李靜靜，史娜溶，楊孟于，王金鵬，孫道杰，馮 毅，張玲麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是小麥生產(chǎn)中具有毀滅性的病害，近10年來(lái)在中國(guó)黃淮麥區(qū)大面積流行[1-3]。赤霉病主要危害小麥穗部，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，感病籽粒含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等毒素，食用或飼用后會(huì)引發(fā)中毒[4]，直接威脅糧食安全和食品安全?？钩嗝共⌒缕贩N的選育及其推廣利用是控制病害發(fā)生和蔓延的最經(jīng)濟(jì)有效的措施[1]。在中國(guó)黃淮麥區(qū)以往的小麥育種中，赤霉病抗性未被作為主要育種目標(biāo)[5]，致使目前大田主要推廣品種的赤霉病抗性普遍較差[6]。赤霉病免疫或高抗種質(zhì)資源在全世界較為稀缺[7]，因此，創(chuàng)制抗赤霉病新種質(zhì)是當(dāng)前黃淮麥區(qū)抗病育種的主要育種目標(biāo)[2]。在國(guó)內(nèi)外研究的40多個(gè)抗赤霉病種質(zhì)資源材料中，中國(guó)小麥地方品種蘇麥3號(hào)是目前全世界公認(rèn)的高抗赤霉病優(yōu)異種質(zhì)資源[7]。蘇麥3號(hào)含有多個(gè)抗赤霉病的QTLs，分別位于3BS、5AS和6BS等染色體上[7-8]，其中，位于3BS染色體上的主效基因Fhb1(即Qfhs.ndsu-3BS)[9-10]抗擴(kuò)展效應(yīng)最強(qiáng)，被廣泛研究和利用[5,7]，該基因可解釋表型變異的24.5%～60.0%[11-13]；已開發(fā)的Fhb1基因連鎖標(biāo)記有g(shù)wm533、gwm493、barc133、umn10和barc147等[10,14-17]。位于蘇麥3號(hào)6BS染色體上的抗赤霉病微效基因Fhb2可解釋赤霉病抗性表型變異的 9.4%～21.0%[15,18]，該位點(diǎn)開發(fā)的可利用標(biāo)記有g(shù)wm133、barc101和gwm644[11,15,18]。位于5AS染色體臂上的基因Fhb5(即Qfhi.nau-5A)與抗赤霉病菌侵染密切相關(guān)[19]，可解釋赤霉病抗性表型變異的20.0%左右[14]，已開發(fā)的連鎖標(biāo)記有barc186、barc180、gwm304、wmc705、gwm293和gwm154[12,14,20-21]。位于蘇麥3號(hào)3BS、5AS和6BS染色體上的這些抗赤霉病基因分子標(biāo)記，可用于抗病育種的分子標(biāo)記輔助選擇[7]。但是，蘇麥3號(hào)春性較強(qiáng)，易受凍害；株高120 cm左右，莖稈纖細(xì)易倒伏，農(nóng)藝性狀差，產(chǎn)量低；籽粒粉質(zhì)，品質(zhì)較差[22-23]，在黃淮冬麥區(qū)直接利用難度較大[5]。

小麥新品系979-5是從黃淮麥區(qū)主推品種西農(nóng)979中系選的矮稈品系，株高(75 cm左右)較西農(nóng)979低，抗倒伏，具有西農(nóng)979的早熟抗寒和優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋特性，但中感赤霉病。為此，本課題組通過(guò)979-5與蘇麥3號(hào)雜交組合，采用系譜育種法，結(jié)合利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和赤霉病菌接種鑒定技術(shù)，選育兼抗赤霉病的優(yōu)良育種材料，以期為黃淮麥區(qū)抗赤霉病小麥新品種改良提供優(yōu)異親本材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

本課題組于2012年以979-5與蘇麥3號(hào)為親本進(jìn)行雜交，2013年田間種植F1群體，2014年在F2代群體中選擇優(yōu)良單株，2015-2019年分別種植F3～F7并從中選株系。每年同步種植對(duì)照材料矮抗58(高感赤霉病)，親本材料979-5(中感赤霉病)和蘇麥3號(hào)(高抗赤霉病)。參試材料于每年10月5日播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥育種試驗(yàn)田：F1種植106株，F(xiàn)2種植12 420株，F(xiàn)3～F7每個(gè)株系種植3行。播種規(guī)格：株距6.67 cm，行距27.0 cm，行長(zhǎng)200 cm。小麥生長(zhǎng)期間不進(jìn)行病害防治，其余管理同大田。

所用赤霉病病原菌菌種分離自陜西關(guān)中灌區(qū)田間禾谷鐮刀菌強(qiáng)致病菌系，在滅菌的小米粒上擴(kuò)繁，菌種由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王保通教授惠贈(zèng)。

1.2 方 法

1.2.1 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

調(diào)查的主要農(nóng)藝性狀有幼苗抗寒性、株高、開花期、成熟期、單株成穗數(shù)、穗長(zhǎng)和小穗數(shù)等。在植株生長(zhǎng)發(fā)育期間，進(jìn)行觀察記載，并對(duì)性狀表現(xiàn)優(yōu)異單株掛牌標(biāo)記。

1.2.2 赤霉病接種和病情鑒定

于小麥揚(yáng)花期，將培養(yǎng)好的帶菌米粒接種于麥穗中上部第4或第5個(gè)小穗(從穗頂部往下數(shù))最外邊的一個(gè)小花內(nèi)。接種后，立即用裝有蒸餾水的噴壺噴濕接種穗，并用塑料袋套袋保濕 72 h。單株鑒定時(shí)，每個(gè)單株接種3個(gè)單穗；品系鑒定時(shí)，每個(gè)品系隨機(jī)接種20個(gè)單穗。

參照中國(guó)小麥抗赤霉病評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[24]，于接種21 d后，調(diào)查每個(gè)接種穗部的發(fā)病小穗數(shù)和總小穗數(shù)，計(jì)算嚴(yán)重度。依據(jù)平均嚴(yán)重度，將材料可分為5個(gè)抗性等級(jí)：免疫(I)(平均嚴(yán)重度為0)，高抗(HR)(0 <平均嚴(yán)重度< 2.0)，中抗(MR)(2.0 <平均嚴(yán)重度≤3.0)，中感(MS)(2.0<平均嚴(yán)重度≤3.5)，高感(HS)(平均嚴(yán)重度 ≥3.5)[24]。

1.2.3 DNA標(biāo)記分析

取苗期小麥幼嫩葉片，按照Edwards等[25]的CTAB法提取基因組DNA。選用與蘇麥3號(hào)抗赤霉病基因Fhb1、Fhb2和Fhb5緊密連鎖的13個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行分析，即：3BS上Fhb1的4標(biāo)記(gwm493、barc133、gwm533和barc147)[11,16,26]，6BS上Fhb2的3個(gè)標(biāo)記(gwm133、gwm644和barc101)[19]，5AS上Fhb5的6個(gè)標(biāo)記(barc186、barc180、wmc705、gwm293，gwm154和gwm304)[12,14,21,27]。引物由北京迪寧生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體系為15 μL，包括：1.5 μL 10× PCR buffer，0.3 μL dNTPs Mixture(10 mmol·L-1)，0.4 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U · μL-1)，2 μL引物(上、下游引物各1 μL，5 μmol·L-1)，2 μL模版DNA(50 ng·μL-1)，8.8 μL dd H2O。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55～60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.4 籽粒品質(zhì)分析

收獲的籽粒晾曬干燥并室內(nèi)常溫貯藏1月后，利用近紅外透射谷物分析儀(型號(hào)InfratecTM 1241，福斯有限公司，中國(guó))測(cè)定籽粒含水量、蛋白質(zhì)含量(干基)、濕面筋含量(14%水分基)、面粉吸水率、面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間和沉降值等指標(biāo)。

通過(guò)一年的肥效對(duì)比試驗(yàn)數(shù)據(jù)積累、比較可以看出：肥料合理配比和提高肥料利用率是作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵，使用配方專用肥是解決這一問(wèn)題的有效手段，同時(shí)可以改善土壤養(yǎng)分供給，滿足作物對(duì)養(yǎng)分的需求，從而達(dá)到增產(chǎn)增收的目的，因此，建議在今后的生產(chǎn)中應(yīng)推廣專用配方肥[2]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記在兩親本間的多態(tài)性

選用13個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)親本979-5和蘇麥3號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增分析，其中6個(gè)標(biāo)記(3BS上的gwm493，6BS上的gwm133和gwm644，5AS上的gwm293、barc186和gwm304)在兩親本間擴(kuò)增為單態(tài)(圖1A)，其余7個(gè)標(biāo)記(3BS上的barc133、gwm533和barc147,6BS上的barc101,5AS上的barc180、wmc705和gwm154)在兩親本間擴(kuò)增均為多態(tài)(圖1B)。這表明，979-5與蘇麥3號(hào)在3BS、6BS和5AS三個(gè)抗赤霉病基因位點(diǎn)具有一定的遺傳相似性。因此，選用7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記可對(duì)979-5和蘇麥3號(hào)的后代群體的3個(gè)抗性基因位點(diǎn)進(jìn)行選擇。

2.2 抗赤霉病新品系創(chuàng)制結(jié)果

采用系譜育種法，從12 420個(gè)單株組成的F2代群體中，依據(jù)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)選到545個(gè)優(yōu)良單株。按株系種植F3～F5世代群體，根據(jù)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，在優(yōu)良株系內(nèi)選擇優(yōu)良單株，對(duì)初選單株用3BS上的3個(gè)多態(tài)性標(biāo)記(gwm533、barc133和barc147)分別進(jìn)行分析(圖2A)，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)均能擴(kuò)增出與蘇麥3號(hào)相同帶型的單株。經(jīng)2018和2019年連續(xù)兩年標(biāo)記檢測(cè)和農(nóng)藝性狀分析，最終育成穩(wěn)定遺傳且含有3BS上Fhb1基因標(biāo)記位點(diǎn)的新品系20個(gè)(表1)。

2.3 新品系在5AS和6BS標(biāo)記位點(diǎn)的差異

用5AS上的多態(tài)性標(biāo)記(barc180、wmc705和gwm154)和6BS上的多態(tài)性標(biāo)記(barc101)(圖2B，C)，分別對(duì)育成的14個(gè)新品系進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)品系(k11、k12、k13、k14和k15)在三個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(wmc705、gwm154和barc101位點(diǎn))檢測(cè)到蘇麥3號(hào)的特異條帶；有2個(gè)品系(k9和k10)在兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(wmc705和gwm154位點(diǎn))檢測(cè)到蘇麥3號(hào)特異條帶；其余13個(gè)品系在5AS和6BS的3個(gè)多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)均未檢測(cè)到蘇麥3號(hào)的特異條帶(表1)。由此可見(jiàn)，k9、k10、k11、k12、k13、k14和k15這7份材料不僅聚合有3BS上的優(yōu)異等位變異，還聚合有5AS和6BS上的優(yōu)異等位變異；其余13份材料僅聚合了3BS上的優(yōu)異等位變異。

A、B、C圖分別為分子標(biāo)記barc133、wmc705、barc101的檢測(cè)結(jié)果。1：979-5；2：蘇麥3號(hào)；箭頭分別示979-5和蘇麥3號(hào)的特征 譜帶。

2.4 新品系的赤霉病抗性

經(jīng)2018-2019連續(xù)兩年田間赤霉病單花接種鑒定，20個(gè)新品系抗性水平表現(xiàn)穩(wěn)定可靠，其中高抗品系有7個(gè)(k9、k10、k11、k12、k13、k14和k15)，中抗新品系有13個(gè)(表1，圖3)。

箭頭指示接種赤霉病菌的小花部位。

表1 赤霉病抗性評(píng)價(jià)及分子標(biāo)記分析

2.5 新品系的主要農(nóng)藝性狀

表2 新品系的主要農(nóng)藝性狀

2.6 新品系的主要品質(zhì)性狀

育成的20個(gè)新品系四項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)(蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、吸水率和穩(wěn)定時(shí)間)普遍優(yōu)于蘇麥3號(hào)(表3)。其中，k15、k32和k40三個(gè)品系的蛋白質(zhì)含量為14.1%～14.6 %、濕面筋含量為30.2%～31.2%、面粉吸水率為58.4%～ 60.8%，面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為7.4～8.0 min。在國(guó)家中強(qiáng)筋小麥品種標(biāo)準(zhǔn)[28]中要求，蛋白質(zhì)含量≥13%，濕面筋含量≥28.5%，吸水率≥58%，穩(wěn)定時(shí)間≥7.0 min?？梢?jiàn)，新品系k15、k32和k40的四個(gè)主要品質(zhì)指標(biāo)達(dá)到國(guó)家中強(qiáng)筋小麥品種 標(biāo)準(zhǔn)。

表3 新品系的籽粒主要品質(zhì)指標(biāo)

3 討 論

近年來(lái)，隨著全球氣候的變化和作物耕作制度的改變，中國(guó)小麥赤霉病發(fā)病區(qū)域呈擴(kuò)大趨勢(shì)，已從長(zhǎng)江中下游麥區(qū)擴(kuò)展到黃淮麥區(qū)[5,29]，嚴(yán)重影響中國(guó)小麥生產(chǎn)安全。培育抗赤霉病品種已成為中國(guó)黃淮麥區(qū)小麥育種的主要目標(biāo)之一[5]。蘇麥3號(hào)攜帶有多個(gè)抗赤霉病基因/QTLs[7,17]，是世界上公認(rèn)的高抗赤霉病品種，其抗性強(qiáng)且穩(wěn)定持久。美國(guó)、加拿大、澳大利亞等國(guó)家利用其Fhb1、Fhb2和Fhb5基因連鎖分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)[26,30-32]，開展抗赤霉病小麥新品種改良。本研究采用系譜選育法，對(duì)979-5品系與蘇麥3號(hào)雜交后代群體，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和赤霉病菌單花接種鑒定技術(shù)，結(jié)合農(nóng)藝性狀選擇，育成攜帶有Fhb1基因的抗赤霉病優(yōu)異新品系20份，其中13份新品系僅攜帶Fhb1基因，其抗性水平表現(xiàn)為中抗；5份新品系(k11、k12、k13、k14和k15)不僅攜帶有Fhb1，還攜帶有Fhb2和83.3%Fhb5的優(yōu)異等位變異，抗性水平為高抗；2個(gè)新品系(k9和k10)，不僅攜帶有Fhb1，還攜帶有Fhb5的83.3%優(yōu)異等位變異，抗性水平為高抗。由此可見(jiàn)，利用蘇麥3號(hào)抗性基因分子標(biāo)記輔助選擇時(shí)，聚合的抗性基因或優(yōu)異等位變異數(shù)越多，抗性水平越強(qiáng)。Basnet等[33]研究認(rèn)為，蘇麥3號(hào)之所以抗性最強(qiáng)和持久，可能與其擁有較多數(shù)量的微效QTLs有關(guān)。Bai等[34]研究表明，僅僅聚合有Fhb1的材料，并不能完全保護(hù)和抵抗赤霉病的危害。這表明，在利用抗赤霉病分子標(biāo)記輔助選擇時(shí)，為了提高赤霉病的抗性水平，不僅要進(jìn)行主效基因Fhb1的標(biāo)記輔助選擇，還需要進(jìn)行微效基因的標(biāo)記輔助選擇。

本研究之所以能在育成品系的5份材料(k11、k12、k13、k14和k15)中，能同時(shí)聚合Fhb1和Fhb2的全部?jī)?yōu)異等位變異、以及83.3%Fhb5的優(yōu)異等位變異，與親本材料979-5在這三個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)。利用與Fhb1、Fhb2和Fhb5基因緊密連鎖的13個(gè)SSR標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，979-5與蘇麥3號(hào)在這三個(gè)基因位點(diǎn)具有較高的遺傳相似性：用Fhb1的4個(gè)SSR標(biāo)記(gwm493、barc133、gwm533和barc147)分析發(fā)現(xiàn)，其中1個(gè)標(biāo)記(gwm493)在979-5和蘇麥3號(hào)間擴(kuò)增帶譜相同；用Fhb2的3個(gè)標(biāo)記(gwm133、gwm644、barc101)分析發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)標(biāo)記(gwm133和gwm644)在979-5和蘇麥3號(hào)間擴(kuò)增帶譜相同；用Fhb5的6個(gè)標(biāo)記(barc186、barc180、wmc705、gwm293，gwm154和gwm304)分析，其中3個(gè)標(biāo)記(gwm293、barc186和gwm304)在979-5和蘇麥3號(hào)間擴(kuò)增帶譜相同。這表明，979-5與蘇麥3號(hào)在Fhb1、Fhb2和Fhb5基因位點(diǎn)遺傳相似性分別為25.0%、66.7%和50.0%。979-5源自小麥品種西農(nóng)979，西農(nóng)979是蘇麥3號(hào)的衍生系，攜帶有蘇麥3號(hào)的Fhb1基因[35]，因此推測(cè)，979-5之所以中感赤霉病，可能與其攜帶蘇麥3號(hào)抗性相關(guān)的優(yōu)異等位變異有關(guān)。由于979-5在Fhb1、Fhb2和Fhb5位點(diǎn)與蘇麥3號(hào)有較高的遺傳相似度，本研究在利用主效基因Fhb1分子標(biāo)記輔助選擇的同時(shí)，能有效地聚合微效基因Fhb2和Fhb5位點(diǎn)的部分優(yōu)異等位變異，其中育成的5個(gè)新品系(k11、k12、k13、k14和k15)赤霉病抗性均達(dá)高抗水平。本研究在分子標(biāo)記輔助選擇和赤霉病菌接種鑒定的同時(shí)，還進(jìn)行了主要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的選擇，育成的新品系不僅對(duì)赤霉病抗性得到有效提高，而且豐產(chǎn)性和品質(zhì)性狀也獲得提升，因此本研究育成的新品系可作為黃淮麥區(qū)小麥新品種改良的優(yōu)異親本材料。