鮮義坤 楊 楠 黃明亞 李裕冬 李松柏 朱 英 趙仁仟 熊鐵一*

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院，成都，610041；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，成都，611130)

人工遷地飼養(yǎng)繁殖大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)不僅是保護(hù)這一國寶級珍稀物種擺脫瀕危困境的快捷有效方式，還可供大眾觀賞和科普教育，也便于開展許多科學(xué)試驗(yàn)研究。大熊貓飼養(yǎng)單位每天都要投喂數(shù)量較大的新鮮竹子(包括竹竿、竹葉、竹筍)，此外還補(bǔ)飼一定數(shù)量的特制成窩窩頭形狀的人工配合飼料(以下簡稱窩窩頭)、蘋果、胡蘿卜等[1-2]，以利于大熊貓攝入較全面的營養(yǎng)物質(zhì)，保障大熊貓健康生活。蒸制的窩窩頭屬復(fù)配型精飼料，是圈養(yǎng)大熊貓喜歡選擇采食的食物之一。

頂空(HS)—固相微萃取(SPME)—?dú)庀嗌V(GC)—質(zhì)譜(MS)聯(lián)用分析技術(shù)具有簡便快速、不加溶劑、可直接檢測樣品散發(fā)出的揮發(fā)性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，能真實(shí)、準(zhǔn)確地反映來自樣品的揮發(fā)性物質(zhì)種類及其濃度，成為當(dāng)今世界測定樣品中未知混合型揮發(fā)性有機(jī)物的主流方法[3]。鑒于圈養(yǎng)大熊貓所食窩窩頭的氣味及其成分未有報(bào)道，本文通過專業(yè)人員的嗅感品評和HS-SPME-GC-MS聯(lián)用法研究窩窩頭的氣味特點(diǎn)與香氣成分，旨在探尋大熊貓喜食人工配合飼料的氣味特點(diǎn)和香氣成分，為大熊貓人工飼養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動(dòng)物

供試大熊貓共4只，基本信息詳見表1。其中春俏和冰晶飼養(yǎng)于四川省峨眉山市仙芝竹尖生態(tài)園，屬亞成體[1-2]；輝輝和福龍飼養(yǎng)于四川省閬中市熊貓樂園，屬成體[1-2]。4只大熊貓健康狀況均為良好，圈內(nèi)隨意活動(dòng)，自由采食和飲水，遵照已定的飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行日常飼喂和管理。

表1 供試大熊貓基本信息與窩窩頭采樣日期Tab.1 The basic informations of experimental giant pandas and wowotou sampling dates

1.2 圈養(yǎng)大熊貓所食窩窩頭的制作

窩窩頭的配方由中國大熊貓保護(hù)研究中心提供，原料有大豆、玉米、大米、雞蛋、白糖、磷酸二氫鈣、重質(zhì)碳酸鈣以及植物油[1-2，4]，均在當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I，配比因大熊貓生長發(fā)育階段的不同而有所差異。窩窩頭的制作流程：按照配方配料稱重→粉碎→拌混→成型→熟化(汽蒸3—4 h)→晾冷→保存待喂。

1.3 樣品采集與制備

供飼窩窩頭任取1個(gè)，平均分為8塊，隨機(jī)取出6塊喂給2只大熊貓各3塊，當(dāng)這6塊窩窩頭全部被2只大熊貓分別吃完后余下的2塊用作樣品，即所采樣品可代表大熊貓所食窩窩頭。如此獲得的一些樣品先切成細(xì)條狀，再切成顆粒狀，混合，隨機(jī)取出用于揮發(fā)性有機(jī)物分析或氣味品評的樣品，制好的樣品密封保存于-20 ℃的冰箱中待測評。在樣品采集和制備之前所有與樣品接觸的用具用品須經(jīng)反復(fù)清洗，干凈無味，以防其他氣味串入樣品。樣品在裝有冰袋的保溫箱中運(yùn)輸。

1.4 氣味品評方法

供評樣品稱重2.0 g，與大熊貓所食其他食物一起編號，由6名專業(yè)品評人員在不知食物名稱或原料組成的情況下盲評。具體方法參見文獻(xiàn)[5]。

1.5 HS-SPME-GC-MS方法1.5.1 儀器設(shè)備

GC-MS聯(lián)用儀的型號為Agilent 7890B-5977B，超高惰性石英毛細(xì)管色譜柱的型號為HP-INNOWax，30 m×0.25 mm×0.25μm，20 mL頂空瓶及其相應(yīng)的密封墊和鋁蓋，均由美國Agilent公司出品。SPME纖維頭的型號為75μm CAR/PDMS，SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄，均由美國Supelco公司出品。其他器材和用品均為測試分析室常規(guī)配置。

1.5.2 HS-SPME方法

在70 ℃的條件下頂空萃取1 h。具體方法參見文獻(xiàn)[5]。

1.5.3 GC-MS方法

GC條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣，柱流量為0.80 mL/min，進(jìn)樣模式為分流，分流比為5∶1。程序升溫模式：起始溫度45 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至180 ℃，再以8 ℃/min速率升至260 ℃，保持10 min。MS條件及其數(shù)據(jù)處理：同文獻(xiàn)[6]的測試方法二。

2 結(jié)果與分析

2.1 窩窩頭氣味的嗅感品評

圈養(yǎng)大熊貓所食2種窩窩頭的氣味嗅感品評結(jié)果如下。

氣味類型：由多種氣味組成的復(fù)合型氣味。

整體概述：呈現(xiàn)糧食烘烤之后熟化的多種氣味。氣味較強(qiáng)，透發(fā)性尚可，愉悅度較好，香味較持久。

氣味描述：甜香如蜜、濃郁，有糖食的糊化氣息，近似糖蜜香氣，焦糖樣甜香味突出。帶有熟玉米香氣、豆粕樣香氣及谷物發(fā)酵樣香氣。略帶酸香氣息、油脂氣息及肉腥氣息。

2.2 窩窩頭的揮發(fā)性有機(jī)物

見圖1、圖2和表2。

圖2 圈養(yǎng)大熊貓輝輝和福龍所食窩窩頭2的揮發(fā)性有機(jī)物總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of the VOCs from No.2 wowotous ingested by captive giant pandas named Huihui and Fulong

圖1 圈養(yǎng)大熊貓春俏和冰晶所食窩窩頭1的揮發(fā)性有機(jī)物總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the VOCs from No.1 wowotous ingested by captive giant pandas named Chunqiao and Bingjing

從表2可知，窩窩頭1可確定(匹配度≥80%)的揮發(fā)性有機(jī)物有50種，窩窩頭2有69種，各自歸屬于有機(jī)化合物的類別見表3。

表2 圈養(yǎng)大熊貓所食2種窩窩頭的揮發(fā)性有機(jī)物Tab.2 The VOCs from 2 wowotous ingested by captive giant pandas

由表3可知，從窩窩頭1和窩窩頭2中測出的有機(jī)化合物類別數(shù)量分別為10個(gè)和11個(gè)。無論成分?jǐn)?shù)量還是相對含量，醛類和醇類均為窩窩頭1和窩窩頭2中最主要的2大有機(jī)化合物類別。但這2種窩窩頭在有機(jī)化合物類別、成分?jǐn)?shù)量及相對含量上存在著差異，可能是原料配比、產(chǎn)地、質(zhì)量、加工具體方法等不同所致。

表3 2種窩窩頭揮發(fā)性有機(jī)物的分類與相對含量統(tǒng)計(jì)Tab.3 Classification and relative content statistics of VOCs from 2 wowotous

2批樣品綜合來看，窩窩頭中可確定的揮發(fā)性有機(jī)物達(dá)80種(不計(jì)相互之間的重復(fù)成分，下同)，分別歸類于醛17種、醇17種、酮11種、烯烴11種、雜環(huán)化合物7種、芳烴5種、羧酸4種、含氮化合物3種、酚2種、醚1種、酯1種及烷烴1種，前5類累計(jì)成分?jǐn)?shù)量達(dá)63種，占揮發(fā)性有機(jī)物總數(shù)的78.75%；平均相對含量排在前5位的類別是醛類35.26%、醇類26.90%、雜環(huán)類14.39%、烯烴類7.50%、酮類3.81%，累計(jì)達(dá)87.86%?？梢姼C窩頭的揮發(fā)性有機(jī)物是以醛類、醇類、雜環(huán)類、烯烴類及酮類為主。

續(xù)表2

續(xù)表2

2.3 窩窩頭的香氣成分

窩窩頭的復(fù)合型氣味及其強(qiáng)度雖與揮發(fā)性有機(jī)物數(shù)量及其濃度密切相關(guān)，但關(guān)鍵在于揮發(fā)性有機(jī)物中的香氣成分?jǐn)?shù)量及其濃度。本文的香氣成分僅限于我國或/和歐盟、美國、日本的法規(guī)允許在食品加工過程中添加使用，且在市場上可流通的單體呈香物質(zhì)，并非所有的揮發(fā)性有機(jī)物或氣味成分。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)從已測定的揮發(fā)性有機(jī)物中篩選出食品級的香氣成分，見表2中帶※號者。窩窩頭1的香氣成分?jǐn)?shù)量占揮發(fā)性有機(jī)物成分總數(shù)的90.00%，窩窩頭2的香氣成分?jǐn)?shù)量占比則為76.81%，這些香氣成分對窩窩頭復(fù)合型氣味的形成起到主要或主導(dǎo)作用，其各自歸屬于有機(jī)化合物的類別詳見表4。

表4 2種窩窩頭香氣成分的分類與相對含量統(tǒng)計(jì)Tab.4 Classification and relative content statistics of aroma components from 2 wowotous

由表4可知，從窩窩頭1和窩窩頭2中測出的香氣成分歸屬有機(jī)化合物類別數(shù)量分別為10個(gè)和9個(gè)。窩窩頭1的香氣成分?jǐn)?shù)量排在前5位的有機(jī)化合物類別由多到少依次醛類、醇類、雜環(huán)類、烯烴類、羧酸類或酮類(并列)，按5類累計(jì)達(dá)36種，占香氣成分總數(shù)的80.00%；而相對含量排在前5位的有機(jī)化合物類別由高到低依次是醛類、醇類、雜環(huán)類、烯烴類及羧酸類，這5類累計(jì)達(dá)89.63%。可見窩窩頭1的香氣成分類別無論成分?jǐn)?shù)量還是相對含量主要為醛類、醇類、雜環(huán)類、烯烴類及羧酸類。相對含量排在前10位的單一香氣成分由高到低依次是苯甲醛、己醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、麥芽酚、2-戊基呋喃、2-呋喃甲醇、庚醛、壬醛及2-乙基呋喃，這10種香氣成分歸類為醛4種(相對含量小計(jì)34.68%)、醇3種(相對含量小計(jì)25.91%)、雜環(huán)化合物3種(相對含量小計(jì)13.63%)，累計(jì)相對含量達(dá)74.22%，可佐證醛類、醇類及雜環(huán)類香氣成分是窩窩頭1的3大主要香氣成分類別。

窩窩頭2的香氣成分?jǐn)?shù)量排在前5位的有機(jī)化合物類別由多到少依次醛類、醇類、酮類、雜環(huán)類及羧酸類，這5類累計(jì)達(dá)46種，占香氣成分總數(shù)的86.79%；而相對含量排在前5位的有機(jī)化合物類別由高到低依次是醛類、醇類、雜環(huán)類、烯烴類及酮類，這5類累計(jì)達(dá)77.75%。可見窩窩頭2的香氣成分類別無論成分?jǐn)?shù)量還是相對含量主要為醛類、醇類及雜環(huán)類。相對含量排在前10位的單一香氣成分由高到低依次是己醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、2-呋喃甲醇、苯乙烯、苯甲醛、1-己醇、麥芽酚、壬醛、庚醛，這10種香氣成分歸類為醛4種(相對含量小計(jì)23.97%)、醇3種(相對含量小計(jì)19.74%)、雜環(huán)化合物2種(相對含量小計(jì)10.66%)、烯烴1種(相對含量為4.44%)，累計(jì)達(dá)58.81%，可見醛類、醇類及雜環(huán)類香氣成分也是窩窩頭2的3大主要香氣成分類別。

上述表明：醛類、醇類及雜環(huán)類是大熊貓所食窩窩頭的3大主要香氣成分類別，這3大類香氣成分對窩窩頭的主體香氣形成很可能起到重大作用。但這2種窩窩頭在香氣成分的有機(jī)化合物類別、成分?jǐn)?shù)量及其相對含量上也有所差異，也可能是原料配比、產(chǎn)地、質(zhì)量、加工具體方法等不同所致。

2批樣品綜合來看，2種窩窩頭中可確定的香氣成分共有62種，分別歸類于醛16種、醇15種、酮10種、烯烴6種、雜環(huán)化合物6種、羧酸4種、酚2種、醚1種、酯1種、芳烴1種，前5類累計(jì)達(dá)53種，占香氣成分總數(shù)的85.48%；平均相對含量排在前5位的類別是醛類35.18%、醇類26.58%、雜環(huán)類14.07%、烯烴類4.24%、酮類3.52%，累計(jì)達(dá)83.59%。可見2種窩窩頭的香氣成分合并后仍以醛類、醇類、雜環(huán)類、烯烴類、酮類為主。這些類別的香氣成分可能對窩窩頭主要香氣的形成起到了重要作用。綜合后平均相對含量排在前10位的單一香氣成分由高到低依次是己醛、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、1-己醇、2-戊基呋喃、2-呋喃甲醇、麥芽酚、苯乙烯、壬醛、庚醛，這10種香氣成分歸類為醛4種(相對含量小計(jì)29.33%)、醇3種(相對含量小計(jì)22.83%)、雜環(huán)化合物2種(相對含量小計(jì)11.02%)、烯烴1種(相對含量為2.39%)，累計(jì)達(dá)65.57%，也可佐證醛類、醇類及雜環(huán)類香氣成分是大熊貓所食窩窩頭的3大主要香氣成分類別。

窩窩頭1的香氣成分比窩窩頭2少8種，窩窩頭1和窩窩頭2相同的香氣成分有36種，占總數(shù)的58.06%；互不相同的香氣成分有26種，占總數(shù)的41.94%；據(jù)此推知這2種窩窩頭的氣味種類及其強(qiáng)度可能存在一定差異，但相似之處居多，不同之處較少或許主要表現(xiàn)在香氣強(qiáng)度上。

3 討論

3.1 大熊貓所食窩窩頭氣味的影響因素

影響蒸熟后窩窩頭氣味的因素有三：一是原料本身的較弱氣味，如植物油有油脂氣息，雞蛋清和雞蛋黃及大豆具腥香氣息，玉米和大米各有各的特殊氣味；二是蒸制過程中生成的氣味，如玉米、大米、白糖在3 h左右的高溫下熟化并產(chǎn)生糖食糊化氣息和焦糖樣甜香，玉米和大豆經(jīng)高溫后分別產(chǎn)生熟玉米香氣和豆粕樣香氣，玉米、大米等經(jīng)粉碎、加水拌混、逐漸升至高溫后產(chǎn)生谷物發(fā)酵樣香氣和酸香氣息；三是蒸制結(jié)束后的晾冷和保存期間窩窩頭的氣味也會(huì)發(fā)生微弱、緩慢地變化。

在窩窩頭的原料預(yù)處理中粉碎，使大豆、玉米、大米成為粉末狀小顆粒，拌混有助于營養(yǎng)物質(zhì)均勻分布。在蒸柜中加熱汽蒸實(shí)際上是一個(gè)加濕、加溫、加壓的過程，不僅殺滅病原微生物，破壞原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子如大豆中的抗胰蛋白酶、大豆血球凝集素等，促使原料中的淀粉糊化，蛋白改性，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用效率；而且此過程發(fā)生了復(fù)雜多樣的反應(yīng)，包括褐變反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)、美拉德(Maillard)反應(yīng)、氨基酸的斯特勒克(Strecker)降解反應(yīng)、脂肪的熱降解反應(yīng)等，其中美拉德反應(yīng)對風(fēng)味的形成起著重要作用，生成了2-呋喃甲醛、麥芽酚、呋喃酮類、吡咯類、噻吩類等多種揮發(fā)性氣味物質(zhì)[7]。窩窩頭原料中的大米和玉米富含淀粉和還原糖，雞蛋和大豆富含蛋白質(zhì)和氨基酸，為美拉德反應(yīng)提供了豐富的前提物質(zhì)，蒸制過程的持續(xù)高溫為美拉德反應(yīng)等創(chuàng)造了良好的促成條件，蒸制結(jié)束后賦予了窩窩頭突出的焦糖樣甜香味并帶有烤香味等。

3.2 大熊貓所食窩窩頭氣味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)

根據(jù)單體呈香物質(zhì)氣味特征描述的記載[8-9]和表2中的香氣成分，可以找到窩窩頭多種氣味所對應(yīng)的一些香氣成分，某種氣味并非單獨(dú)由1種香氣成分引起，而是由多種香氣成分相互協(xié)同增效或抵消減弱作用后的最終嗅感結(jié)果。與甜香味相關(guān)的香氣成分多達(dá)16種，分別是(以表2中出現(xiàn)的先后為序，下同)：乙酸異戊酯、d-檸檬烯、3-辛酮、辛醛、1-己醇、2-呋喃甲醛、反式-2-壬烯醛、苯甲醛二甲基縮醛(亞芐基二甲基醚)、芳樟醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、苯乙醛、2-呋喃甲醇、苯甲醇、苯乙醇、麥芽酚、香蘭素，這16種與甜香味相關(guān)的香氣成分在上述2次測試結(jié)果中的平均相對含量累計(jì)達(dá)23.75%，形成了窩窩頭濃郁的甜香味。具有烤香味的香氣成分有：2-戊基呋喃、2-呋喃甲醛、苯乙醇、2-乙?；量?。具有豆香氣息的香氣成分有：2-乙基呋喃、2-戊基呋喃。具有糊化和焦糖氣息的香氣成分有2-乙基呋喃、2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛、2-呋喃甲醇、麥芽酚。酸香氣息可能與乙酸等羧酸類有關(guān)。油脂氣息可能與2-庚酮、2-甲基-1-丁醇、辛醛、1-羥基-2-丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、反式，反式-2，4-癸二烯醛、香蘭素等有關(guān)。肉腥氣息可能與庚醛、反式-2-庚烯醛、3-辛烯-2-酮、反式-2-辛烯醛、反式-2-壬烯醛、反式，反式-2，4-癸二烯醛、4-乙烯基苯酚等有關(guān)。

3.3 氣味是圈養(yǎng)大熊貓喜食窩窩頭原因的推測

大熊貓為適應(yīng)已變異的生存環(huán)境，由肉食性進(jìn)化成植食性。植食性的很多動(dòng)物主要根據(jù)氣味尋找食物[10]。一些專家學(xué)者對野外和圈養(yǎng)大熊貓的采食行為仔細(xì)觀察分析后，認(rèn)為大熊貓的嗅覺在食物尋覓和選擇性采食的過程中具有決定性作用[11-13]。推知大熊貓憑借自己發(fā)達(dá)的嗅覺感知食物散發(fā)出的氣味，判斷是否安全和有無采食興趣，在達(dá)到熟悉并認(rèn)知安全的氣味閾值后，激發(fā)出采食欲望，繼而引起了進(jìn)食行為，這是自然選擇和長期進(jìn)化的結(jié)果，因此認(rèn)為食物的氣味可能是大熊貓選擇性采食的首要因素。從上述的研究結(jié)果中容易看出大熊貓之所以喜歡選擇窩窩頭采食很可能是因?yàn)楦C窩頭中突出的甜香味。當(dāng)然圈養(yǎng)大熊貓喜食窩窩頭還可能與采食行為習(xí)慣、窩窩頭的適口性(味道、質(zhì)構(gòu))以及營養(yǎng)性等有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

嗅感品評結(jié)果表明，窩窩頭的氣味較強(qiáng)，愉悅度較好，香味較持久，在整體上呈現(xiàn)糧食烘烤之后熟化的多種氣味，甜香如蜜且濃郁，焦糖樣甜香突出，帶有熟玉米香氣、豆粕樣香氣及谷物發(fā)酵樣香氣，略帶酸香氣息、油脂氣息及肉腥氣息。經(jīng)HS-SPME-GC-MS聯(lián)用法測定，共發(fā)現(xiàn)62種香氣成分，歸類為醛16種、醇15種、酮10種、烯烴6種、雜環(huán)化合物6種、羧酸4種、酚2種、醚1種、酯1種、芳烴1種，相對含量較高的單一香氣成分是己醛、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、1-己醇、2-戊基呋喃、2-呋喃甲醇、麥芽酚、苯乙烯、壬醛及庚醛，醛類、醇類及雜環(huán)類香氣成分是窩窩頭氣味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)種類。突出的焦糖樣甜香味是窩窩頭氣味的主要特征。

致謝：西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的包清彬教授、成都大帝漢克生物科技有限公司的孔凌高級工程師、劉張育工程師、鄧虹工程師參加了香氣品評以及喻麟董事長和李小兵總經(jīng)理給予了支持，閬中市熊貓樂園開發(fā)有限公司的李嘉民總經(jīng)理和廖榮館長在采樣時(shí)也給予了支持，中國科學(xué)院成都分院分析測試中心的胡靜副研究員在揮發(fā)性成分分析與推定方面提供了幫助，在此一并深表謝意！