白海波，呂學(xué)蓮，惠 建，馬斯霜，李樹華，董建力

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750002)

干旱和高溫是制約小麥增產(chǎn)的兩種主要非生物逆境，因此加強(qiáng)小麥抗旱耐熱性遺傳改良研究，對(duì)小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)有重要意義。前人在小麥抗旱耐熱性基因定位研究方面已經(jīng)做了有意義的探索。張正斌等[1]利用小麥重組自交系(RILs)研究發(fā)現(xiàn)，控制小麥最大根長(zhǎng)的QTL位于1B、2A、5A、5B、6A和7B上。周曉果等[2]以小麥DH群體在水分脅迫下檢測(cè)到多個(gè)水分利用效率相關(guān)性狀的QTL，它們分布在2A、3A、4A、5A、6A、7A、1B、3B、3D 染色體上。周瑞霞等[3]在干旱脅迫下檢測(cè)到2個(gè)位于4B和7B染色體上、控制株高的QTL和2個(gè)均位于7B染色體上、分別控制穗莖節(jié)長(zhǎng)和單株穗數(shù)的QTL。李卓坤等[4]以冬小麥DH群體為材料，在模擬水分脅迫條件下將控制小麥胚芽鞘長(zhǎng)、根長(zhǎng)的QTL定位在2A、4B和4D上。李世平等[5]利用冬小麥DH群體檢測(cè)12個(gè)灌漿期耐熱性QTL，其分布在1B、2D、3A、3B、6A、6B 和7A染色體上。Mason等[6]利用冬小麥RILs群體檢測(cè)到小麥生育后期耐熱性狀的QTL位于1A、2A、2B、3B染色體上。Rajneesh等[7]利用RILs群體研究認(rèn)為，小麥葉綠素含量、冠層溫差、千粒重和產(chǎn)量的耐熱指數(shù)的QTL分別位于2B、7B和7D上。Talukder等[8]發(fā)現(xiàn)，控制小麥葉綠素含量的QTL分別位于1B、1D、6A和7A染色體上。由于不同研究所用材料、性狀、脅迫方式及環(huán)境不同，小麥抗旱、耐熱QTL定位結(jié)果也不盡相同。

隨著數(shù)量性狀位點(diǎn)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)相關(guān)性狀位點(diǎn)之間存在著大量的遺傳重疊(genetic overlap)，“一因多效”是導(dǎo)致性狀間遺傳重疊的一個(gè)重要原因。在雙脅迫下水稻[9-11]、大豆[12]的抗旱與耐鹽、耐鹽與耐低溫、抗病與抗旱等性狀的QTL位點(diǎn)之間存在著大量的遺傳重疊。本研究以抗旱、耐熱小麥品種間雜交創(chuàng)制的RILs為作圖群體，在干旱脅迫、熱脅迫、旱熱脅迫下對(duì)抗旱耐熱相關(guān)性狀QTL進(jìn)行定位，確定QTL有利等位基因在染色體上的位置，并進(jìn)行遺傳重疊分析，以期為小麥抗旱耐熱遺傳改良及分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)基因聚合育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為“寧春4號(hào)×寧春27號(hào)”RILs群體(包括128個(gè)家系)及其親本。寧春4號(hào)[13]由寧夏永寧育繁所選育，于1981年審定推廣。寧春27號(hào)[14]由寧夏固原市農(nóng)科所選育，于1998年審定推廣。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2015-2017年于寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物所試驗(yàn)基地開展田間試驗(yàn)。每個(gè)材料種2行，行長(zhǎng)1 m，行距0.2 m，順序排列，重復(fù)3次。設(shè)干旱脅迫、熱脅迫、旱熱脅迫和對(duì)照(CK)4個(gè)處理。干旱脅迫處理僅在拔節(jié)期、抽穗期灌水，每次灌水量為900 m3·hm-2。干旱脅迫期間搭建遮雨棚架，雨前遮蓋。熱脅迫處理全生育期灌4水(拔節(jié)期、抽穗期、灌漿初期、灌漿中期)，并在小麥灌漿中期38 ℃高溫連續(xù)熱脅迫處理3 d，每天3 h。增溫方法采用李世平[5]、徐如強(qiáng)[15]的方法并略加改進(jìn)，即用0.1 mm厚無(wú)色透明聚乙烯塑料人工搭建日光溫棚，溫棚頂部可移動(dòng)調(diào)節(jié)棚內(nèi)溫度，在每天自然溫度最高時(shí)段(12：00-15：00)進(jìn)行熱脅迫，在溫棚穗層放置溫度計(jì)、濕度計(jì)。旱熱脅迫處理僅在拔節(jié)期、抽穗期灌水，灌漿初期至成熟干旱脅迫，灌漿中期進(jìn)行熱脅迫處理，方法與上面旱熱單一脅迫相同。對(duì)照(CK)保持常溫(自然溫度)，充足灌水，全生育期灌4水(拔節(jié)期、抽穗期、灌漿初期、灌漿中期)，每次灌水量為900 m3·hm-2。

4個(gè)處理的施肥均一致，且與當(dāng)?shù)卮筇锵嗤?，每個(gè)處理間隔6 m，處理間在地下垂直埋塑料薄膜100 cm深，以防水分測(cè)滲，用量水堰監(jiān)測(cè)灌水量。灌水處理的小區(qū)搭建遮雨棚，在雨前人工遮蓋。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 葉綠素含量測(cè)定

在干旱、熱脅迫前后用SPAD-502 葉綠素儀于上午9: 00-12:00在各小區(qū)第一行測(cè)同一天抽穗掛牌的5個(gè)主莖的旗葉上、中、下部SPAD值,取其平均值。

1.3.2 葉片含水量測(cè)定

在干旱、熱脅迫前后取各小區(qū)第一行的主莖旗葉5片，隨即稱鮮重，置于70 ℃烘箱烘干，稱干重，計(jì)算旗葉含水量(RWC)。RWC=(鮮重-干重)/干重×100%。

1.3.3 穗粒重、千粒重測(cè)定

成熟期，在每小區(qū)第二行收10個(gè)主穗，考察穗粒重、千粒重。

1.4 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL定位分析

用分布于小麥21對(duì)染色體上的307對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)RILs群體128個(gè)株系進(jìn)行基因型分析，利用完備區(qū)間作圖軟件IciMapping 4.0[16]，構(gòu)建包含30個(gè)連鎖群的遺傳圖譜(圖1)。圖譜包括266個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，遺傳連鎖圖總長(zhǎng)度為 2 187.79 cM，平均每條染色體連鎖圖長(zhǎng)104.18 cM，平均2個(gè)標(biāo)記的距離為8.22 cM[17]。

圖1 小麥SSR遺傳連鎖圖譜

采用IciMapping 4.0對(duì)RILs群體抗旱耐熱相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位,以LOD>3.0作為閾值判斷QTL存在與否,以α=0.05和α=0.01為顯著水平計(jì)算表型貢獻(xiàn)率。加性效應(yīng)為正值,表明QTL的增加效應(yīng)來(lái)自于母本寧春4號(hào);加性效應(yīng)為負(fù)值,表明其增加效應(yīng)來(lái)自于父本寧春27號(hào)。測(cè)定數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RILs及其親本性狀表現(xiàn)

3種脅迫條件下,親本和RILs群體間旗葉葉綠素含量、旗葉含水量、穗粒重和千粒重的差異較大，各性狀變化均存在超親現(xiàn)象，各性狀值的偏度和峰度絕對(duì)值小于1或接近1，w值接近1(表1)，表明RILs群體的生理性狀、產(chǎn)量性狀值呈正態(tài)分布，屬于數(shù)量性狀遺傳，適合進(jìn)行QTL 定位。

表1 不同脅迫下親本和RILs群體性狀表現(xiàn)

2.2 灌漿期抗旱相關(guān)性狀的 QTL定位結(jié)果

在三年灌漿期干旱脅迫下，共檢測(cè)到控制旗葉葉綠素含量、旗葉含水量、千粒重和穗粒重的QTL 22個(gè)，它們分布于2A、3B、4B、7B、3D、4D、7D染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為 9.38%～30.81%(表2)。控制旗葉葉綠素含量的QTL有5個(gè)，位于2A、3B、4B和7B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為 12.45%～21.46%；其中Qcc-2A.2和Qcc-7B等位基因來(lái)自抗旱父本寧春27號(hào)，表型貢獻(xiàn)率為11.93%～21.46%。控制旗葉含水量的QTL有7個(gè)，位于2A、3B、3D、4D、7B和7D染色體上，表型貢獻(xiàn)率為9.38%～30.81%；其中Qrwc-2A、Qrwc-3B.1、Qrwc-3D和Qrwc-7D等位基因來(lái)自抗旱父本寧春27號(hào)，表型貢獻(xiàn)率為9.38%～ 30.54%?？刂扑肓Ｖ氐腝TL有6個(gè)，位于2A、3B、4B、4D 和7B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為9.76%～25.42%；其中Qgw-3B、Qgw-4B.2、Qgw-4D和Qgw-7B等位基因來(lái)自抗旱父本寧春27號(hào)，表型貢獻(xiàn)率為9.76%～25.42%?？刂魄ЯＶ氐腝TL有4個(gè)，位于2A、7B、3D和7B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為9.75%～25.83%；其中Qtgw-2A和Qtgw-3D等位基因來(lái)自抗旱父本寧春27號(hào)，表型貢獻(xiàn)率分別為9.75%和13.18%。2A和7B染色體上各有1個(gè)QTL在三年干旱脅迫處理中均被檢測(cè)到，分別控制旗葉含水量(Qrwc-7B，wmc83-wmc276)和穗粒重(Qgw-2A，gwm294-wmc644)。有6個(gè)QTL在兩年被檢測(cè)到，其中2個(gè)控制旗葉葉綠素含量(Qcc-2A.2、Qcc-4B)，1個(gè)控制旗葉含水量(Qrwc-4D)，2個(gè)控制穗粒重(Qgw-3B、Qgw-4B.2)，1個(gè)控制千粒重(Qtgw-2B)。

表2 干旱脅迫下抗旱相關(guān)性狀QTL定位

2.3 灌漿期耐熱相關(guān)性狀的QTL定位結(jié)果

3年熱脅迫下，共檢測(cè)到控制旗葉葉綠素含量、旗葉含水量、千粒重和穗粒重的QTL 36個(gè)，它們分布于2A、2B、3A、3B、4B、4D、5D、6D、7A和7B染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為 9.03%～34.97%(表3)。控制旗葉葉綠素含量的QTL有12個(gè)，位于2A、3A、3B、4B、5D、6D、7A和7B染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為 9.39%～34.16%，除了Qcc-3B外，其他等位基因來(lái)自耐熱親本寧春4號(hào)?？刂破烊~含水量的QTL有8個(gè)，位于2A、2B、4D、6D、7A和7B染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為9.42%～ 43.73%，等位基因全部來(lái)自耐熱親本寧春4號(hào)。控制穗粒重的QTL有8個(gè)，位于2A、3B、4D、5D、6D和7A染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為9.03%～24.29%，2A、4D、5D、6D和7A染色體上等位基因來(lái)自寧春4號(hào)，3B染色體上等位基因來(lái)自父本寧春27號(hào)?？刂魄ЯＶ氐腝TL有8個(gè)，位于2A、2B、3B、4B、5D和6D染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為9.49%～42.57%，4B、5D和6D染色體上等位基因來(lái)自寧春4號(hào)。3B、7B染色體上各有1個(gè)QTL在三年熱脅迫處理中均被檢測(cè)到，分別控制穗粒重(Qgw-3B)和旗葉含水量(Qrwc-7B.1)。

表3 熱脅迫下耐熱相關(guān)性狀QTL定位

2.4 灌漿期旱熱脅迫下QTL定位結(jié)果

灌漿中期旱熱脅迫下，共檢測(cè)到控制旗葉葉綠素含量、旗葉含水量、千粒重和穗粒重的QTL 30個(gè)，它們分布于2A、3A、4A、2B、3B、4B、7B、3D、4D、6D染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為9.09%～40.81%(表4)?？刂破烊~葉綠素含量的QTL有9個(gè)，位于2A、2B、3A、3B、4A和4D染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為9.10%～33.01%；其中，Qcc-2A.1、Qcc-2A.2、Qcc-2B.2、Qcc-3A和Qcc-4D等位基因來(lái)自寧春4號(hào)，Qcc-2B.1、Qcc-3B、Qcc-3D、Qcc-4D等位基因來(lái)自寧春27號(hào)?？刂破烊~含水量的QTL有6個(gè)，位于2B、3B、4B、7B染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為13.92%～55.68%，等位基因全部來(lái)自耐熱親本寧春4號(hào)?？刂扑肓Ｖ氐腝TL有8個(gè)，位于2A、3B、4B、6D和7B染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為8.40%～35.67%；其中，Qgw-2A.1、Qgw-2A.2、Qgw-4B.1和Qgw-6D等位基因來(lái)自寧春4號(hào)，Qgw-2B、Qgw-3B.1、Qgw-3B.2、Qgw-4B.2和Qgw-7B等位基因來(lái)自寧春27號(hào)?？刂魄ЯＶ氐腝TL有7個(gè)，位于2B、3D、4D、6D 和7B染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率 為8.81%～39.01%；其中，Qtgw-6D.1和Qtgw-6D.2等位基因來(lái)自父本寧春4號(hào)。2A、3B、7B染色體上各有1個(gè)QTL在三年旱熱脅迫處理中被檢測(cè)到，分別控制旗葉葉綠素含量(Qcc-2A.2)、旗葉含水量(Qrwc-7B.1)和千粒重(Qtgw-2B)。

表4 旱熱脅迫下QTL定位

2.5 抗旱耐熱性共定位QTL

2.5.1 抗旱相關(guān)性狀共定位QTL

在小麥灌漿期干旱脅迫下，2A染色體上檢測(cè)到的控制旗葉葉綠素含量的QTLQcc-2A.2與穗粒重的QTLQgw-2A共定位區(qū)間為 gwm294-wmc644，區(qū)間距為6.49 cM(圖2)，表型貢獻(xiàn)率為13.13%～ 21.46%；7B染色體上檢測(cè)到的控制旗葉葉綠素含量的QTLQcc-7B與穗粒重的QTLQgw-7B共定位區(qū)間為barc140-gwm297，區(qū)間距為1.92 cM，表型貢獻(xiàn)率為11.03%～ 12.45%。這兩個(gè)共定位區(qū)間控制性狀的加性效應(yīng)均為負(fù)值，其增效等位基因來(lái)自抗旱親本寧春27號(hào)，說(shuō)明該QTL位點(diǎn)與灌漿期抗旱性的關(guān)系密切，其中共定位區(qū)間gwm294-wmc644在2年均被檢測(cè)到，表明該位點(diǎn)受環(huán)境的影響較小，能夠穩(wěn)定表達(dá)。

圖2 小麥抗旱性QTL共定位區(qū)間在染色體上的分布

2.5.2 耐熱相關(guān)性狀共定位QTL

在小麥灌漿期熱脅迫條件下，檢測(cè)到5D染色體上控制旗葉葉綠素含量的QTLQcc-5D與穗粒重的QTLQgw-5D.1的共定位區(qū)間為cfd67-cfd40(圖3)，區(qū)間距為11.24 cM，表型貢獻(xiàn)率為16.57%～18.28%。在6D染色體上檢測(cè)到的控制旗葉含水量的QTLQrwc-6D、穗粒重的QTLQgw-6D.1和千粒重的QTLQtgw-6D.1共定位區(qū)間為barc196-barc54，區(qū)間距為4.71 cM，表型貢獻(xiàn)率為9.42%～16.59%。加性效應(yīng)分析表明，共定位區(qū)間 cfd67-cfd40和 barc196-barc54控制性狀的加性效應(yīng)均為正值，其增效等位基因來(lái)自耐熱親本寧春4號(hào)，說(shuō)明其與灌漿期耐熱性關(guān)系密切，但因?yàn)橹辉谝荒暌环N脅迫下檢測(cè)到，因而其表達(dá)受環(huán)境的影響較大。

圖3 小麥耐熱性QTL共定位區(qū)間在染色體上的分布

2.5.3 抗旱性QTL與耐熱性QTL共定位分析

在小麥灌漿期旱熱脅迫下，檢測(cè)到2A染色體上控制旗葉葉綠素含量的QTLQcc-2A.2與穗粒重的QTLQgw-2A.1共定位區(qū)間為gwm294-wmc644(圖4)，表型貢獻(xiàn)率為10.13%～ 26.14%。加性效應(yīng)分析表明，在干旱脅迫下控制旗葉葉綠素含量的等位基因來(lái)自抗旱親本寧春27號(hào)，在熱脅迫下控制穗粒重的等位基因來(lái)自耐熱親本寧春4號(hào)，說(shuō)明QTL位點(diǎn) gwm294-wmc644與抗旱耐熱性有密切關(guān)系，且在干旱脅迫、熱脅迫、旱熱脅迫條件下都被檢測(cè)到，說(shuō)明該位點(diǎn)受環(huán)境的影響小。

在2B染色體上檢測(cè)到的控制旗葉葉綠素含量的QTLQcc-2B與千粒重的QTLQtgw-2B共定位區(qū)間為wmc441-wmc317(圖4), 表型貢獻(xiàn)率為13.27%～ 22.13%。加性效應(yīng)分析表明，控制千粒重的等位基因來(lái)自寧春27號(hào)，控制旗葉葉綠素含量的等位基因來(lái)自寧春4號(hào)，說(shuō)明該位點(diǎn)與抗旱耐熱性有密切關(guān)系。

在7B染色體上，控制旗葉含水量的QTLQrwc-7B.1與千粒重的QTLQtgw-7B的共定位區(qū)間為wmc83-wmc276(圖4)，表型貢獻(xiàn)率為 27.21%～55.68%，遺傳效應(yīng)較大。經(jīng)加性效應(yīng)分析，控制旗葉含水量的等位基因來(lái)自寧春4號(hào)，控制千粒重的等位基因來(lái)自寧春27號(hào)，共定位區(qū)間 wmc83-wmc276與抗旱耐熱性有密切關(guān)系，且在2年三種脅迫下被檢測(cè)到，說(shuō)明該位點(diǎn)受環(huán)境的影響小。

圖4 小麥抗旱耐熱性QTL共定位區(qū)間在染色體上的分布

3 討 論

小麥的抗旱耐熱性是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，是小麥本身的遺傳特性和環(huán)境共同作用的結(jié)果。本研究與前人在2A[1，2，4]、7B[1-3，18]、4B[4-5]染色體上檢測(cè)到與抗旱性有關(guān)的QTL結(jié)果相同，與趙 朋等[19]和劉勝男等[20]都在2A染色體上檢測(cè)到控制葉綠素含量的QTL結(jié)果一致，本研究所得的葉綠素含量QTLQcc-2A.2的染色體區(qū)間(gwm294-wmc644)也與劉勝男等定位的葉綠素含量Qcc.ahau2-as2[20-21]、趙 朋等[19]定位的葉綠素含量Qcc-2A染色體區(qū)間相吻合。

在耐熱基因定位方面，本研究與Mason等[6]在2A、3B染色體上及與李世平等[5]、Pinto等[22]在7A染色體上檢測(cè)到與耐熱性有關(guān)的QTL結(jié)果相同，但與Rajneesh等[7]和Vijayalakshmi等[23]在7B染色體上檢測(cè)到與耐熱性有關(guān)的QTL結(jié)果不一致。這種差異可能與試驗(yàn)材料、鑒定方法以及QTL定位工具等的不同有關(guān)。

目前，關(guān)于小麥葉綠素含量、穗粒重、千粒重QTL定位的研究報(bào)道較多，而對(duì)小麥組織含水量QTL定位的研究報(bào)道極少。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥灌漿期熱脅迫下控制旗葉含水量、千粒重的QTL均定位在6D染色體 barc196-barc54區(qū)間內(nèi)，均未與前人研究報(bào)道的位點(diǎn)重合或相近。這可能與小麥的基因組較大、抗逆性遺傳比較復(fù)雜有關(guān)，因此應(yīng)該開展多年多脅迫下小麥抗逆性QTL定位，以發(fā)掘更多的抗逆遺傳信息和功能分子標(biāo)記。

近年來(lái)，關(guān)于小麥抗旱、耐熱相關(guān)性狀QTL定位研究報(bào)道較多，但大都局限于單一脅迫。本研究中，小麥抗旱性共定位區(qū)間有2個(gè)，分別位于2A(gwm294-wmc644)和7B(barc140-gwm297)染色體上；耐熱性共定位區(qū)間有2個(gè)，分別位于5D(cfd67-cfd40)和6D(barc196-barc54)染色體上；抗旱耐熱性共定位區(qū)間有3個(gè)，位于2A(gwm294-wmc644)、2B(wmc441-wmc317)和7B(wmc83-wmc276)染色體上。小麥抗旱耐熱性共定位位點(diǎn) gwm294-wmc644(Qcc-2A.2、Qrwc-2A.1)的貢獻(xiàn)率大、遺傳距離較小(6.49 cM)?？购的蜔嵝訯TL定位發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫、熱脅迫、旱熱脅迫下控制旗葉含水量QTL的平均貢獻(xiàn)率位居第一，葉綠素含量的平均貢獻(xiàn)率位居第二，表明旗葉含水量和葉綠素含量對(duì)小麥抗旱耐熱具有重要作用。