饒平凡 陳 漢 周河美 陳瑞琛 駱梅香 陳 琦 許明明 郭靜科 柯李晶*

（1 中國科學院上海生命科學研究院-浙江工商大學食品營養(yǎng)科學聯(lián)合研究中心 杭州 310035 2 福州大學生物工程研究所 福州350002 3 廈門元尊生物工程有限公司 福建廈門361026 4 泉州師范學院海洋與食品學院 福建泉州362000 5 福州大學至誠學院食品與生物工程系 福州350002）

蛹蟲草 （Cordyceps militaris） 又稱北冬蟲夏草，屬子囊菌門、麥角菌科、蟲草屬，具有補肺益腎[1]，抗衰老，增強免疫，促進代謝的作用，有很高的食用價值[2]。蛹蟲草含有多糖、蟲草酸、氨基酸、蟲草素、超氧化物歧化酶等生物活性物質(zhì)，而這些物質(zhì)都有很好的抗氧化性[3-4]。研究表明，蛹蟲草能提高老齡大鼠SOD、GSH-Px 活性，明顯降低LPO含量，其抗衰老能力優(yōu)于VE[5]。對神經(jīng)性中毒的PC12 細胞能通過降低線粒體中的細胞色素c、細胞MDA 含量和胞內(nèi)自由基水平，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px 活性，起到保護作用[6]。蛹蟲草的諸多功效可能與其抗氧化活性有關(guān)。此外，常用的蛹蟲草烹飪方式為煲湯，而加熱會對抗氧化活力有破壞作用，因此蛹蟲草的熱穩(wěn)定性值得研究。

食物對人體臟腑、經(jīng)絡(luò)的選擇，即通常所說的“歸經(jīng)”。因食物不同，歸經(jīng)也不同[7]。飲食對于人體正常生命活動必不可少[8]，食物性味歸經(jīng)很難用一種簡便而且客觀的方式加以定量，在前期研究過程中，發(fā)現(xiàn)人體的經(jīng)絡(luò)電壓變化和抗氧化密切相關(guān)[9]，因此采用監(jiān)測經(jīng)絡(luò)電壓的方法，客觀評價多種食品的攝入對人體不同經(jīng)絡(luò)的影響[10]。生物體的自由基分布與經(jīng)絡(luò)重合[11]，可以通過對特定經(jīng)絡(luò)進行抗氧化治療以達到降低單純性肥胖患者的體重[12-13]和改善過敏性鼻炎癥狀[14]的效果。在此基礎(chǔ)上，應用經(jīng)絡(luò)電壓監(jiān)測方法探究蛹蟲草的歸經(jīng)特質(zhì)，從食品角度探討人體經(jīng)絡(luò)電壓檢測方法監(jiān)測氧化應激狀態(tài)的可能性。同時，對蛹蟲草進行體外總抗氧化力檢測和SOD 活力檢測分析，多角度對比分析蛹蟲草的抗氧化性對機體氧化應激處理系統(tǒng)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 蛹蟲草 蛹蟲草片，廈門元尊生物工程有限公司。由高蟲草素蟲草菌株 （菌種保藏編號：FY1421）經(jīng)培養(yǎng)、烘干、超微粉碎、滅菌、壓片、包裝制成，其有效成分蟲草素含量為6 000 μg/g。

1.1.2 SOD SOD，福州大學生物工程研究所。將構(gòu)建好的含有TAT-SOD 基因的高表達克隆接種于100 mL 含50 μg/mL Amp 的LB 培養(yǎng)基中，37℃搖培過夜；菌液按2%接種量接種于1 000 mL新鮮的LB 培養(yǎng)基中（含50 μg/mL Amp），37 ℃搖培到OD600=0.6～0.8，加入IPTG 至終濃度為250 μmol/L，CuSO4500 μmol/L，ZnSO4100 μmol/L，25℃振搖誘導培養(yǎng)6 h；菌液5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用100 mL PBS 重懸，冰浴中超聲破碎30 min，12 000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 膜過濾備用。上清液經(jīng)過GST 融合蛋白親和色譜柱提純獲得SOD 蛋白。所獲得SOD蛋白比活力＞50 000 U/g[15]。

1.1.3 樣品的制備 原樣：準確稱取蛹蟲草片、SOD 含片，分別用pH 7.2 的磷酸緩沖液以料液比1∶30 進行溶解，再用37 ℃，800 r/min 水浴恒溫攪拌器浸提1 h，完成后，將混合液超聲20 min，放置4 ℃冰箱，靜置過夜24 h，用離心機以25 ℃，5 000 r/min，離心15 min，取上清液，作為待測樣品。

煮沸4 h 的樣液：100 ℃水浴4 h，冷卻至室溫，用離心機以25 ℃，5 000 r/min，離心15 min，取上清液，作為待測樣品。

1.1.4 主要試劑和儀器 SOD 試劑盒 （T-SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建成生物工程研究所。Ag/AgCl 一次性使用心電電極，上海鈞康醫(yī)用設(shè)備有限公司。多通道生理信號采集處理系統(tǒng)（RM6240C），成都儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的抗氧化活性檢測 樣品的總SOD活力與總抗氧化能力（T-AOC）通過相應試劑盒測定。

1.2.2 實驗對象 20 名健康志愿者在知情同意后進行實驗。參加實驗的受試者需要符合以下要求：1）年齡：20-30 歲；2）既往無腎、肝、心血管疾病或者其它嚴重器質(zhì)性疾?。?）無飲酒、抽煙、濫用毒品等不良嗜好；4） 有規(guī)律性作息時間（晚上12 點前入睡）；5）沒有長期的藥物治療；6）在實驗前一個月內(nèi)，沒有經(jīng)歷過針灸、按摩等穴位干擾行為。這個研究獲得中國科學院上海生命科學研究院-浙江工商大學食品營養(yǎng)科學聯(lián)合研究中心倫理委員會認可。

1.2.3 實驗分組 志愿者經(jīng)招募后，隨機分為2組，每組10 人，分別服用蛹蟲草片和SOD 蛹蟲草片。

1.2.4 實驗方案 選擇肺經(jīng)、腎經(jīng)、肝經(jīng)和脾經(jīng)的合穴和原穴（表1）作為經(jīng)絡(luò)電壓的測量點，分別以合穴為正極，原穴為負極。所有實驗對象在第0天進行經(jīng)絡(luò)電壓的測量，后開始分別服用蛹蟲草片（1 g）和SOD 蛹蟲草片（SOD 1 g，蛹蟲草片1 g），持續(xù)服用14 d，第14 天再測量經(jīng)絡(luò)電壓。測量前實驗對象需仰臥在床上并保持清醒狀態(tài)，然后讓其深呼吸安靜下來。穴位的選擇和確定參照GB/T12346[16]，將測量穴位點附近毛發(fā)修剪，用醫(yī)用酒精進行擦拭，等其揮發(fā)后，按標準尋找出穴位。使用Ag/AgCl 一次性心電電極貼粘貼穴位處，連接電極和數(shù)據(jù)采集表，開始采集數(shù)據(jù)。

表1 經(jīng)絡(luò)電壓的測量點Table 1 The selected acupuncture points

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS for windows 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，測定樣本結(jié)果以平均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗或秩和檢驗。P＜0.05 表示結(jié)果差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草和SOD 的抗氧化活性檢測結(jié)果

蛹蟲草片和SOD 含片的SOD 活力分別達到2 413 U/g 和2 706 U/g（圖1a），說明蛹蟲草的SOD含量非常豐富，其SOD 活力與SOD 含片相當，與文獻[17-18]報道結(jié)果相接近，能達到清除超氧自由基的功效。

煮沸4 h 后，蛹蟲草片的SOD 活力為1 760 U/g，損失了37%，而SOD 含片的SOD 活力僅剩下85 U/g，損失了97%，意味著蛹蟲草的SOD 活力能夠抵抗加熱過程中的破壞作用。有研究表明，絲狀真菌的Cu，Zn-SOD 具有潛在的額外修飾基團和多聚體，對熱穩(wěn)定性較高[19]，在酸堿度為7～8 范圍內(nèi)SOD 的酶活性比較穩(wěn)定[20-21]，而Cu，Zn-SOD 是蛹蟲草體內(nèi)的主要SOD，占90%以上[18，22]。SOD 含片的體系相對單一，在煮沸過程中可能沒有額外修飾基團和多聚體對SOD 進行保護，導致大量SOD 酶失活，是SOD 含片的SOD 活力下降的原因之一。

蛹蟲草片和SOD 含片的總抗氧化能力達到2 141 U/g 和187 U/g（圖1b），蛹蟲草的總抗氧化能力遠超于SOD 含片，而SOD 活力卻相當，這是因為所測總抗氧化能力是通過將Fe3+還原成Fe2+，不局限于針對超氧自由基。蛹蟲草體系復雜，除含有SOD 酶外，還含有多種抗氧化物質(zhì)，如：多糖、蟲草酸、氨基酸、蟲草素等[4]。而SOD 含片只有SOD 酶具有抗氧化能力，只針對溶液中少量的自由基，SOD 酶活測定針對的是SOD 酶和黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生的大量超氧陰離子自由基發(fā)生反應，這也是導致SOD 含片抗氧化能力遠低于其SOD 活力的原因。

煮沸4 h 后，蛹蟲草片和SOD 含片的總抗氧化能力分別為1 588 U/g 和17 U/g，分別減少了35%和91%。表明蛹蟲草的抗氧化能力熱穩(wěn)定性好。

圖1 蛹蟲草片與SOD 含片的抗氧化活性檢測結(jié)果Fig.1 The anti-oxidative capacity of Cordyceps militaris and SOD

2.2 蛹蟲草對經(jīng)絡(luò)電壓的影響

通過比較腎經(jīng)、肺經(jīng)、脾經(jīng)和肝經(jīng)的經(jīng)絡(luò)電壓檢測結(jié)果（圖2），相對于肺經(jīng)、脾經(jīng)和肝經(jīng)（圖2b，2c），服用蛹蟲草片和SOD 蛹蟲草片主要體現(xiàn)在能顯著降低腎經(jīng)的電壓（圖2a）。這意味著長期服用蛹蟲草可以減輕腎臟的氧化應激水平。SOD 蛹蟲草片組的志愿者每日服的1 g 蛹蟲草和1 g SOD 片，所提供的SOD 活力為5 119 U，總抗氧化活力為2 328 U，是蛹蟲草片組每日服用1 g 蛹蟲草提供的SOD 活力的2.1 倍，總抗氧化力的1.1倍，14 d 后SOD 蛹蟲草片組的志愿者的腎經(jīng)電壓降低15 mV，也是蛹蟲草片組的2 倍。這意味著一方面，腎經(jīng)電壓降低的幅度與每日所服的SOD 活力相關(guān)，另一方面，SOD 與蛹蟲草混合服用，能夠進一步加強這樣的作用。

陳育等[23]通過對腺嘌呤致腎陽虛證小鼠影響的實驗研究，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草對腺嘌呤致腎陽虛小鼠有一定的防治作用。李冰等[1]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草對糖尿病大鼠腎臟病程發(fā)展有抑制作用。楊延存等[24]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草能顯著防止糖尿病腎病大鼠腎小球肥大，降低mAlb 與NAG 排泄率，降低腎小管內(nèi)溶酶體數(shù)量，減輕腎小管的腫脹程度，保護腎小管刷狀緣結(jié)構(gòu)。氧化應激對腎臟具有非常關(guān)鍵的影響作用[25]，經(jīng)絡(luò)電壓的測試結(jié)果與以上描述吻合。

人體經(jīng)絡(luò)的物質(zhì)基礎(chǔ)是結(jié)締組織[26]，連帶其中的血管、神經(jīng)叢和淋巴管等交織而成的復雜體系。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織被認為是有可能成為一種尚未確認的新的系統(tǒng)[27]。穴位上的結(jié)締組織含有豐富的成纖維細胞、巨噬細胞、肥大細胞、漿細胞、脂肪細胞、白細胞和未分化的間充質(zhì)細胞[28]，且具有高電導，低電阻，傳導速度快，特異性強的特點。穴位和經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)包含了關(guān)于生物體真實狀態(tài)的大量信息。

圖2 蛹蟲草片與SOD 蛹蟲草片對人體腎經(jīng)（a）、肺經(jīng)（b）、脾經(jīng)（c）和肝經(jīng)（d）經(jīng)絡(luò)電壓的影響Fig.2 The effects on electric potential difference of kidney （a），lung （b），spleen （c） and liver （d） meridian by Cordyceps militaris and SOD

3 結(jié)論

蛹蟲草的SOD 活力和抗氧化能力很強，且耐高溫、性質(zhì)穩(wěn)定。受試者服用蛹蟲草片和SOD 蛹蟲草片主要體現(xiàn)在對腎經(jīng)的影響，減少腎經(jīng)的氧化應激水平，這與已報道的蛹蟲草的功效描述基本吻合。以上結(jié)果進一步說明通過測量經(jīng)絡(luò)穴位電壓能在一定程度上反映蛹蟲草對人體的作用，測量經(jīng)絡(luò)電壓能夠作為一種新的安全、快速、無創(chuàng)傷的手段，客觀評價食品對人體的功效作用，為評價食品功效和新食品的開發(fā)提供一個全新視角，揭示了食品除提供營養(yǎng)和能量外，還具有調(diào)節(jié)人體氧化應激處理體系的作用。