較對(duì)照組腸道病理變化均大幅改善。對(duì)照組腸道破壞程度較大，微絨毛萎縮，刷狀緣損傷，上皮細(xì)胞排列混亂。具體表現(xiàn)為腸黏膜水腫、萎縮，嚴(yán)重的甚至壞死，細(xì)胞排列紊亂，腸壁脫落明顯，細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)變形。試驗(yàn)組經(jīng)牦牛源枯草芽孢桿菌Yak-KC7治療，絨毛水腫現(xiàn)象、黏膜病理變化明顯減輕，絨毛高度明顯增加，排列更緊湊整齊，上皮細(xì)胞無(wú)脫落現(xiàn)象。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，4株牦牛源枯草芽孢桿菌Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7對(duì)大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌均有良好的抑制作用，Yak-KC7對(duì)大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。動(dòng)物性試驗(yàn)證明，牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)被大腸埃希氏菌（血清型O111）感染的家兔腸道有良好的治療效果，且該菌安全無(wú)毒，不具有耐藥性。綜上，牦牛源枯草芽孢桿菌具有益生作用，有作為益生菌株的潛能，為西藏地區(qū)益生菌種提供了參考。

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