赫彬彬 李婷婷 梅永超 王當(dāng)豐 孫曉佳 劉 楠 勵建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧錦州121013 2 生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室（大連民族大學(xué)） 遼寧大連116600）

微生物是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因之一，其生長代謝過程中能夠分泌胞外酶、嗜鐵素、有色物質(zhì)以及形成生物被膜等致腐因子[1]。研究表明，微生物主要通過群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum sensing，QS）調(diào)控致腐因子的產(chǎn)生，進而發(fā)揮其致腐能力[2]。該系統(tǒng)通過產(chǎn)生并釋放一種被稱為自體誘導(dǎo)物的小分子（Autoinducer，AI），使微生物能夠感知外界生存環(huán)境的變化，并通過啟動特定基因的表達對環(huán)境變化進行反饋，從而維持自身生長[3-4]。微生物腐敗特性的表達不僅受到QS 系統(tǒng)的調(diào)控，也受pH 和營養(yǎng)狀態(tài)等外界環(huán)境因素的影響。如產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌（Escherichia coli） 在pH 3.8 時無法存活，pH 4.1 時可降低志賀毒素產(chǎn)量?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)環(huán)境因素來抑制大腸桿菌毒力因子的表達[5]。

由于微生物適應(yīng)環(huán)境的能力不同，所以食物腐敗的速度和程度也隨著貯藏條件的改變而發(fā)生變化[6]。蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）是兼性厭氧型革蘭氏陰性桿菌，也是肉類和魚類低溫貯藏過程中的腐敗菌，其能形成生物膜以抵抗外界不良環(huán)境的變化，進而維持自身生長[7]。本實驗室前期從腐敗大菱鲆中分離得到一株蜂房哈夫尼亞菌，研究發(fā)現(xiàn)其具有相關(guān)腐敗特性，如生物被膜的形成以及分泌信號分子的能力等特性均依賴于QS系統(tǒng)的調(diào)控，且外源環(huán)境的改變對其生物被膜的形成有一定影響[8]。Wang 等[9]發(fā)現(xiàn)沙門氏菌生物膜調(diào)控基因的表達受培養(yǎng)基的基質(zhì)成分影響，當(dāng)其在實驗室胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中生長7 d 時，其生物膜調(diào)控基因的表達量增加；而當(dāng)在解凍肉湯（MTLB）中生長時，該基因表達受到抑制。由于蜂房哈夫尼亞菌在冷鏈運輸?shù)鹊蜏刭A藏條件下仍可生長，因此，探究不同環(huán)境條件對蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)基因表達的影響尤為重要。

本文以haII/R 系統(tǒng)為研究對象，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探討不同環(huán)境因素條件（碳源、pH、NaCl 濃度、溫度） 對蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)調(diào)控基因haII/haIR（NCBI GenBank：AF503776.1）表達的影響，以期明確QS 基因表達差異與各環(huán)境因素的關(guān)系，進一步研究如何抑制蜂房哈夫尼亞菌等致腐菌的致腐能力，建立靶向控制群體感應(yīng)系統(tǒng)，為水產(chǎn)品保鮮新技術(shù)提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

供試菌蜂房哈尼亞菌從腐敗大菱鲆中分離、鑒定，保藏于渤海大學(xué)水產(chǎn)品貯藏與保鮮實驗室中心。

1.2 主要試劑

LB 肉湯、氯化鈉（分析純），青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、Ezup 柱式細菌基因組總DNA 提取試劑盒、Taq PCR Master Mix （2×，red dye）、DNA Marker，上海生工生物工程有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒，賽默飛世爾科技公司。

1.3 主要儀器

LDZX-50FBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BPS-100CA 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；MS105UD 電子分析天平，梅特勒-托利儀器有限公司；PCR 儀，德國Eppendorf 公司；Ge1Doc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)、CFX ConnectTM熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；Legend Micro21R 臺式微量離心機，美國Thermo 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株活化 將蜂房哈夫尼亞菌過夜活化后，按1∶100 的體積比接種于新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，160 r/min 的條件下，過夜培養(yǎng)12～16 h。

1.4.2 引物設(shè)計 以haII/haIR 為目的基因，以蜂房哈夫尼亞菌的16S rRNA 為內(nèi)參基因，使用Primer 5 軟件設(shè)計出適用于熒光定量PCR 試驗的引物。

1.4.3 引物合成 所設(shè)計出的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，相關(guān)引物序列見表1和表2。

表1 蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因引物序列Table 1 The primers of haII/haIR gene of Hafnia alvei

表2 蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因RT-qPCR 引物序列Table 2 The primers of haII/haIR gene of Hafnia alvei by RT-qPCR

1.4.4 DNA 提取 采用上海生工生物工程有限公司的Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒對細菌總DNA 進行提取，詳細步驟如下：

1） 取1 mL 菌液加入1.5 mL 離心管中，在8 000 r/min 條件下離心1 min，棄去上清，加入180 μL Buffer Digestion 和20 μL Proteinase K，振蕩后于56 ℃水浴1 h。

2） 向菌體中加入200 μL Buffer BD 后充分顛倒混勻，如有沉淀，可于70 ℃水浴10 min。

3） 加入200 μL 無水乙醇后充分顛倒。

4） 將吸附柱放入收集管中，將上步所得溶液及半透明懸浮物加入吸附柱中靜置2 min，在12 000 r/min 條件下離心1 min，棄去收集管中廢液。

5） 將吸附柱重新放回收集管中，加入500 μL 已加入異丙醇的PW Solution，在10 000 r/min條件下離心30 s，棄去濾液。

6） 加入500 μL 已加入無水乙醇的Wash Solution 于吸附柱中，在10 000 r/min 條件下離心30 s，棄去濾液。

7） 將吸附柱重新放回收集管中，在12 000 r/min 條件下離心2 min，除去殘留的Wash Solution。

8） 取出吸附柱置于新的1.5 mL 離心管中，加入100 μL CE Buffer 靜置3 min 后于12 000 r/min 下離心2 min。收集DNA 溶液于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 引物適用性檢測 將不同生長環(huán)境下的蜂房哈夫尼亞菌按上述方法提取DNA，并以50 μL PCR 體系進行擴增。體系添加試劑量為：

Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA 模板1 μL，Sterilizer ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸95 s，共30 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將擴增成功的PCR 產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳成像檢測，記錄結(jié)果。

1.4.6 RNA 提取及質(zhì)量檢測

1） 將過夜活化后的蜂房哈夫尼亞菌在10 000 r/min 條件下離心2 min 收集菌體。加入1 mL Trizol 混勻，將混合物室溫放置5 min，以便樣本被Trizol 充分裂解。

2） 每1 mL Trizol 裂解的樣本加入200 μL氯仿，劇烈搖晃20 s 后于室溫靜置3 min，在4℃、12 000×g 條件下離心15 min。

3） 離心后，將最上層的無色液體（約總體積50%左右）移至一個新的無RNA 酶的EP 管中。

4） 向上述液體中加入500 μL 異丙醇，于室溫靜置10 min，并在4 ℃下12 000×g 條件下離心10 min。

5） 吸去上清液，加入由DEPC 水配制的75%乙醇，上下顛倒混勻，于4 ℃、7 500×g 條件下離心5 min。

6） 除去乙醇后，開蓋于室溫放置5～10 min，即得到純化的RNA。

7） 將所得RNA 用DEPC 水溶解，采用瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量。

1.4.7 cDNA 合成 將上步提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，詳細步驟如下：

第1 步反轉(zhuǎn)錄體系為：RNA template 1 ng；oligo （dT）18 Primers 2 μL；RNase-free Water 9 μL；反應(yīng)條件：65 ℃5 min；4 ℃2 min；4 ℃∞。

第2 步反轉(zhuǎn)錄體系為：上步RNA 變性溶液12 μL；5X Reaction Buffer 4 μL；RiboLock RNA酶抑制劑（20 u/μL） 1 μL；10 mmol/L dNTP Mix 2 μL；RevertAid M-MuLV（200 u/μL）1 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min；4 ℃ 2 min；4 ℃ ∞。

1.4.8 熒光定量PCR 將不同環(huán)境下培養(yǎng)獲得的cDNA 溶液稀釋，按照以下反應(yīng)體系進行熒光定量PCR 擴增，建立熔解曲線，所得數(shù)據(jù)跟據(jù)方程2-△△Ct計算并分析基因表達量的差異。

反應(yīng)體系（共計20 μL）：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL；Sterilizer ddH2O 4 μL；F primer 0.5 μL；R primer 0.5 μL；cDNA 5 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃3 min，95 ℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，75 ℃停留5 s 收集熒光信號，反應(yīng)共進行40 個循環(huán)，并在65～95 ℃范圍內(nèi)建立熔解曲線。

表達量計算方程：△Ct （樣品）=Ct （樣品）-Ct（樣品中內(nèi)參）

△Ct（空白）=Ct（空白）-Ct（空白中內(nèi)參）

△△Ct=△Ct（樣品）-△Ct（空白）

目的基因相對表達量=2-△△Ct

1.5 不同環(huán)境對蜂房哈夫尼亞菌haI/R 系統(tǒng)表達的影響

1.5.1 不同碳源對蜂房哈夫尼亞菌haI/R 系統(tǒng)表達的影響 根據(jù)Zimmer 等[10]方法配制AB 培養(yǎng)基，所含成分為：3 g/L K2HPO4，1 g/L NH4Cl，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.15 g/L KCl，1 g/L NaH2PO4，0.01 g/L CaCl2，0.0025 g/L FeSO4·7H2O，酪蛋白水解氨基酸5 g/L，碳源5 g/L（碳源：葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、乳糖和麥芽糖）。將過夜培養(yǎng)后的蜂房哈夫尼亞菌按1∶1 000 體積比接種于不同碳源的AB 培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)至OD595為1.0 左右。以LB 液體培養(yǎng)基為空白對照組，按照1.4 節(jié)的方法測定不同樣品中haII/haIR基因的表達量。

1.5.2 不同氯化鈉質(zhì)量濃度對蜂房哈夫尼亞菌haI/R 系統(tǒng)表達的影響 將過夜培養(yǎng)后的蜂房哈夫尼亞菌按1∶1 000 體積比接種于不同NaCl 質(zhì)量濃度（5，10，20，30，40，50 mg/mL）的新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)至OD595為1.0 左右，按1.4 節(jié)的方法測定不同樣品中haII/haIR 基因的表達量。

1.5.3 不同pH 對蜂房哈夫尼亞菌haI/R 系統(tǒng)表達的影響 將過夜培養(yǎng)后的蜂房哈夫尼亞菌按1∶1 000 體積比接種于不同pH（5，6，7，8，9）的新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min 的條件下培養(yǎng)至OD595為1.0 左右，按1.4 節(jié)的方法測定不同樣品中haII/haIR 基因的表達量。

1.5.4 不同溫度對對蜂房哈夫尼亞菌haI/R 系統(tǒng)表達的影響 將過夜培養(yǎng)的蜂房哈夫尼亞菌按1∶1 000 體積比接種于LB 液體培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度條件（4，15，28，37 ℃）下，160 r/min 培養(yǎng)至OD595為1.0 左右，然后按照1.4 節(jié)的方法測定不同樣品中haII/haIR 基因的表達量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件及Origin 8.5 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)haII/haIR 基因的驗證

根據(jù)haII/haIR 基因序列設(shè)計特異性引物，按上述步驟提取DNA，采用普通PCR 擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗并通過凝膠成像儀觀察擴增效果。將擴增成功的PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI上GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的己有序列進行BLAST 比對分析。圖1為haII/haIR 基因1%瓊脂糖凝膠電泳圖。從圖中可以看出能夠擴增出預(yù)期大小的片段，且條帶單一，無引物二聚體出現(xiàn)。經(jīng)NCBI BLAST 比對后，相似結(jié)果高達99%以上，表明擴增產(chǎn)物與目的序列的一致性高。

圖1 蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因特異性引物PCR 擴增電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of Hafnia alvei haII/haIR genes amplification on products for ordinary PCR

2.2 熒光定量PCR 引物檢測

2.2.1 引物特異性檢測 以提取到的DNA 為模板，使用所設(shè)計的引物進行普通PCR 擴增，產(chǎn)物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖如圖2所示。結(jié)果表明：所設(shè)計的引物擴增出預(yù)期大小的片段，條帶單一、明亮，并且無引物二聚體，說明引物特異性良好，可用于后續(xù)試驗。

圖2 蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因熒光定量引物PCR 擴增電泳圖Fig.2 Agarose electrophoresis of Hafnia alvei genes amplification on products for qPCR

2.2.2 熒光定量PCR 擴增曲線及引物特異性分析 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，使用所設(shè)計的引物進行熒光定量PCR，建立的熔解曲線如圖3所示。在熒光定量PCR 試驗中，SYBR Green 熒光染料是一種能與雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA 結(jié)合的染料，隨著PCR 產(chǎn)物的增加熒光值同步增加，熒光染料也有可能與非螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而影響試驗結(jié)果[11]，因此需要分析熔解曲線來確定引物的特異性。由圖可知，各目的基因?qū)?yīng)的溶解曲線只有一種特異性峰，說明目的基因擴增時并沒有產(chǎn)生非特異性條帶及引物二聚體，由此證明引物具有良好的特異性，試驗結(jié)果真實可靠。

2.3 不同環(huán)境件對蜂房哈夫尼亞菌halI/R 系統(tǒng)表達情況的影響

2.3.1 不同碳源對蜂房哈夫尼亞菌halI/R 系統(tǒng)表達情況的影響 碳源對于微生物的生長代謝具有重要的意義，其主要為細胞生命活動提供所需的能量。常用的碳源主要有糖類、油脂、有機酸和小分子醇等[12]。本文研究了添加不同碳源（糖類）對蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)haII/haIR 基因表達量的影響。從圖4中可以看出，相較于其它碳源而言，木糖的添加使haII/haIR 相對表達量達到最高，分別為128.5%和223.8%；而蔗糖的添加抑制了haII/haIR 基因相對表達量。對于haII 基因，當(dāng)碳源為蔗糖時，該基因表達量最少，僅為17.4%，對于其它碳源的利用程度依次為：木糖＞果糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞蔗糖；當(dāng)碳源為麥芽糖時，haIR 基因表達量僅有22.4%，對于其它碳源的利用程度依次為：木糖＞果糖＞蔗糖＞葡萄糖＞乳糖＞麥芽糖。本實驗室前期曾探究不同碳源對蜂房哈夫尼亞菌生物膜的影響，較其它碳源而言，木糖的添加能夠顯著促使其生物膜形成。因此，本文的研究與之前的研究結(jié)果呈一致性[13]。

圖3 蜂房哈夫尼亞菌基因熒光定量PCR 熔解曲線Fig.3 The melting curves of real-time PCR for gnens of Hafnia alvei

2.3.2 不同氯化鈉質(zhì)量濃度對蜂房哈夫尼亞菌halI/R 系統(tǒng)表達情況的影響 滲透壓對微生物的生長有較大影響。當(dāng)環(huán)境中氯化鈉質(zhì)量濃度較高時，對細菌生長造成較大的環(huán)境壓力[14]。本文通過向LB 肉湯中添加氯化鈉，使其最終質(zhì)量濃度為5，10，20，30，40 mg/mL 和50 mg/mL，其 中 以10 mg/mL 氯化鈉添加量為對照組，探究不同氯化鈉質(zhì)量濃度對蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因表達量的影響。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)培養(yǎng)過程中氯化鈉質(zhì)量濃度為5～10 mg/mL 時，haII/haIR 基因呈上升趨勢；而當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度在20～50 mg/mL 時，haII/haIR 基因表達情況均受到抑制；當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度為30 mg/mL 時，其haII/haIR 基因表達量僅分別為10 mg/mL 氯化鈉培養(yǎng)條件的37.1%和30.9%；而采用質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的氯化鈉培養(yǎng)時，haII 基因和haIR 基因表達量卻均高于質(zhì)量濃度為40 mg/mL 的氯化鈉培養(yǎng)組，這可能由于蜂房哈夫尼亞菌受到高滲環(huán)境脅迫，該菌自身群體感應(yīng)系統(tǒng)增強所導(dǎo)致的?？孜髀黐15]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境脅迫會顯著刺激蜂房哈夫尼亞菌AHLs 的分泌，以維護自身QS 系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

圖4 不同碳源對蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因相對表達量的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on haII/haIR gene expression in Hafnia alvei

圖5 不同氯化鈉質(zhì)量濃度對蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因相對表達量的影響Fig.5 Effect of different NaCl mass concentrations on haII/haIR gene expression in Hafnia alvei

圖6 不同pH 對蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因相對表達量的影響Fig.6 Effect of different pH on haII/haIR gene expression in Hafnia alvei

2.3.3 不同pH 對蜂房哈夫尼亞菌halI/R 系統(tǒng)表達情況的影響 pH 在微生物的生長代謝過程中占據(jù)重要地位。pH 可引起細胞膜電荷變化，導(dǎo)致微生物細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力發(fā)生變化，不同pH 條件在一定程度上反應(yīng)微生物適應(yīng)環(huán)境的能力[16]。本文以pH 5.0～9.0 的新鮮LB 肉湯培養(yǎng)蜂房哈夫尼亞菌，探究當(dāng)外源環(huán)境pH 改變時，haII/haIR 基因的表達情況。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)培養(yǎng)條件pH 值為5 時，haII 基因表達量達到pH 值為7 培養(yǎng)條件的61.8%；而在培養(yǎng)條件pH 值為9時，該基因表達量僅為pH 值為7 時的24.0%；haIR 基因表達情況與haII 基因相似。因此，就總體而言，與對照組相比（pH 值為7.0），酸性條件對蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因表達量影響較小；而堿性條件下蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因表達量則受到明顯的抑制。研究表明：產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens） 毒力因子的表達量受群體感應(yīng)系統(tǒng)而下調(diào)，其主要是由酸性代謝物和酸性環(huán)境所介導(dǎo)。因此，可在該菌感染部位如傷口、腸道及食物中施加pH 控制抑制其毒力因子的表達[17]。這與本文研究不一致，可能由于不同類型微生物之間對酸堿條件敏感度不同所致。

圖7 不同溫度對蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因相對表達量的影響Fig.7 Effect of different temperature on haII/haIR gene expression in Hafnia alvei

2.3.4 不同溫度對蜂房哈夫尼亞菌halI/R 系統(tǒng)表達情況的影響 圖7為不同溫度培養(yǎng)條件下蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因的表達情況。結(jié)果表明，haII/haIR 基因均能在冷藏條件下（4 ℃）表達，為對照組（28 ℃）表達量的67.9%和60.9%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為15 ℃時，haII/haIR 基因表達量最大；而當(dāng)溫度升至最適溫度（37 ℃）以上時基因表達量有所下降。此外，溫度的變化也會引起細菌生物膜形成能力和毒力因子表達量的變化[18-20]。由于海產(chǎn)品易受細菌污染形成生物被膜，且難以清除，因此極易造成海產(chǎn)品腐敗及安全性風(fēng)險。研究表明：低溫（4～15 ℃） 會降低副溶血弧菌生物膜的形成能力，而37 ℃時，該菌生物膜形成減少[21]，這與本試驗結(jié)果相似。因此在水產(chǎn)品冷鏈運輸過程中，可通過調(diào)節(jié)溫度抑制蜂房哈夫尼亞菌致腐因子的表達。

3 結(jié)論

本文探究了不同環(huán)境因素下，蜂房哈夫尼亞菌haII/haIR 基因的表達情況。結(jié)果表明：當(dāng)細菌處于不利環(huán)境時，可通過影響其QS 系統(tǒng)進而調(diào)控其生物學(xué)行為及功能。在不同碳源培養(yǎng)條件下，蜂房哈夫尼亞菌haII 基因表達情況依次為：木糖＞果糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞蔗糖；haIR 基因表達情況為：木糖＞果糖＞蔗糖＞葡萄糖＞乳糖＞麥芽糖。當(dāng)細菌處于高滲透壓脅迫時，haII/haIR 基因表達量均有所下降。并且在堿性條件下，haII/haIR 基因表達量也受到抑制。低溫培養(yǎng)條件（15 ℃）haII/haIR基因表達量明顯上升；而超過其最適溫度后（28℃）表達量有所下降。本文通過明晰環(huán)境因素對蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)相關(guān)基因haII/haIR 表達的作用，為以后研究環(huán)境因素對群體感應(yīng)調(diào)控的致腐性提供一定的理論基礎(chǔ)。