余 蕾，謝曉芳，彭 芙，謝 君，李夢婷，彭 成,

1成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610075；2四川大學(xué)藥學(xué)院，成都 610021；3西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137

肝纖維化是一種世界性的常見病疾病，以肝內(nèi)纖維結(jié)締組織的異常增生為病理特征，主要是由于酒精肝、脂肪肝、病毒性肝炎、膽汁淤積性和代謝性肝損傷等刺激肝臟產(chǎn)生慢性炎癥，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，致使ECM的過度積累，從而導(dǎo)致肝纖維化[1-3]。目前，肝纖維化的治療主要通過抗炎、抗病毒、減少ECM沉積等方式，但這些治療效果并不理想，因此尋找有效的抗纖維化方法仍是當(dāng)前的首要任務(wù)。

趕黃草又名水澤蘭、水楊柳等，是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜(PenthorumchinensePursh)的干燥地上部分，始載于明代《救荒本草》[4]，具有清熱活血、祛濕退黃、利水消腫等功效，可用于黃疸，水腫，跌打腫傷，以及各型肝炎、膽囊炎、脂肪肝等[5]。臨床上有文獻(xiàn)報(bào)道以趕黃草制成的單味成方制劑“肝蘇顆?！蹦苊黠@改善慢性乙肝肝纖維化患者臨床癥狀，具有降酶、退黃、促進(jìn)肝功能恢復(fù)等作用，且對阻斷及逆轉(zhuǎn)肝纖維化有一定療效[6,7]。課題組前期研究也證明“肝蘇顆?！睂Cl4誘導(dǎo)所致的大鼠肝纖維化有顯著的治療作用，可改善肝功能、減輕肝臟纖維化病變。現(xiàn)代研究表明，趕黃草中主要含有黃酮、生物堿、多糖等成分，因黃酮成分含量較高且具有較強(qiáng)的抗氧化活性所以被廣泛研究[8]。目前已有研究表明趕黃草總黃酮可抑制大鼠酒精性肝纖維化的形成，其抗肝纖維化作用可能與其抗氧化作用及抑制TNF-α和IL-6的分泌有關(guān)[5]。但是，趕黃草總黃酮治療肝纖維化的具體作用機(jī)制尚不清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)選用LX-2作為研究對象，采用TGF-β1刺激LX-2活化建立肝纖維化細(xì)胞模型，研討趕黃草總黃酮抗肝纖維化的作用及可能的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

黃草總黃酮(total flavonoids ofPenthorumchinensePursh，TFPCP)，趕黃草購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司，由成都搏屹科技有限公司提取，測得提取物中總黃酮的含量為55.3%。實(shí)驗(yàn)前將趕黃草總黃酮粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)中，使用時(shí)稀釋成所需濃度，各給藥組中DMSO濃度均小于0.1%。

表1 趕黃草總黃酮含量測定結(jié)果

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HSC-LX2(蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：BNCC337957)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Human TGF-β1(美國Pepro Tech 公司)、FBS(美國Gibco公司)、RPIM-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、MTT(德國Biofroxx公司)、Ⅰ型鼠尾膠原(杭州欣友生物技術(shù)有限公司)、α-SMA(Actin alpha，smooth muscle aorta)、FN、Col Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢Elabscience 公司)、兔抗Smad7多克隆抗體(美國Proteintech公司)、兔抗Smad2、phospho-Smad2、Smad3、phospho-Smad3、α-SMA抗體(美國Cell Signaling Technology公司)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)、酶標(biāo)定量分析儀(Thermo公司)、MiLL-Q純水儀(Millipore公司)、SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái)(蘇凈安泰集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、倒置顯微鏡(德國蔡司公司)、電泳儀(Bio-Rad公司)、凝膠成像儀(廣州博鷺滕公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞分組及處理

LX2細(xì)胞用含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中將趕黃草總黃酮藥物濃度設(shè)定為5、10、15、20 mg/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)濃度超過15 mg/L細(xì)胞毒性較大，而在濃度為10 mg/L時(shí)細(xì)胞存活率較高，故降低濃度間距，采用5、9、13 mg/L三個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+趕黃草總黃酮5、9、13 mg/L組，除空白對照組以外，其余各組均使用TGF-β1(6 ng/L)處理24 h造模，造模成功后給予不同濃度的趕黃草處理24 h。

2.2 細(xì)胞活力測定

將細(xì)胞消化并重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，次日晨給予TGF-β1，作用24 h后分別給予不同濃度的趕黃草總黃酮，給藥結(jié)束后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL，避光孵育4 h后將細(xì)胞液全數(shù)吸出，每孔加入150 μLDMS0，搖床上震蕩混勻，用酶標(biāo)儀在波長為570 nm處測量OD值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(給藥組A-調(diào)零孔A)/(空白組A-調(diào)零孔A)×100%。

2.3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

用標(biāo)記筆在6孔板背面等距離畫3條間隙為0.5 cm的虛線，用于后續(xù)拍照選取視野時(shí)定位。以1×106個(gè)/mL種板，次日給予TGF-β1造模，24 h后用10 μL的槍尖沿背面虛線在孔底畫線，然后將培養(yǎng)液吸出，用無菌PBS輕輕沖洗將細(xì)胞碎片洗掉，分別加入含有不同濃度的趕黃草總黃酮的培養(yǎng)基，此時(shí)顯微鏡下選取視野進(jìn)行拍照。培養(yǎng)24 h后，選擇與第一次拍照相同的視野再次拍照。用Image J軟件測量劃痕的寬度。

2.4 細(xì)胞分泌ECM含量測定

將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于24孔板，藥物作用完畢后將細(xì)胞上清液收集起來，離心去除細(xì)胞雜質(zhì)，然后4 ℃保存?zhèn)溆?，于一周?nèi)檢測。檢測具體操作方法按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 膠原收縮試驗(yàn)

因LX-2活化后產(chǎn)生的ECM可使膠原收縮，增加血管阻力、促進(jìn)門脈高壓[9]，故可通過體外建立三維膠原，研究趕黃草總黃酮對膠原收縮的影響。將Ⅰ型鼠尾膠原以300 μL/孔鋪滿24孔板底，待膠原凝固后每孔加500 μL培養(yǎng)液平衡膠原。將細(xì)胞將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于板內(nèi)，造模完成后用槍頭沿膠原邊緣劃一圈，使膠原與板壁分離，然后給藥處理，藥物作用完畢后進(jìn)行拍照，觀察膠原收縮情況。

2.6 TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白測定

細(xì)胞培養(yǎng)完成后用冰PBS清洗3遍，刮取細(xì)胞后離心，向沉淀中加入含有1%磷酸酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解30 min提取總蛋白；測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)移，用5% BSA室溫封閉1 h，一抗4 ℃中過夜；次日用TBST洗三次后，每次8 min；二抗室溫孵育1 h，然后TBST洗三次，用凝膠成像儀曝光并拍照。用Image J測量條帶的灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，與空白組相比，TGF-β1處理可促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)，而給予藥物作用后，各組細(xì)胞增殖均降低，且藥物濃度越高，抑制作用越明顯，在9 mg/L時(shí)有顯著抑制作用(P<0.05)。說明趕黃草總黃酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2的增殖。

圖1 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后的LX-2細(xì)胞活力的影響

3.2 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞遷移和膠原收縮能力的影響

表2與圖2示，與空白組相比，TGF-β1刺激后，細(xì)胞劃痕愈合率明顯增加(P<0.01)；而在給藥處理的各組中，劃痕愈合率與單純給TGF-β1組相比明顯降低，在9 mg/L時(shí)抑制作用顯著(P<0.01)，說明趕黃草總黃酮可抑制LX-2的遷移。

圖2 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后LX-2細(xì)胞遷移的影響

表2 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后的LX-2后的劃痕愈合率

如圖4示，與空白組相比，單純給予TGF-β1刺激組，膠原收縮明顯增加，而趕黃草總黃酮作用后的各組與單純TGF-β1組相比較，膠原的收縮被明顯抑制，作用效果呈劑量依賴，在9 mg/L時(shí)抑制用顯著(P<0.01)。

圖3 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后LX-2細(xì)胞膠原收縮的影響

圖4 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞分泌FN和Col I含量的影響

3.3 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2分泌FN和Col I含量的影響

圖4結(jié)果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1刺激后，細(xì)胞分泌FN及ColⅠ顯著增加(P<0.01)，而在給予藥物作用的各組里，F(xiàn)N及ColⅠ含量顯著減少(P<0.01)，說明趕黃草總黃酮可抑制FN及ColⅠ的沉積。

3.4 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞TGF-β1/Smads 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5結(jié)果顯示 在給予TGF-β1作用后，α-SMA分泌明顯增加(P<0.05)，而給予藥物作用后，α-SMA分泌被抑制。另外，TGF-β1作用后，Smad3、p-Smad2和p-Smad3均顯著增加(P<0.01)，而給予藥物作用后，其表達(dá)均有不同程度減少；Smad7在TGF-β1作用后則顯著減少(P<0.05)，而給予不同濃度藥物作用后Smad7的分泌有一定程度的提升，且在藥物濃度達(dá)到9 mg/L時(shí)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞分TGF-β1/Smads 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

HSC-LX2是分布在肝臟各處的常駐的周圍型細(xì)胞，在肝損傷過程中，LX-2被激活成肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量α-SMA、ColⅠ等ECM，從而導(dǎo)致肝纖維化[10-13]。TGF-β1是一類能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的因子，可活化肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)膠原基因表達(dá)、增加ECM沉積，是最重要的促肝纖維化細(xì)胞因子之一[14,15]。TGF-β1主要通過TGF-β1/Smads信號(hào)通路促進(jìn)肝纖維化發(fā)展，TGF-β1與肝星狀細(xì)胞表面受體結(jié)合，然后催化其下游Smad分子磷酸化，接著，磷酸化的Smad進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)其相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致ECM產(chǎn)生[16,17]。Smad家族中Smad2和Smad3為受體激活型蛋白，可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程；而Smad7則是一種抑制型蛋白，過表達(dá)可阻止Smad2和Smad3的磷酸化，抑制信號(hào)通路，減緩肝纖維化進(jìn)程[18]。

本實(shí)驗(yàn)中，體外培養(yǎng)的LX-2在TGF-β1刺激后，細(xì)胞增殖及遷移速率顯著增加，F(xiàn)N、Col I等細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，膠原收縮明顯增加，說明TGF-β1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化建立肝纖維化模型成立。而在給予趕黃草總黃酮處理后，細(xì)胞增殖和遷移速率被抑制，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積顯著減少，膠原收縮明顯降低，說明趕黃草總黃酮可抑制肝星狀細(xì)胞的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，降低血管阻力，減緩肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。此外，Western blot實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β1作用后，Smad3、p-Smad2和p-Smad3表達(dá)均顯著增加，Smad7表達(dá)則顯著減少，可以說明TGF-β1/Smads信號(hào)通路被激活，而在給予趕黃草總黃酮處理后，Smad3、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)均明顯減少，Smad7的表達(dá)則明顯提升，說明趕黃草可抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路。

綜上所述，趕黃草總黃抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和遷移，減少ColⅠ及FN等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，機(jī)制與其抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路有關(guān)。這可能是趕黃草治療肝纖維化的機(jī)制之一。