王子煜 焦 哲 張金花 胡薛英 谷長勤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢，430070)

子宮的增生性病變是人與動物中都較為常見的疾病。目前的組織學(xué)分類將子宮增生性病變分為上皮性腫瘤和間質(zhì)腫瘤以及混合上皮和間質(zhì)腫瘤[1]。

上皮性腫瘤包括子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜腺瘤與腺癌。在人類中，子宮內(nèi)膜增生是一種非常重要的癌前病變。但是在家畜中這種觀點不被認可，因為在家畜中，子宮內(nèi)膜增生，尤其是囊性子宮內(nèi)膜增生十分常見[2]。腺瘤非常罕見，它由大量增生的腺體構(gòu)成，與腺癌、子宮內(nèi)膜息肉和子宮腺肌癥的病灶非常難以區(qū)分[3]。除家兔外，子宮內(nèi)膜腺癌在家畜中并不多見[4-5]。但人的子宮內(nèi)膜腺癌卻普遍存在[3]。家畜的子宮內(nèi)膜腺癌最常發(fā)生于年齡大的奶牛。偶爾在雌性的羊(Capra)、馬(Equus)、豬(Sus)、狗(Canis)和貓(Felis)中也有報道[6-12]。子宮內(nèi)膜息肉常見于犬和貓，是由子宮內(nèi)膜腺和間質(zhì)成分的局灶性增生組成，可為單個或多個，通常以有蒂或無蒂的方式向子宮內(nèi)突出，但是子宮內(nèi)膜息肉并不被當(dāng)作任何一種癌前病變[13-14]。在大多數(shù)動物生殖道腫瘤中，以平滑肌瘤最為常見。子宮的腫瘤多為間質(zhì)性腫瘤，其中平滑肌瘤占85%—90%，平滑肌肉瘤占10%，纖維瘤、纖維肉瘤和脂肪瘤則較為罕見[10，15-17]。

本病例記錄了1只來源于非洲刺猬(Atelerixalbiventris)的子宮內(nèi)多發(fā)性的增生性病變，組織學(xué)診斷并分析其發(fā)病特點，現(xiàn)將組織學(xué)診斷結(jié)果報告如下，旨為哺乳動物纖維肉瘤的診斷提供新的依據(jù)，為哺乳動物子宮增生性病變豐富資料。

1 材料與方法

2018年1月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院送檢1例非洲刺猬子宮角贅生物至病理實驗室進行診斷，該刺猬年齡4歲，雌性。就診時發(fā)現(xiàn)其陰道內(nèi)有血性分泌物，手術(shù)摘除卵巢及子宮。

主要試劑：鼠抗人PCK單克隆抗體、鼠抗人α-SMA單克隆抗體，封閉液(30%山羊血清)和顯色液(DAB)購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體及配套免疫組化抗原修復(fù)緩沖液及HRP標記的羊抗鼠/兔IgG，購于基因科技(上海)股份有限公司。

組織切片的制作：組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，切取多個腫塊，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別進行H.E.染色及免疫組織化學(xué)染色。

免疫組化染色步驟：將切好備用的4 μm石蠟切片烤片備用，切片經(jīng)二甲苯、乙醇梯度脫蠟至水，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，0.01M PBS洗滌2次；將PCK、α-SMA玻片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，Ki-67玻片放入稀釋的抗原修復(fù)緩沖液中，蒸汽熱修復(fù)，在100℃保持30 min，取出自然冷卻；滴加山羊(Caprahircus)血清白蛋白封閉非特異抗原抗體，封閉30 min后甩掉封閉液，滴加配好的一抗(PCK、α-SMA、Ki-67)，以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃過夜；次日，PBS洗滌2次后滴加HRP標記的二抗室溫作用30 min；PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素襯染，中性樹膠封片。使用Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡與圖像采集系統(tǒng)觀察采集圖像并分析。

免疫組化陽性率分析：當(dāng)陽性染色出現(xiàn)在細胞核中，無論強度大小，均考慮為陽性反應(yīng)。通過對組織切片的整體觀察進行評估，取陽性較強且均勻的多塊區(qū)域拍攝400倍照片，計算所選視野1 000個以上瘤細胞中陽性細胞核的比例。

2 結(jié)果

2.1 大體病變

腫塊充滿一側(cè)子宮角，子宮角擴張腫脹，內(nèi)含有大量黑紅色血液(圖1A)。腫塊淡黃色，體積約2 cm×1 cm×1 cm，表面可見豐富的血管，腫塊通過纖細的蒂部與子宮角黏膜相連，連接處的漿膜面可見有一隆起(圖1B)。

圖1 子宮腫塊的大體病變Fig.1 The gross lesion of uterine mass

2.2 組織學(xué)觀察

H.E.染色結(jié)果顯示腫塊有一層厚厚的包膜，包膜由嗜酸性強，排列密集的梭形細胞構(gòu)成，該細胞分化良好無明顯異型性，最外層附著有紅細胞。包膜內(nèi)瘤組織由大量梭形細胞構(gòu)成，細胞呈旋渦狀、人字形排列，瘤細胞排列較疏松，細胞核大，深染，核仁不明顯。并含有大量的脂肪細胞，膠原纖維的數(shù)量在組織內(nèi)高度可變，瘤組織含有豐富的血管，部分血管壁增厚，并在組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量肌樣團塊(圖2A，圖2B)。免疫組織化學(xué)α-SMA染色發(fā)現(xiàn)，包膜由平滑肌細胞構(gòu)成，且肌樣團塊與增生的血管壁均由平滑肌細胞構(gòu)成(圖2C)。

圖2 子宮內(nèi)腫塊的診斷Fig.2 Diagnosis of intrauterine mass

顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，在漿膜面隆起的部分，腫塊位于子宮角肌層，結(jié)構(gòu)上是一個巨大的空腔，空腔有一腫塊，該空腔的腔壁由柱狀上皮細胞構(gòu)成，腫塊的最外層同樣由柱狀上皮覆蓋，腫塊內(nèi)子宮內(nèi)膜腺大量增生，部分子宮內(nèi)膜腺出現(xiàn)明顯的囊性擴張。在腫塊內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了多個纖維團塊，由旋渦狀排列的成纖維細胞樣細胞與稀疏的膠原纖維構(gòu)成(圖3A)。免疫組織化學(xué)PCK染色示子宮內(nèi)膜腺上皮陽性(圖3B)。

圖3 子宮壁腫塊的診斷Fig.3 Diagnosis of uterine wall mass

子宮角內(nèi)腫塊免疫組織化學(xué)Ki-67陽性率為33.3%(圖4A)，PCNA陽性率為61.5%(圖4B)，表達量均較高，表示細胞增殖速度較快。

圖4 免疫組織化學(xué)Ki-67與PCNA染色Fig.4 Immunohistochemistry Ki-67 and PCNA staining

3 討論

近年來，非洲刺猬逐漸成為一種受歡迎的家庭寵物，子宮腫瘤在這種動物中很常見[2]。

在本病例中，腫瘤本身具有纖維肉瘤常見特征，通過免疫組化對平滑肌肌動蛋白的染色，排除平滑肌肉瘤的干擾即可確診。腫塊邊緣是由一層較厚的平滑肌形成的包膜，并且有平滑肌構(gòu)成的蒂部與子宮壁相連，可推測腫瘤發(fā)生于子宮的肌層。在肌層內(nèi)，出現(xiàn)了一個子宮內(nèi)膜間質(zhì)息肉，與一般的子宮內(nèi)膜間質(zhì)息肉不同的是，它沒有向子宮內(nèi)凸起，而是局限在肌層內(nèi)。對于刺猬這種動物而言，子宮內(nèi)同時存在多種成分的增生性病變是常見的，在一項對15只非洲雌性刺猬的子宮增生性病變研究中發(fā)現(xiàn)，這些刺猬的發(fā)病年齡在3—5歲，所有的病例均伴有陰道出血的癥狀，其中8例是多發(fā)性病變，包含多個成分[18]，且在本病例中發(fā)病年齡與癥狀也與文獻中一致。

我們發(fā)現(xiàn)息肉所在的位置正位于子宮內(nèi)腫塊蒂部的下方。因此我們推測纖維肉瘤的發(fā)生早于息肉，纖維肉瘤膨脹性的生長模式，使得其填滿了整個子宮角，而位于其下方形成的息肉則因無法向子宮內(nèi)脫出而在肌層局限性地生長。且在息肉的間質(zhì)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了纖維肉瘤團塊，與子宮內(nèi)纖維肉瘤結(jié)構(gòu)相同，這也說明了2個增生性的病變起源于同一位置，或是纖維肉瘤向息肉內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。

在對纖維肉瘤的診斷中，為了加強其惡性程度的判斷，我們采用免疫組化Ki-67與PCNA的染色進行分析，結(jié)果顯示Ki-67與PCNA表達量均較高，說明其惡性程度高。Ki-67是一個重要的細胞增殖標記物，對很多常見的腫瘤疾病的診斷及預(yù)測有重要的幫助，目前廣泛地應(yīng)用于預(yù)測各種腫瘤疾病的病情進展[19]，Ki-67表達于所有活躍的細胞周期階段，在細胞核內(nèi)的定位復(fù)雜又有特異性，并隨細胞周期改變而改變[20]。在細胞周期的G1期及S期早期，Ki-67的表達水平較低，在S期及G2期其表達急劇增加，在M期表達水平達到峰值，隨后在細胞分裂后期和末期其表達量迅速下降。Ki-67單克隆抗體標記G1后期S期和G2期M期細胞核抗原，而G0期G1早期的細胞核不被標記，且Ki-67抗原半衰期短，細胞脫離增殖周期后迅速降解這些特點使Ki-67成為優(yōu)質(zhì)的細胞增殖標記物[21]。PCNA是真核細胞DNA合成所必需的一種核蛋白，它在G1期PCNA的表達逐漸增加，S期達最高峰，而G2/M期則減少，PCNA的表達可能是DNA多倍體形式表達的一個標記，也成為腫瘤細胞失調(diào)狀態(tài)下的一個標記[22-23]，檢測PCNA可以客觀評價腫瘤細胞增殖狀態(tài)。

在本病例的纖維肉瘤中，我們發(fā)現(xiàn)許多肌樣的區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)了許多血管，這些血管的管壁明顯增厚。通過免疫組化SMA的染色，顯示這些肌樣區(qū)域?qū)儆谄交?，以及血管增厚的管壁同樣屬于平滑肌。這與一種隆突性皮膚纖維肉瘤中的肌樣型非常相似，肌樣型是隆突性皮膚纖維肉瘤的一種亞型[24-27]。但是對于這種肌樣區(qū)域的來源卻頗有爭議，有的文獻中認為，肌樣區(qū)域來源于腫瘤細胞，是纖維母細胞向肌纖維母細胞分化而形成的，屬于腫瘤的成分[25]。而另外有文獻顯示，肌樣區(qū)域來源于血管的平滑肌細胞的增生，因為它們在肌樣區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了狹窄的血管腔隙[26-27]。在國內(nèi)一篇文獻中對15例肌樣型隆突性皮膚纖維肉瘤進行了研究，該研究發(fā)現(xiàn)了肌樣區(qū)域形成的過程，由早期的血管平滑肌細胞增生，到肌樣團塊的形成。研究結(jié)果也表明了肌樣區(qū)域來源于血管的平滑肌細胞[28]。本病例中相同的發(fā)現(xiàn)，也說明肌樣型的纖維肉瘤不僅僅出現(xiàn)于人皮膚纖維肉瘤中，在動物的子宮內(nèi)纖維肉瘤也會出現(xiàn)這種變化。這種變化或許可以成為纖維肉瘤診斷的一個證據(jù)。