呼鑫榮 饒 歡 熊海寬 薛文通*

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 2 永仁野森達(dá)菌業(yè)有限公司 云南永仁651400）

松露是目前世界上最貴的食用菌菇之一，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。松露獨(dú)特的土腥風(fēng)味和口感質(zhì)地[1]，使其廣受消費(fèi)者的歡迎。除風(fēng)味獨(dú)特外，松露還具有良好的營養(yǎng)價(jià)值和生物活性。松露富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等元素[1]，含有8 種人體必需氨基酸，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)良好的植物來源。研究表明，松露具有抗氧化性、抗腫瘤、抗炎、保肝護(hù)肝等多種生理活性[3]。人體內(nèi)時(shí)刻都在發(fā)生氧化-還原反應(yīng)，有氧呼吸過程中大約5%的氧會轉(zhuǎn)化成活性氧和自由基[4]，細(xì)胞在新陳代謝過程中也會產(chǎn)生一系列的活性氧[5]，而過量自由基造成的氧化損傷是腫瘤、衰老等多種退行性疾病的主要原因之一[6]。人們開始越來越多地關(guān)注具有良好抗氧化活性的天然產(chǎn)物，而松露就是一種含有多種抗氧化物質(zhì)的健康食材。研究發(fā)現(xiàn)，松露中的PST-W 多糖對DPPH 的清除率高達(dá)90.2%，對過氧化氫（300 mmol/L） 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷也有良好的抑制力，且多糖純化程度越高，抗氧化能力就越強(qiáng)[7]。本研究對松露不同極性提取物進(jìn)行抗氧化能力檢測，篩選出抗氧化性最強(qiáng)的部位，對其進(jìn)行秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化測試，全面評價(jià)松露的抗氧化生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮松露（Tuber indicum），云南永仁縣；秀麗隱桿線蟲（C.elegans Bristol N2），中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張雅麗教授實(shí)驗(yàn)室贈予；大腸桿菌（E.coli）OP50，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張雅麗教授實(shí)驗(yàn)室贈予。

石油醚、乙酸乙酯、甲醇（分析純級），北京化工廠；鐵氰化鉀（分析純級），國藥集團(tuán)；福林酚（分析純級），索萊寶公司；膽固醇、酵母粉、蛋白胨（生物級），拜爾迪公司；5-氟-2，脫氧尿嘧啶（FUDR）、分子探針（生物級），Sigma-Aldrich 公司（中國）。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10 冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；SHB-III 循環(huán)水式真空泵，北京神泰偉業(yè)儀器公司；1650E 紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器公司；體式顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器公司；手提高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；全溫生化培養(yǎng)箱，上海培因儀器公司；熒光酶標(biāo)儀，Bio Tech 公司（中國）。

1.3 松露不同極性提取物的制備

將新鮮松露切片，冷凍干燥粉碎成末，過40目篩。分別稱取松露30 g，各加入300 mL 石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水，冷凝回流分別提取2 h，取濾液，濾渣同上述方法再提取1 遍，合并提取液，旋蒸并干燥，分別獲得石油醚提取物（PF）、乙酸乙酯提取物（EAF）、甲醇提取物（MF）、水提?。╓F），4℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.4 松露不同極性部位體外抗氧評價(jià)

將上述松露不同極性提取物分別配成質(zhì)量濃度為：5，10，20，30 g/L 的稀釋液，做體外抗氧化測試。

1.4.1 羥基自由基清除能力測定 羥基自由基清除能力測定參照Zhao 等[9]的方法稍作修改。取20 mmol/L 水楊酸鈉0.3 mL 和1.5 mmol/L 的硫酸亞鐵1.0 mL 于各試管中，分別加入不同濃度的樣品提取液1.0 mL，加入6 mmol/L 的H2O20.7 mL，迅速混勻，37 ℃恒溫水浴1 h，于510 nm 波長下測定其OD 值。以無水乙醇為空白對照，VC 為陽性對照。

1.4.2 鐵離子鰲合能力測定 參照Decker 等[10]的方法檢測松露提取物鐵離子螯合能力。鐵離子螯合率按式（1）計(jì)算。

I（%）=[A0-（Ai-Aj）]×100/A0

式中，I——樣品吸光率；A0——空白組吸光度；Ai——樣品組吸光度；Aj——對照組吸光度。

1.4.3 松露總還原能力測定 分別取0.5 mL 不同樣品，加入0.2 mol/L pH 6.6 磷酸鹽緩沖溶液

2.5 mL，1%鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]溶液2.5 mL，混勻，50 ℃保溫20 min，加入10%TCA 溶液2.5 mL，振蕩混勻后離心10 min。取上清液2.5 mL，加蒸餾水2 mL 和0.1%FeCl3溶液0.5 mL。靜置10 min，以等量去離子水調(diào)零，700 nm 波長處比色。以蒸餾水為陰性對照，以VC 為陽性對照[11]。

1.5 松露對秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化評價(jià)

將松露不同極性提取物分別配成質(zhì)量濃度為0，10，50，100 μg/mL 的稀釋液，做體外抗氧化測試。

1.5.1 秀麗線蟲壽命測定 將生長至L2 期的同期化秀麗線蟲挑至含0，10，50，100 μg/mL 松露水提物的OP50 mNGM 培養(yǎng)板中，記為第1 天，此后每天在相同時(shí)間將存活的線蟲轉(zhuǎn)移至新平板中，記錄每天存活的線蟲數(shù)，直至全部線蟲死亡。線蟲的死亡標(biāo)準(zhǔn)為鉑金鏟觸碰線蟲無任何反應(yīng)，丟失和爬到培養(yǎng)基壁上干死的線蟲應(yīng)從統(tǒng)計(jì)中剔除。試驗(yàn)中每組秀麗線蟲不少于30 條，設(shè)置3 組重復(fù)。

1.5.2 秀麗線蟲產(chǎn)卵量測定 挑取生長至L4 期的同期化的線蟲，分別至含有不同濃度松露水提物的OP50 NGM 板中培養(yǎng)，每個(gè)板只放一條線蟲單獨(dú)培養(yǎng)。每天在相同時(shí)間把線蟲挑至新培養(yǎng)基上，舊培養(yǎng)板在標(biāo)準(zhǔn)條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后清點(diǎn)產(chǎn)卵量，直到線蟲不再產(chǎn)卵，計(jì)算該線蟲的產(chǎn)卵總量，即為其一生產(chǎn)卵數(shù)。每組15 條線蟲，重復(fù)3次。

1.5.3 秀麗線蟲急性應(yīng)激能力測試 秀麗線蟲急性壓力應(yīng)激測試參照Wilson 等[12]的方法，在壓力應(yīng)激試驗(yàn)中，將同期化蟲卵在含不同濃度松露水提物的OP50 NGM 培養(yǎng)板中培養(yǎng)至成蟲，將成蟲暴露于不同的壓力環(huán)境下，研究松露水提物對線蟲壓力應(yīng)激的保護(hù)作用。每組試驗(yàn)秀麗線蟲不少于30 條，重復(fù)3 次。

1） 秀麗線蟲急性熱應(yīng)激 秀麗線蟲急性熱應(yīng)激試驗(yàn)方法參照趙江等[13]的方法，稍作修改。將不同濃度藥物處理的秀麗線蟲和對照組線蟲培養(yǎng)板置于35 ℃恒溫恒濕箱中，每隔1 h 記錄線蟲的死亡數(shù)、剔除數(shù)，直至線蟲全部死亡。

2） 秀麗線蟲急性氧化應(yīng)激 秀麗線蟲急性氧化應(yīng)激試驗(yàn)以H2O2為氧化劑，參照于周龍[14]的方法，稍作修改。將同期化的成蟲置于含有4 mmol/L H2O2的M9 溶液的培養(yǎng)皿中，每隔1 h 記錄線蟲的死亡數(shù)、剔除數(shù)，直至線蟲全部死亡。

1.5.4 秀麗線蟲體內(nèi)活性氧的測定 采用H2DCFDA 分子探針測定秀麗線蟲體內(nèi)的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[15]。同期化的線蟲在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)至成蟲。在含有不同濃度松露水提物的培養(yǎng)板上培養(yǎng)48 h，用M9 緩沖液將線蟲沖洗到黑色96 孔板中，每孔50 μL，并加入50 μL 分子探針，使分子探針的終濃度為50 μmmol/L。20 ℃溫浴30 min，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm條件下檢測熒光強(qiáng)度，每隔30 min 檢測1 次，檢測2 h。檢測完成后測定線蟲蛋白濃度，計(jì)算ROS含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用單向方差分析（ANOVA）和鄧肯氏法（Duncan’s）對數(shù)據(jù)在0.05 水平上檢驗(yàn)顯著性差異。用Origin 8 作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 松露提取物的體外抗氧化能力

2.1.1 松露提取物羥基自由基清除能力 松露不同極性提取物的羥基清除曲線如圖1所示。

當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為1 g/L 時(shí)，WF 和MF 的清除率接近50%，而EAF 和PF 的清除率約為35%；在質(zhì)量濃度達(dá)到5 g/L 之前，WF 和MF 的清除曲線接近重合，說明在這一質(zhì)量濃度區(qū)間，二者的羥自由基清除效果接近；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L 時(shí)，WF 的清除率已經(jīng)接近90%，并趨于穩(wěn)定，而MF、EAF、PF 的清除率還較低；當(dāng)質(zhì)量濃度為30 g/L 時(shí)，MF、PF、EAF 的清除率分別達(dá)到最大值95.81%，75.76%，82.11%，而WF 的清除率可高達(dá)98.61%，清除效果與質(zhì)量濃度為5 g/L 的VC 接近。以上清除曲線說明松露不同極性提取物均具有良好的羥基清除效果。李波等[16]對云南7 種其它食用菌進(jìn)行羥自由基清除研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一濃度下，草菇、黑虎掌、竹蓀等多種食用菌均具有一定的羥基自由基的清除效果，然而清除效果較差，最高清除率均低于50%。而松露WF 的羥基清除率最高可達(dá)98.61%，說明松露具有良好的羥自由基清除能力。

2.1.2 松露提取物鐵離子螯合能力 松露不同極性提取物鐵離子螯合曲線見圖2。

如圖2所示，WF 的鐵離子螯合率在質(zhì)量濃度為10 g/L 時(shí)趨于穩(wěn)定，螯合率接近90%，最大可達(dá)93.22%，具有很好的鐵離子螯合能力；MF 的螯合曲線在質(zhì)量濃度為20 g/L 時(shí)，螯合率趨于穩(wěn)定，最大值為91.16%，雖然MF 的最大螯合率與WF 相近，但在低劑量時(shí)，MF 的螯合能力明顯弱于WF；EAF 和PF 的螯合曲線上升平緩，在質(zhì)量濃度為1 g/L 時(shí)螯合率分別為35.83%和45.68%，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L 時(shí)，螯合率增加至60.98%和69.55%，然而遠(yuǎn)低于WF、MF 相同質(zhì)量濃度的螯合率。EDTA-2Na 具有良好的鐵離子螯合能力，質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)，螯合率可以達(dá)到95.07%，相同質(zhì)量濃度下，WF、MF 的螯合能力遠(yuǎn)不及EDTA-2Na。

圖1 松露提取物的羥自由基清除曲線Fig.1 Hydroxy radical scavenging curve of truffle extract

圖2 松露提取物鐵離子螯合能力曲線Fig.2 The Fe3+ chelation ability curve of truffle extract

2.1.3 松露提取物的總還原能力 由圖3可知，4種極性提取物的還原能力排序WF＞MF＞EAF＞PF。WF 和MF 在質(zhì)量濃度在1～10 g/L 之間，還原能力與質(zhì)量濃度約成線性正相關(guān)，且二者在這一質(zhì)量濃度區(qū)間的還原能力差異不明顯；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L 后，質(zhì)量濃度對WF、MF 的還原能力影響減少，然而WF 開始表現(xiàn)出更大的還原能力；當(dāng)質(zhì)量濃度為30 g/L 時(shí)，WF 和MF 的最大吸光值分別達(dá)到2.221 和2.011，接近VC 的最大吸光值，相同質(zhì)量濃度下，WF 和MF 的還原能力遠(yuǎn)小于VC。EAF 和PF 的還原能力較弱，質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)，二者的還原能力接近，質(zhì)量濃度大于5 g/L 時(shí)，EAF 的還原能力明顯強(qiáng)于PF，EAF 的吸光值最大可達(dá)0.941，而PF 的最大吸光值為0.608。

圖3 松露提取物的總還原能力曲線Fig.3 Total reduction capacity curves of the extracts

2.2 松露對秀麗線蟲的影響

2.2.1 松露水提物對秀麗線蟲壽命的影響 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，野生型秀麗線蟲的壽命約為2～3 周，分別用0，10，50，100 μg/mL 的松露水溶液處理秀麗線蟲，發(fā)現(xiàn)松露對秀麗線蟲的壽命延長有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05）。如圖4、表1所示。

由圖4可見，對照組的秀麗線蟲最長壽命為13 d，而10，50，100 μg/mL 處理組的最長壽命分別為18，16，16 d，分別延長5，3，3 d。由此可知，50 μg/mL 處理組對松露對秀麗線蟲的壽命延長效果最顯著。

空白對照組的秀麗線蟲平均壽命為9.06 d，而10，50，100 μg/mL 處理組的平均壽命相對于空白組分別延長了18.68%，31.86%，15.71%，且當(dāng)松露水提物質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)效果最顯著。當(dāng)松露質(zhì)量濃度上升到100 μg/mL 時(shí)，壽命延長效果有所下降，說明過量的松露水提物會對線蟲有細(xì)胞毒性。

2.2.2 松露水提物對秀麗線蟲生殖能力的影響野生型秀麗線蟲一生中的產(chǎn)卵量受環(huán)境、傳代數(shù)等多種因素的影響。分別用10，50，100 μg/mL 質(zhì)量濃度的松露水提物處理秀麗線蟲，檢測秀麗線蟲的產(chǎn)卵量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)松露水提物能有效增加秀麗線蟲的產(chǎn)卵量。如圖5，表2所示。

圖4 松露對秀麗線蟲壽命的影響Fig.4 The effect of truffles on the life span of C.elegans

圖5 松露對秀麗線蟲產(chǎn)卵量的影響Fig.5 Effect of truffle on fecundity of C.elegans

表1 不同質(zhì)量濃度松露水提物對秀麗線蟲平均壽命的影響Table 1 Effects of different mass concentrations of truffle extracts on the average life span of C.elegans

表2 不同質(zhì)量濃度松露水提物對秀麗線蟲產(chǎn)卵量的影響Table 2 Effects of different mass concentrations of truffle extract on fecundity of nematodes

由表2可知，對照組線蟲一生的產(chǎn)卵量為197 個(gè)，而10，50，100 μg/mL 處理組的線蟲產(chǎn)卵量分別增加到221，269，234 個(gè)，產(chǎn)卵的增加率分別為12.18%，36.55%，18.78%，與對照組相比有顯著差異。且以50 μg/mL 的質(zhì)量濃度處理組對秀麗線蟲的生殖促進(jìn)作用最明顯。

2.2.3 急性熱應(yīng)激條件下松露水提物對秀麗線蟲壽命的影響 壓力環(huán)境應(yīng)激能力是指生物體在外界生存環(huán)境變得惡劣下的抗逆能力，壓力環(huán)境越惡劣，生物體生存周期越長，證明生物體的壓力應(yīng)激能力越好。秀麗線蟲在不同質(zhì)量濃度松露水提物干預(yù)條件下的應(yīng)激壽命如圖6，表3所示。

由圖6可知，對照組秀麗線蟲在35 ℃急性熱應(yīng)激環(huán)境下的最長壽命為8 h，而10，50，100 μg/mL 處理組的線蟲的最長壽命分別為9，11，10 h，把秀麗線蟲的應(yīng)激壽命分別延長了1，3，2 h。

由表3可知，正常對照組秀麗線蟲的急性熱應(yīng)激平均壽命為5.75 d，而10，50，100 μg/mL 的松露水提物質(zhì)量濃度處理的秀麗線蟲平均壽命分別為 （6.15±0.05），（7.40±0.10），（6.75±0.15）d，相對壽命延長率可達(dá)6.96%，28.70%，17.39%，其中50 μg/mL 的質(zhì)量濃度處理組對秀麗線蟲的壽命延長效果最顯著。

2.2.4 急性氧化應(yīng)激條件下松露水提物對秀麗線蟲壽命的影響 將野生型秀麗線蟲放入4 mmol/L的H2O2溶液中造成氧化應(yīng)激條件，造成秀麗線蟲的急性氧化損傷。分別用0，10，50，100 μg/mL 的松露水溶液預(yù)處理線蟲48 h 后，挑入H2O2溶液的6 孔板中，每隔1 h 檢測線蟲存活量。松露水提物對秀麗線蟲急性氧化應(yīng)激的影響如圖7，表4所示。

圖6 急性熱應(yīng)激下松露對秀麗線蟲壽命的影響Fig.6 Effects of truffle on longevity of C.elegans under acute hot stress

圖7 急性氧化應(yīng)激下松露對秀麗線蟲壽命的影響Fig.7 Effects of truffle on longevity of C.elegans under acute oxidative stress

表3 急性熱應(yīng)激下不同質(zhì)量濃度松露提取物對秀麗線蟲的影響Table 3 Effects different mass concentrations of truffle extracts on C.elegans under acute hot stress

從線蟲的生存率曲線中，可以看出，對照組線蟲的氧化應(yīng)激最長壽命為7 h，而10，50，100 μg/mL 的松露處理組線蟲的最長壽命分別提高到10，8，8 h，比對照組多存活了3，1，1 h。

對照組秀麗線蟲在H2O2急性氧化應(yīng)激下的平均壽命為（4.20 ± 0.20） h，而10，50，100 μg/mL松露處理組的秀麗線蟲平均壽命分別為 （5.15 ±0.15），（6.70±0.10），（5.35±0.25）h，壽命相對延長率為22.61%，59.52%，27.38%。說明松露對急性氧化應(yīng)激下的秀麗線蟲有顯著保護(hù)作用（P＜0.05），可以有效降低秀麗線蟲對氧化損傷的敏感度，提高氧化條件下的抗逆能力，且當(dāng)松露質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)效果最佳。

2.2.5 松露對秀麗線蟲體內(nèi)活性氧生成量的影響

ROS 是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性基團(tuán)，適量的ROS 可雙向調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖，是人體中維持生理平衡的重要物質(zhì)[17]。然而過量的ROS 會引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或凋亡，從而引發(fā)動脈粥樣硬化、癌癥、心腦血管病癥等多種疾病[18]。本試驗(yàn)用H2DCF-DA 分子探針檢測了不同質(zhì)量濃度松露對秀麗線蟲體內(nèi)活性氧的影響如圖8所示。

由圖8可知，線蟲體內(nèi)的ROS 水平隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增加。對照組線蟲體內(nèi)ROS 在2 h 時(shí)可達(dá)303.45%，而松露水提物處理可以有效降低線蟲的ROS 水平上升趨勢，10 μg/mL 的松露水提物處理的線蟲2 h 后體內(nèi)ROS 為248.78%，相比對照組降低了54.67%；50 μg/mL 的松露水提物處理的線蟲ROS 為206.86%，相比對照組降低了96.59%；100 μg/mL 的松露水提物處理后ROS 為238.21%，相比對照組降低了65.24%。以上數(shù)據(jù)表明，松露水提物能有效清除線蟲體內(nèi)的ROS，且以50 μg/mL 的松露水提物對ROS 清除效果最為顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論

以松露不同極性提取物為對象，對其進(jìn)行體外抗氧化能力評價(jià)以及秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化測試，獲得全面的松露抗氧化數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，松露具有良好的體外、體內(nèi)抗氧化能力。松露不同極性提取物的抗氧化性存在顯著差異，綜合抗氧化能力排序?yàn)閃F＞MF＞EAF＞PF，且抗氧化能力排序與提取溶劑的極性大小排序一致，說明松露中主要的抗氧化活性成分為極性較大的物質(zhì)，易被極性較大的物質(zhì)提取；松露水提物可以有效清除線蟲體內(nèi)的ROS，降低其氧化應(yīng)激水平。50 μg/mL 松露處理可將線蟲的平均壽命增加31.86%，產(chǎn)卵量可從對照組的197 個(gè)增加到269 個(gè)。同時(shí)，松露水提物可以顯著降低秀麗線蟲在急性應(yīng)激條件下的敏感性，延長線蟲應(yīng)激條件下的壽命。未來可繼續(xù)深入探究松露的抗氧化機(jī)理和促進(jìn)生殖功能，為松露功能性食品的開發(fā)提供理論支撐。