蔚 睿，金彥剛，吳舒舒，吳建輝，王琪琳,曾慶東，劉勝杰，夏中華，王曉靜，康振生，韓德俊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌712100;3.江蘇瑞華農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇宿遷 223800;4.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是世界性重要真菌病害，可造成小麥10%～30%產(chǎn)量損失，嚴重時甚至導(dǎo)致絕收[1-2]，是我國黃淮等麥區(qū)小麥主要病害之一，影響我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和糧食安全生產(chǎn)[3-4]。推廣和種植抗病品種是防控該病害最有效且環(huán)境友好的措施。然而，病原菌毒性頻繁變異，常導(dǎo)致小麥品種抗病性“喪失”。自2000年以來，條中32(CYR32)和條中33(CYR33)成為我國小麥條銹菌最主要的流行小種，它們已克服大部分抗病基因，如Yr1、Yr2、Yr3、Yr4、Yr7、Yr9、Yr17、Yr27、Yr31、Yr41、YrSu等[5]，特別是2010年以來，新興小種條中34(CYR34)逐漸上升為當前流行頻率較高的小種，其毒力譜在CYR32和CYR33基礎(chǔ)上又增加了對Yr10、Yr24/Yr26、YrZ4等基因的致病性，毒力更為廣泛[6]。最新報道，在天水地區(qū)田間已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對Yr5基因產(chǎn)生致病性的小種[7]。在抗病育種實踐中，單一抗源或抗病基因大規(guī)模的使用容易導(dǎo)致品種抗性快速喪失，從而引起條銹病的大爆發(fā)流行[2]，因此，準確評估抗病品種或后備品系的抗病基因組成是抗病基因合理布局和利用的基礎(chǔ)。為此，本研究針對2017-2019年度黃淮麥區(qū)小麥育種聯(lián)合體參加區(qū)試的150份小麥品種(系)材料，進行兩年三地的成株期抗條銹性鑒定，同時進行室內(nèi)苗期分小種鑒定，結(jié)合抗病基因分子檢測，鑒定其抗病性水平和抗病類型，分析攜帶何種抗條銹病基因，以期為這些材料在未來生產(chǎn)上推廣應(yīng)用、小麥抗條銹育種及抗病基因合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料主要為參加2017-2019年黃淮麥區(qū)區(qū)試的150份小麥品種(系)(部分已通過品種審定)，由江蘇瑞華農(nóng)業(yè)科技有限公司提供?？箺l銹單基因系和國外鑒別寄主由美國華盛頓州立大學(xué)陳賢明教授惠贈。

供試的條銹菌生理小種CYR33由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所曹世勤研究員提供；CYR32和CYR34為本實驗室經(jīng)單胞分離并由鑒別寄主鑒別后隔離繁殖。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥條銹病鑒定

于2017-2018和2018-2019年兩個小麥生長季，在楊凌設(shè)置人工接種病圃，在甘肅天水和四川江油分別設(shè)置自然誘發(fā)病圃，進行成株期抗病性鑒定。參照文獻[8]方法，楊凌人工病圃于3月下旬噴霧接種條銹菌混合小種(CYR32、CYR33和CYR34)于誘發(fā)行。分別于4月中旬、5月初和5月下旬，調(diào)查江油、楊凌和天水病圃參試材料發(fā)病情況。參照文獻[9-10]的方法，按0～9級標準記載反應(yīng)型(infection type，IT)，其中0～3級為高度抗病(resistant,R),4～6 級為中度抗病(moderate resistant,MR),7級為中度感病(moderate susceptible,MS),8～9 級為高度感病(susceptible,S)。按葉片病斑面積比例記錄嚴重度。參照文獻[9，11]，總體上以反應(yīng)型低于6級及嚴重度低于60%作為成株期抗性(adult plant resistance,APR)評價標準；慢銹性(slow rusting,SR)以反應(yīng)型高于7級及發(fā)病病程緩慢作為評價依據(jù)。參照文獻[9-10]方法在溫室進行苗期分小種鑒定，同樣按0～9級標準只記載反應(yīng)型，以銘賢169作為感病對照。

1.2.2 抗病基因的分子檢測

按文獻[10,12-13]方法和標記信息，采取溫室生長下兩葉期的幼葉(2 cm)，利用改良的CTAB法進行DNA的提取，并進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳的檢測，之后利用Yr5[14]、Yr7[15]、Yr9[16]、Yr10[17]、Yr17[18]、Yr18[19-20]、Yr26[21-22]和YrSP[15]等已知抗病基因的分子標記進行分子檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥抗條銹性鑒定結(jié)果

分別于2017-2018和2018-2019兩個小麥生長季進行成株期抗條銹病鑒定，綜合兩年成株期試驗結(jié)果，以最高發(fā)病等級評價小麥抗病性。150份小麥材料成株期鑒定結(jié)果顯示，在楊凌人工病圃中，分別有40份、22份和88份材料表現(xiàn)為感病(包括高感和中感)、慢銹和抗病(包括高抗和中抗)，分別占總材料數(shù)的26.7%、14.7%和 58.7%；天水自然誘發(fā)病圃中，分別有64份、34份和52份材料表現(xiàn)為感病、慢銹和抗病，分別占總材料數(shù)的42.7%、22.7%和34.7%；江油自然誘發(fā)病圃中，分別有7份、8份和135份材料表現(xiàn)為感病、慢銹和抗病，分別占總材料數(shù)的4.7%、5.3%和90.0%。整合三地鑒定結(jié)果，在三病圃中都表現(xiàn)為成株期抗病和慢銹的材料分別有47和31份(表1)，分別占31.3%和20.7%。

在溫室條件下，苗期分小種抗病鑒定結(jié)果表明，150份材料中，分別有49份、51份和37份苗期對條銹菌生理小種CYR32、CYR33和CYR34表現(xiàn)出抗性(IT≤6)，分別占總材料數(shù)的32.7%、34.0%和24.7%，但未發(fā)現(xiàn)對三個流行小種同時表現(xiàn)抗病的材料。

綜合苗期和成株期抗病性表現(xiàn)，150份黃淮麥區(qū)參試材料中，既沒有對當前流行小種全抗的材料，也沒有全生育期抗病的材料。

2.2 小麥抗條銹基因的檢測結(jié)果

利用已開發(fā)的主效抗病基因Yr5、Yr7、Yr9、Yr10、Yr17、Yr18、Yr26和YrSP的分子標記對全部參試材料進行分子檢測，并結(jié)合表型反應(yīng)進行綜合分析(部分結(jié)果列于表1)。在150份參試材料中，有11份檢測到含有Yr7(占 7.3%)，104份檢測到含有Yr9(占69.3%)，13份檢測到含有Yr17(占8.7%)，5份檢測到含有Yr18(占3.3%)，10份同時檢測到含有Yr9和Yr17(占6.7%)，3份同時檢測到含有Yr9和Yr18(占2%)，2份同時檢測到含有Yr9、Yr17和Yr18(占1.3%)，同時檢測到含有Yr7和Yr17、Yr7和Yr9、Yr9和YrSP的各有1份(分別占 0.7%)，未檢測到含有Yr5、Yr10和Yr26的 材料。

表1 部分具有不同類型抗病性小麥材料及其基因檢測結(jié)果

3 討 論

3.1 黃淮麥區(qū)當前審定的小麥品種抗條銹水平整體提高

黃淮麥區(qū)是中國最重要的小麥產(chǎn)區(qū)，也是小麥條銹病最主要的春季流行區(qū)。該麥區(qū)小麥品種是否具有高水平抗銹性，關(guān)系到當?shù)匦←湴踩a(chǎn)。準確評價小麥新品種(系)抗條銹病水平，不僅為小麥病害預(yù)測預(yù)報和精準防控提供準確信息，而且對小麥開展預(yù)見性抗病育種和抗病基因布局提供依據(jù)。大約10年前，該麥區(qū)小麥品種中具有抗條銹的不足10%[23-24]。本研究對近年黃淮麥區(qū)審定或正在審定的150份小麥品種(系)成株期和苗期的鑒定結(jié)果表明，超過30%的參試品種(系)在三地都具有較穩(wěn)定的成株期抗病性，另外超過20%的品種(系)具有慢銹性，因其是多個Yr基因聚合，因此具有一定的生產(chǎn)利用價值[19]。特別是在楊凌人工病圃(包含了CYR32、CYR33和CYR34)中，58.7%的品種(系)具有成株期抗病性，14.7%品種(系)具有慢銹性。需要說明的是，相對于自然發(fā)病圃，楊凌人工病圃雖然發(fā)病充分，但不能完全模擬自然條件。因為從病原菌群體組成上看，結(jié)構(gòu)較為單一，這造成了品種(系)中抗病比例較高。不過我們在人工病圃中使用的是當前中國最為流行且占主要比例的三個條銹菌小種，品種(系)仍對其呈現(xiàn)良好抗性，且與10年前研究結(jié)果相比[24]，抗病品種比例有了較大提高，說明近年來各育種單位對小麥條銹病抗性育種的重視程度和成效都有較大改進。

3.2 抗病基因合理利用問題

抗病基因賦予小麥品種抗病性，抗病基因的合理利用，是保持抗病性的有效性和持久性的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外已定名出80余個抗條銹病基因，鑒定出200余個抗病QTL[25]。其中哪些抗病基因/QTL已應(yīng)用到中國小麥育種中?黃淮麥區(qū)小麥品種又用了哪些?該區(qū)小麥品種是否攜帶尚未發(fā)現(xiàn)的抗病新基因? 明確這些問題，將有助于我國小麥抗病基因的合理利用。本研究利用已知抗病基因的分子標記對150份參試小麥品種(系)進行分子篩查，并結(jié)合苗期和成株期抗病性鑒定結(jié)果，對參試材料進行抗病基因分析。結(jié)果表明，在150份參試材料中，104份檢測到含有Yr9，5份材料含有Yr18，13份含有Yr17。未檢測到攜帶Yr5、Yr10和Yr26的抗病材料。

于上世紀50年代創(chuàng)制的小麥1B/1R易位系，由于攜帶Yr9/Pm8/Lr26/Sr31抗病基因復(fù)合體，對銹病、白粉等多種病害具有良好抗性，因此在世界多地快速傳播和利用。隨著新毒性小種產(chǎn)生，Yr9抗性逐漸失去作用[26-27]。此外，Yr17來源于偏凸山羊草屬的2NS/2AL易位系，該片段上也發(fā)現(xiàn)很多抗病位點，Yr17單獨存在下已對部分中國條銹小種喪失抗性。然而，一些研究表明，Yr17或者包含Yr17的基因組片段并未完全喪失抗性作用，與其他位點聚合時仍呈現(xiàn)良好抗性。如Liu等[28]發(fā)現(xiàn)，在小麥品種Madsen中含有Yr17的染色體片段對北美的條銹菌小種仍起抗病作用；Wang等[29]對河南的兩個抗條銹品種孟麥58、淮陽1號進行抗病基因定位時發(fā)現(xiàn)兩者都含有Yr17，通過分子標記檢測和系譜分析發(fā)現(xiàn)部分黃淮品種都含有這個位點；而本實驗室前期對陜西區(qū)試品種(系)進行抗條銹病基因分子檢測發(fā)現(xiàn)大部分也含有Yr17[30]。在本研究中很多抗病品種(系)攜帶Yr17，且大部分是以基因聚合的形式存在，如Yr17+Yr18等，這與前人的結(jié)果基本一致。含有Yr17的染色體片段通過基因聚合能夠?qū)崿F(xiàn)小麥品種的廣譜抗病性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，大量抗病性表現(xiàn)良好的品種(系)中，存在眾多未知Yr基因。一方面是由于目前開發(fā)的可檢測已知Yr基因的標記數(shù)量和檢測效率有限，尚無法逐一回答抗病品種攜帶何種抗病基因或基因組合，另一種可能是，參試品種(系)中，存在抗條銹病新基因，但這些都需要進一步的遺傳學(xué)研究方法來確認。

因此，在今后抗源發(fā)掘與利用研究中，一方面加強新抗源的鑒定和轉(zhuǎn)育，同時結(jié)合新技術(shù)，運用分子標記輔助選擇育種和基因編輯等技術(shù)，加快育種進程，創(chuàng)制具有持久、廣譜抗性的小麥材料[31-32]。隨著小麥參考基因組序列的公布，高通量測序技術(shù)、新型分子標記技術(shù)的發(fā)展，為新的抗病位點的挖掘與導(dǎo)入增加了可能性。

4 結(jié) 論

黃淮麥區(qū)近年審定的小麥品種(系)整體抗銹病水平較10年前有較大提高；通過基因聚合是品種抗病性提高的主要原因；同時可能存在尚不能檢測的Yr基因或新基因。在今后的育種過程中，在篩選鑒定新抗源時，應(yīng)同步加強抗病新基因輔助選擇標記的開發(fā)，以提高基因聚合育種的效率，培育持久、廣譜抗性品種。