王雅冰 趙孟杰 孫景武 石林昌

河北中石油中心醫(yī)院肝膽外科 (河北 廊坊，065000)

目前臨床上治療肝癌的有效方法主要是手術(shù)及肝移植，但即使手術(shù)成功，患者仍需要長時間恢復(fù)[1]。鳥嘌呤核苷酸抑制因子2(RhoGDI2)是小G蛋白調(diào)節(jié)因子家族成員之一[2]，是一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子[3]。有研究報道RhoGDI2在胃癌、肺癌及乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平并不一致，但關(guān)于RhoGDI2在肝癌組織中的表達(dá)情況及其作用并無相關(guān)報道。本文在相關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上[4]，進(jìn)一步研究RhoGDI2基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平是否受miRNAs的調(diào)控；通過一系列實驗下調(diào)RhoGDI2表達(dá)，研究相關(guān)表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 選取高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株HCCLM3細(xì)胞，隨機(jī)分為對照組、空白轉(zhuǎn)染組、shRNA轉(zhuǎn)染組，其中空白轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，shRNA轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染RhoGDI2-shRNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌HCCLM3細(xì)胞在含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基、5% CO2飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。腺病毒感染：按每細(xì)胞5病毒感染，HCCLM3細(xì)胞鋪6孔板，待底面積上細(xì)胞長至80%時，用AdNDRG2或AdLacZ處理48 h(病毒感染量為5 MOI)。siRNA轉(zhuǎn)染：HCCLM3細(xì)胞鋪6孔板，待底面積上細(xì)胞長至80%時，運用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA-NDRG2或siRNA-NC作用細(xì)胞48 h。

1.2.2 細(xì)胞侵襲、遷移試驗 將腺病毒或siRNA作用48 h后的肝癌細(xì)胞種于使用Matrigel膠預(yù)處理的24孔Transwell上層小室，加入無血清培養(yǎng)液500 μl，加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液于下層小室中。24 h后將培養(yǎng)液倒出，乙醇固定Transwell 15 min后龍膽紫染色10 min,最后用棉簽去除上層小室底壁上的細(xì)胞，光鏡下計數(shù)通過Matrigel膠侵襲到下層中的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)以上實驗3次。

1.2.3 Western Blot檢測[5]將對照組和處理組的HCCLM3細(xì)胞用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液清洗2遍，加細(xì)胞裂解液。用干凈的細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，吹打，混勻，收集細(xì)胞裂解液于1.5 ml離心管中。95℃孵育5 min，立即在冰上冷卻。超聲8 s，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清蛋白提取液，-80℃保存并做好記錄。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定，參照 BCA 蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行[6]。

1.2.4 qRT-PCR檢測[7]提取細(xì)胞總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行qPCR 。qPCR擴(kuò)增體系設(shè)置為20 μl體系，cDNA模板不稀釋，內(nèi)參基因為GAPDH。觀察擴(kuò)增曲線及熔解曲線。從擴(kuò)增曲線可以看出，4個復(fù)孔的熒光值曲線擬合良好，CT值接近，說明反應(yīng)體系穩(wěn)定，可重復(fù)性好，結(jié)果可靠。從熔解曲線可以看出，曲線為一個主峰，曲線頂峰溫度穩(wěn)定，說明擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性。計算 2-△△CT，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞RhoGDI2 mRNA表達(dá)情況 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RhoGDI2 mRNA相對表達(dá)量為(0.201±0.082)，明顯低于對照組(0.760±0.130)和空白轉(zhuǎn)染組(0.763±0.121)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.011，P<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)6 h、12 h和24 h時OD值明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞不同時間點OD值比較

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率為(0.310±0.030)%，明顯低于對照組(0.708±0.041)%和空白轉(zhuǎn)染組(0.710±0.031)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.182，P<0.05)。見彩插頁圖1。

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為(9.28±1.11)個，明顯低于對照組(42.01±13.10)個和空白轉(zhuǎn)染組(44.92±12.90)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.192，P<0.05)。見彩插頁圖2。

2.5 各組細(xì)胞MMP-9、pAKT和VEGF表達(dá) shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞MMP-9、pAKT和VEGF相對表達(dá)量明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 各組細(xì)胞MMP-9、pAKT和VEGF表達(dá)比較

A：對照組 B：空白轉(zhuǎn)染組 C：shRNA轉(zhuǎn)染組

3 討論

肝癌的致病因素各種各樣，發(fā)病機(jī)制不明[8]，也缺乏判斷其發(fā)病原因的有效指標(biāo)。肝癌的早期診斷對肝癌治療具有重要作用。隨著腫瘤基因組學(xué)的發(fā)展，人們便對腫瘤的發(fā)展及機(jī)制有了更全面的認(rèn)知，也為腫瘤的早期診斷和基因治療提供了理論基礎(chǔ)。已有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要分子學(xué)機(jī)制是癌基因的異常表達(dá)和抑癌基因表達(dá)的明顯減少甚至缺失[9]?，F(xiàn)階段肝癌的研究主要集中在識別與發(fā)現(xiàn)和肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的特異性基因，并以此為靶點尋找肝癌的早期診斷方法和有效治療手段。肝癌發(fā)生的重要原因主要是正常肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及凋亡調(diào)控功能的異常，因此對凋亡調(diào)控失調(diào)的相關(guān)研究可能找到治療腫瘤的方法[10]。機(jī)體內(nèi)外的多種因素均可能影響甚至改變細(xì)胞凋亡進(jìn)程，對這些因素的干預(yù)可以在不同的節(jié)點上調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程和數(shù)量。RhoGDI2基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮著重要的作用，已有研究證實了RhoGDI2基因與細(xì)胞的生長和分化相關(guān)，但在不同癌癥組織中RhoGDI2 的作用并不相同，作用途徑亦各有區(qū)別，還與腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲有極大的聯(lián)系[11]。同時RhoGDI2在缺氧和應(yīng)激反應(yīng)中也有著重要作用，是樹突狀細(xì)胞抑制T淋巴細(xì)胞增殖所必需的共同刺激信號，也是醛固酮對腎遠(yuǎn)曲小管和集合管的水鈉代謝調(diào)節(jié)的重要紐帶[12]。

本研究結(jié)果顯示，shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RhoGDI2 mRNA相對表達(dá)量、OD值、穿膜細(xì)胞數(shù)，MMP-9、pAKT和VEGF表達(dá)明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組，說明 RhoGDI2基因與肝癌的的發(fā)生、增殖及侵襲過程呈正相關(guān)，RhoGDI2會影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，因此研究RhoGDI2基因?qū)⒂兄诩由顚Ω伟┣忠u轉(zhuǎn)移機(jī)制的了解，并為肝癌特異性和多靶位的治療方法研究提供理論基礎(chǔ)[13]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步從mRNA水平探索RhoGDI2對肝癌遷移和侵襲能力的影響，提示該基因可能參與了肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生和發(fā)展，具有一定的創(chuàng)新性和臨床指導(dǎo)意義。