田玉苗 盛清宇 袁立成 姜廣順

(國家林業(yè)和草原局貓科動物研究中心，東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040)

廣義的基因流是指，導致一個群體向另一個群體內(nèi)產(chǎn)生基因交換的所有機制的通稱。而基因遷移，即基因流，是群體間產(chǎn)生基因交換或遺傳物質(zhì)交換的某種表現(xiàn)形式[1]。因此，在群體水平或個體水平層面中，在群體或個體消亡或重建過程中所涉及的一切基因的“運動”或遺傳物質(zhì)的動態(tài)交換過程，都可以統(tǒng)稱為基因流?；蛄魍ǔ１徽J為是重要的群體分化驅(qū)動力，來維持分化或正在分化群體間的穩(wěn)定性，使得群體適應環(huán)境?；蛄魇怯绊懭后w內(nèi)部和群體之間遺傳變異程度的重要因素，也是產(chǎn)生進化的一個重要因素。

狍(Capreolusspp.)是鹿科(Cervidae)中分布最廣泛的動物之一，包括2個種，即體型相對較小的歐洲狍(Capreoluscapreolus)以及體型相對較大的西伯利亞狍(Capreoluspygargus)[2-3]。西伯利亞狍的主要分布區(qū)域包括整個亞洲大陸的古北界[2]及東歐的部分地區(qū)[4]。在中國，狍主要分布在北部各省份，按種類分為東北亞種、西北亞種和天山亞種。在東北虎(Pantheratigrisaltaica)、東北豹(Pantherapardusorientalis)分布區(qū)域內(nèi)，也廣泛分布，是東北豹的主要獵物(占食物構(gòu)成的66%)以及東北虎的獵物之一(占食物構(gòu)成的9%)[5]。因此，研究狍種群間的基因流，對于探究獵物種群的有效恢復，對東北虎、東北豹種群的保護有著重要的意義。

目前，有相當部分的關(guān)于歐洲狍種群基因流的研究，如Coulon等[6]研究表明，歐洲狍的基因流受景觀連通性的影響。此外，Baker等[7]使用線粒體 DNA 和微衛(wèi)星標記的研究方法，比較了英國原有的狍種群和引入種群之間的遺傳多樣性差異以及種群混合和擴散。Hepenstrick等[8]研究表明，在瑞士全國重要的野生動物走廊內(nèi)，高速公路圍欄是狍基因流動的主要障礙。而關(guān)于西伯利亞狍的種群間基因流的研究，不管在國外還是國內(nèi)都相對較少。且大多數(shù)關(guān)于西伯利亞狍的研究，多集中于西伯利亞狍種群遺傳多樣性研究，如Lee等[9]對亞洲 10 個地區(qū)西伯利亞狍的12個微衛(wèi)星位點的變異進行了研究，分析了各個種群的遺傳多樣性水平，揭示了西伯利亞狍存在的3個不同地理種群。僅有盛清宇[10]使用10個微衛(wèi)星位點研究西伯利亞狍的偏性擴散，其結(jié)果表明西伯利亞狍的擴散機制為偏雌擴散。但其僅研究西伯利亞狍種群的擴散機制，未對種群間基因流進行研究。總的來說，目前國內(nèi)利用微衛(wèi)星標記分析西伯利亞狍種群間基因流的研究基本上處于空白狀態(tài)。鑒于此，本研究試圖利用9個微衛(wèi)星位點，結(jié)合熒光標記PCR技術(shù)，使用貝葉斯方法評估地理種群間的基因流，并探討長白山北部西伯利亞狍局域種群間基因流對群體遺傳分化的影響，以期為管理、制定保護政策提供遺傳學基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015—2017年，根據(jù)西伯利亞狍種群在長白山北部地區(qū)地理分布范圍，選擇5個地理采樣區(qū)域(圖1)，包括張廣材嶺(ZGCL)、琿春東北虎國家級自然保護區(qū)(HC)、汪清國家級自然保護區(qū)(WQ)、穆棱林業(yè)局和天橋嶺林業(yè)局(MT)，東寧林業(yè)局(DN)。主要為冬季樣線調(diào)查或跟蹤調(diào)查時采集樣本。共收集279份糞便樣本。為了保持樣品的質(zhì)量，在提取DNA之前，糞便樣品被-80 ℃保存。

圖1 研究區(qū)域地理位置示意圖和糞便個體采樣位置Fig.1 A geographical map of the study area and the location of individual fecal samples

1.2 糞便 DNA 提取

使用QIAamp DNA糞便微型試劑盒從刮下的糞便表面提取總基因組DNA。 總共提取了279個DNA樣品。用于后續(xù)實驗步驟。袁巍[11]推薦的物種特異性引物用于物種鑒定。

Pta-CbF(5′-CTAATCTCATCAATCCTAATC-3′).

Pta-CbR(5′-TTGGTATGAGTACTAGAATA-3′).

在1.0%瓊脂糖凝膠中鑒定出222 bp的細胞色素b序列，并在瓊脂糖凝膠上和UV透射照明器上可視化。我們在20 μL體系中使用KOD FX Neo DNA聚合酶(TOYOBD)，并添加1 μL DNA，退火溫度為51 ℃。

1.3 微衛(wèi)星位點及引物選擇

微衛(wèi)星是由2—5個核苷酸串聯(lián)的重復序列構(gòu)成，由于其多態(tài)性高，信息量大，實驗步驟少且簡單，實驗結(jié)果穩(wěn)定，DNA 需求量少等優(yōu)點，廣泛應用于遺傳學分析。本研究選取了9個微衛(wèi)星位點并合成引物，進行熒光染料標記。本研究所使用的微衛(wèi)星位點均為2堿基重復，引物序列信息見表 1。

表1 9個微衛(wèi)星位點信息，遺傳多樣性參數(shù)和多態(tài)性信息含量(PIC)、平均等位基因(Na)、平均有效等位基因(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)Tab.1 9 microsatellite loci，genetic diversity parameters and polymorphism information content(PIC)，mean allele(Na)，mean effective allele(Ne)，observed heterozygosity(Ho)and expected heterozygosity (He)

1.4 PCR擴增

PCR擴增的反應體系為：10 μL 10 × PCR Buffer，4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，各0.75 μL的上/下游引物 (10 mmol/L)，0.3 μL TOYOBO高保真酶，1.0 μL的模板DNA，使用ddH2O補足體系。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，55—58 ℃退火1 min，68 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；68 ℃延伸10 min。4 ℃保存。擴增完畢后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在含有核酸染料的 1% 瓊脂糖凝膠中，以 120 V 的電壓電泳30 min，以確定PCR擴增是否成功。每個樣本進行PCR擴增3—5次，以確保實驗結(jié)果的準確性。使用ABI3730X1 測序儀對所有微衛(wèi)星位點熒光標記下的PCR擴增產(chǎn)物進行基因型分型。

1.5 統(tǒng)計分析

使用Micro-checker[12]來檢驗無效等位基因和等位基因缺失。使用Excel Microsatellite Toolkit v 3.1.1[13]進行個體鑒定。使用Cervus v.3.0.7[14]計算位點多態(tài)信息含量(PIC)。使用GenAlEx v.6.1[15]計算每個位點和每個地理種群的等位基因數(shù)(Na)，有效等位基因數(shù)(Ne)，觀察(Ho)和期望(He)雜合度。另外，通過GenAlEx v.6.1測試了每個位點上每個種群的Hardy-Weinberg平衡(HWE)。使用GENEPOP v.4.0.11[16-17]測試位點的連鎖不平衡(LD)。利用 FSTAT v.2.9.3[18-19]軟件計算兩兩種群之間的FST。

BayesAss 1.3[20]允許居群偏離哈溫平衡，允許居群大小不同和遷移不對稱。應用MCMC分析和Bayesian方法，通過確定居群近交系數(shù)和連鎖不平衡，計算當代基因流，BayesAss 能估測個體遷移歷史的后驗概率(posterior probability)，因此該方法可以用來估測5個地理種群間的擴散情況和鄰接種群間的當代基因流。使用多組種子數(shù)(seed number)和迭代次數(shù)，選擇對數(shù)似然值(log-likelihood values)最大時的不作數(shù)迭代次數(shù)(buin-in length)，將參數(shù)的變化值設為總迭代次數(shù)的40%—60%。本實驗最終使用3×106的迭代次數(shù)，106的不作數(shù)迭代次數(shù)，設置取樣頻次(sample frequency)為2 000，以此獲得穩(wěn)定一致的后驗概率。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

利用軟件 MicroChecker 2.2.3 對本研究使用的9個微衛(wèi)星位點進行等位基因檢測時，3 種估算方法(Oosterhout、Chakraborty 和 Brookfield法)均未探測到等位基因缺失或無效等位基因的存在。使用Microsatellite Toolkit進行個體鑒定。結(jié)果表明，HC有21個個體，ZGCL有32個個體，WQ有82個個體，DN有37個個體，MT有43個個體。從279個糞便樣本中成功鑒定出215個個體(圖1)。

每個位點和每個種群共有45個哈迪-溫伯格平衡試驗，21個顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(表2)。在位點間僅檢測出少量位點在個別種群中可能存在連鎖現(xiàn)象，未見任何位點在3個以上種群中與其他位點連鎖，因此這9對微衛(wèi)星引物可以用于后續(xù)的分析研究。

表2 各種群 9 個微衛(wèi)星位點的 Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗的 P 值及顯著性Tab.2 P value and significance of Hardy-Weinberg equilibrium chi-square test for 9 microsatellite loci in various groups

9個位點為中-高多態(tài)性，等位基因范圍為4.4—15.6個(表1)。5個群體中等位基因的平均數(shù)量為8.556—10.111。5個群體中等位基因的平均數(shù)量為8.556—10.111。由于WQ群體中個體數(shù)量最多，等位基因的數(shù)量會因個體數(shù)量的不同而有很大的差異。5個群體的觀測雜合度為0.693—0.730，期望雜合度為0.714—0.732(表3)。FST評估表明種群分化程度較低(FST范圍為-0.001 1—0.018 0，表4)?？傮w上，90%(9/10)的兩兩群體分化值與0差異顯著(P<0.05)。

表3 西伯利亞狍種群遺傳多樣性參數(shù)以及使用BayesAss1.3程序計算了5個地理種群在近1—3代之間的非移民比例(proportion non-migrants，95% CI)。糞便樣本數(shù)量(NS)、個體數(shù)量(N)、平均等位基因(Na)、平均有效等位基因(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)Tab.3 The parameters of genetic diversity of the Siberian roe deer population and the BayesAss 1.3 program were used to calculate the proportion of non-migrants(proportion non-migrants，95% CI)of the five geographical populations between the last and the third generation.Number of fecal samples(NS)，number of individuals(N)，mean allele(Na)，mean effective allele(Ne)，observed heterozygosity(Ho)and expected heterozygosity(He)

表4 種群間遺傳分化系數(shù)FSTTab.4 Population comparisons with FST values

2.2 基因流

使用 BayesAss 1.3計算的基于貝葉斯法的種群間定向基因流表明，5個地理種群間出現(xiàn)不對稱基因流(表5，圖2)，基因流從MT種群流向其他種群，其他種群間基因流動對稱，同時MT種群有很高比例的“非移民”個體(97.15%)，表明MT是分散的源種群[21](表3)。其余各種群間也存在相當程度的基因交流，如WQ到ZGCL(2.46%)，ZGCL到HC(1.01%)，WQ到HC(1.23%)，DN到HC(1.51%)等，說明群體間存在較為廣泛的不對稱的基因流。

表5 種群間定向基因流評估Tab.5 Directional gene flow estimated

圖2 基于貝葉斯方法計算的5個地理種群間的近期定向基因流Fig.2 Recent directional gene flow between 5 geographic populations calculated based on Bayesian method

3 討論

在本研究中，調(diào)查了長白山北部西伯利亞狍局域種群的遺傳多樣性和種群間基因流。我們檢測到高遺傳多樣性(He=0.714—0.732；表3)，雖低于德國北部歐洲狍微衛(wèi)星多樣性(He=0.74—0.79)[22]，但仍高于亞洲大部分西伯利亞狍種群(He=0.522—0.628)[9]。不同于盛清宇等[23]使用10個微衛(wèi)星位點對長白山北部區(qū)域西伯利亞狍局域種群遺傳特征的分析的研究，本研究中使用9個微衛(wèi)星位點，且對地理種群的劃分與其不同，雖各種群遺傳多樣性參數(shù)略有不同，但研究結(jié)果均表明長白山北部區(qū)域西伯利亞狍局域種群遺傳多樣性高。估算群體間的遺傳分化系數(shù)可以區(qū)分群體間和群體內(nèi)相對遺傳變異大小，揭示群體遺傳變異的主要來源[24]。本研究中，長白山北部區(qū)域狍種群不同地理群體間的遺傳分化水平很低(FST=-0.001 1—0.018 0，表4)，說明遺傳變異絕大部分存在于群體內(nèi)，群體間的遺傳變異所占比例極小。

群體遺傳學研究表明，引起群體產(chǎn)生遺傳分化的主要原因是遺傳漂變和自然選擇[25]?；蛄髂軌蛟黾尤后w內(nèi)遺傳變異量，減少群體間的分化，使群體趨向于一致，其與遺傳漂變的作用是相互擷抗的[26]。在自然群體中，群體的分化差異程度與群體間的基因流大小緊密相關(guān)，即如果不同群體間的基因流強度越高，則該群體間的分化差異程度則相對越小[27-28]。本研究中各地理種群間存在廣泛的不對稱的基因流，抑制了遺傳漂變的作用，從而使得群體間的遺傳分化非常小。雖然還需要進行更多的測試，但本研究表明長白山北部狍局域種群似乎并沒有遺傳差異，基因持續(xù)交流是導致種群間遺傳分化低的主要原因。如果允許西伯利亞狍的連通性持續(xù)不變，我們可以預期在長白山北部將會繼續(xù)擴散，甚至不斷擴大。然而，需要注意的是，本研究僅探究了各種群間的基因流情況，但是何種原因?qū)е逻@種種群間的交流，需要進一步分析研究。

4 結(jié)論

本研究表明長白山北部狍局域種群具有較高的遺傳多樣性，遺傳信息豐富。其雜合度水平和等位基因豐富度高于亞洲其他地區(qū)的西伯利亞狍種群。5個局域種群之間，遺傳多樣性比較接近，未出現(xiàn)遺傳多樣性突高的情況。種群間存在不對稱基因流，且表明較大的基因流是長白山北部狍不同地理種群間遺傳分化水平很低的主要原因。本研究表明，研究區(qū)域內(nèi)的西伯利亞狍種群具有良好的遺傳潛力，是可以進行持續(xù)發(fā)展的種質(zhì)資源。因此，本研究為西伯利亞狍種群的科學管理提供了理論依據(jù)。

致謝：感謝國家自然科學基金(31872241)、中央高校基礎研究基金(2572017PZ14)和有蹄類食性分析中植物角質(zhì)細胞人工智能識別研究項目(201910225555)對本研究項目的資助。感謝寧瑤博士、溫都蘇博士、佘雯碩士、王姣碩士給予的幫助。野外采樣工作得到了項目區(qū)各林業(yè)局和保護區(qū)工作人員的支持和幫助，在這里一同表示感謝。