尹文秀 ，張明哲，樓成杰，王金磚，于文濤，胡美玲，吳 姍，虞惠貞，許 瑾，張曉峰，李明福

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；2.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210000；3.福州海關(guān)，福建 福州 350001；4.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

紅豆杉屬Taxus植物隸屬于紅豆杉科Taxaceae，為常綠喬木或灌木，是第三紀(jì)孑遺植物[1]，含有多種藥用成分[2]。紅豆杉屬植物廣泛分布于歐洲、北美洲及東亞等北半球地區(qū)，在全世界有11種，分別為球果紅豆杉T.globosa，短葉紅豆杉T.brevifolia，歐洲紅豆杉T.baccata，加拿大紅豆杉T.canadensis，佛羅里達(dá)紅豆杉T.floridana和曼地亞紅豆杉T.×Media[2]。我國有3種2變種，即密葉紅豆杉T.funana，東北紅豆杉T.cuspidata，西藏紅豆杉T.wallichiana，紅豆杉T.wallichianavar.chinensis和南方紅豆杉T.wallichianavar.maire[3-4]，均為《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）》中的I級重點(diǎn)保護(hù)野生植物[5]。

近年來，紅豆杉屬植物的藥用價(jià)值得到了廣泛關(guān)注和深入研究。1971年，首次從短葉紅豆杉樹皮中提取出的紫杉醇，是迄今為止最成功的抗癌藥物之一[6-7]，然而紅豆杉屬樹種耐蔭性強(qiáng)，在天然林中生長緩慢，分布星散，野生樹木更是日漸減少[8]。紅豆杉物種有限的自然資源限制了紫杉醇的提取[9-10]，供需矛盾日益突出。為更好地加強(qiáng)對紅豆杉屬植物的保護(hù)和利用，開展準(zhǔn)確鑒定必不可少。DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是利用標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)或多個(gè)DNA片段進(jìn)行物種鑒定及探索其親緣進(jìn)化關(guān)系的方法[11-13]，劉潔等選取了rbcl，matk，trnH-psbA，trnL-F和internal transcribed spacer（ITS）5對引物對歐洲和亞洲的紅豆杉進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明trnl-F和ITS這兩對引物可單獨(dú)使用或者結(jié)合起來對歐洲和亞洲紅豆杉進(jìn)行鑒別[14]。本研究采用DNA條形碼技術(shù)開展對紅豆杉屬植物的準(zhǔn)確鑒定，依據(jù)劉潔等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合蔣敏捷等的方法[14-15]，選用ITS1-18S開展紅豆杉屬植物的鑒別，可直接區(qū)分南方紅豆杉、東北紅豆杉和歐洲紅豆杉3種紅豆杉屬植物。此研究為口岸快速篩查和鑒定提供了新型的技術(shù)方法，方法便捷可靠，同時(shí)對促進(jìn)物種資源的保護(hù)和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于2017年3月，先后于上海植物園、杭州植物園、南京植物園和浙江省林業(yè)科學(xué)研究院進(jìn)行采樣，每棵樹采集一年生新鮮枝條1份。于上海植物園采集南方紅豆杉樣品1份，編號(hào)為H1；采集東北紅豆杉樣品1份，編號(hào)為D1；采集歐洲紅豆杉樣品1份，編號(hào)為EU1。于杭州植物園采集南方紅豆杉樣品1份，編號(hào)為H2。于南京植物園采集南方紅豆杉樣品1份，編號(hào)為H3，采集歐洲紅豆杉樣品1份，編號(hào)為EU2。于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院采集南方紅豆杉樣品1份，編號(hào)為H4。于截獲入境東北紅豆杉盆栽采集樣品1份，編號(hào)為D2。采集到樣品共計(jì)8份。實(shí)驗(yàn)樣品從采集的枝條上隨機(jī)選取葉片，清洗干凈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）試劑盒開展DNA提取。樣品前處理需對供試樣品表面進(jìn)行酒精噴灑消毒，然后將植物葉片在室溫下研磨成粉末狀，后參照試劑盒說明書繼續(xù)操作。提取之前按照試劑盒的要求，先將Qiagen試劑盒中的Buffer AP1置于65℃水浴鍋中預(yù)熱。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測序 擴(kuò)增 ITS1-18S序列正向引物：5’-GCGGTAGGATCATTGTCG-3’，反向引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為試劑20 μL體系[大連寶生物（TaKaRa Ex Taq）提供]，10×Ex Taq Buffer 2.0 μL（Mg2+plus），dNTPs 1.6 μL（2.5 mmol·L-1），引物各0.4 μL（20 μmol·L-1），ddH2O 13.5 μL，Taq酶0.1 μL （5 U·μL-1），DNA模板2 μL（10～ 30 ng·μL-1）。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 同一采集地樣品名稱相同的不同株樣品其序列相近[16]，所以每個(gè)采集地同一物種采集一個(gè)樣品進(jìn)行序列比對。樣品包括南方紅豆杉4個(gè)，H1，H2，H3，H4；東北紅豆杉2個(gè)，D1，D2；歐洲紅豆杉2個(gè)，EU1，EU2。用DNAMAN（Version 6.0.3.99）軟件對所得序列進(jìn)行多重比對。同時(shí)從GenBank中獲得的與樣品ITS1-18S序列同源性高的序列（見表1），對這些序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，其中，加入作為外群的紅豆杉科白豆杉屬Pseudotaxus植物白豆杉P.chienii。

采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建ITS1-18S序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（boostrap1 000次重復(fù)）。

表1 從GenBank獲取ITS1-18S序列物種名稱及其登錄號(hào)Table 1 The names and the accessions of ITS1-18S sequences of relative species from GenBank

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS1-18 S序列擴(kuò)增結(jié)果

本文依據(jù)劉潔等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合蔣敏捷等的方法[14-15]合成通用引物ITS1-18S（表1），選取同一采集地的不同樣品H1，D1和EU1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增長度約為1 100 bp左右，如圖1所示。

2.2 序列比對結(jié)果分析

將測序所得樣品的ITS1-18S序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，H1，H2，H3，H4；D1，D2和EU1，EU2樣品的ITS1-18S序列分別與南方紅豆杉、東北紅豆杉、歐洲紅豆杉的ITS1-18S序列的最大匹配率達(dá)到99%～ 100%。

將H1，H2，H3，H4；D1，D2和EU1，EU2樣品的ITS1-18S序列與紅豆杉屬3個(gè)種的6條序列進(jìn)行同源序列比對，舍去兩端未對應(yīng)的序列，共獲得1 009 bp序列信息，其中包括27個(gè)變異位點(diǎn)（圖2）；序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測未知樣品ITS1-18S序列分別與紅豆杉屬序列相似性最高，達(dá)到99%～ 100%，遺傳距離最小，為0.00～ 0.01?？梢钥闯?，H1，H2，H3，H4樣品與南方紅豆杉的關(guān)系比較近，D1，D2樣品與東北紅豆杉的關(guān)系比較近，EU1，EU2樣品與歐洲紅豆杉的關(guān)系比較近。

圖1 H1，D1 和EU1 的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR amplification result of sample H,D and EUe EU

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過DNAMAN軟件，采用鄰接法構(gòu)建ITS1-18S序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣檢測其置信度。從構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖3）可以看出，同一物種的紅豆杉屬植物均能聚集在同一分支內(nèi)，且均獲得較高的支持率（＞90%）。其中，樣品H1，H2，H3，H4與南方紅豆杉ITS1-18S序列聚為一枝，EU1，EU2與歐洲紅豆杉ITS1-18S序列聚為一枝，其bootstrap values分別為99%和95%。D1，D2與東北紅豆杉ITS1-18S序列聚為一枝；白豆杉單獨(dú)一枝。

3 結(jié)論與討論

將不同采集地的H1，H2，H3，H4樣品，D1，D2樣品和EU1，EU2樣品分別與南方紅豆杉、東北紅豆杉和歐洲紅豆杉3個(gè)種的6條序列進(jìn)行同源序列比對，結(jié)果表明，所測樣品的ITS1-18S序列分別與紅豆杉屬的南方紅豆杉、東北紅豆杉和歐洲紅豆杉序列相似性最高，達(dá)到99%～ 100%，遺傳距離最小，為0～ 0.01。而且從構(gòu)建的ITS1-18S序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹也可以看出，H1，H2，H3，H4樣品和南方紅豆杉聚為一枝；D1，D2樣品與東北紅豆杉聚為一枝；EU1，EU2樣品與歐洲紅豆杉聚為一枝；白豆杉單獨(dú)一枝。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以判定H1，H2，H3，H4樣品為南方紅豆杉；D1，D2樣品為東北紅豆杉；EU1，EU2樣品為歐洲紅豆杉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各樣品的樹種與采集地樣品的信息完全一致，通過ITS1-18S引物可以從分子水平對紅豆杉屬植物進(jìn)行區(qū)分和鑒定，此方法切實(shí)可行。

圖2 紅豆杉屬ITS1-18S序列比對結(jié)果Figure 2 Sequence alignment of ITS1-18S of Taxus

DNA條形碼技術(shù)是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充，此方法不受個(gè)體形態(tài)、大小等特征和完整性的影響，也就避免了形態(tài)學(xué)鑒定中存在的局限性，能直接從基因水平上提供豐富的鑒別依據(jù)，可有效區(qū)分種間差異[11]。張明哲等設(shè)計(jì)了南方紅豆杉的特異性引物和探針，通過實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒別南方紅豆杉，但該引物探針僅能鑒定南方紅豆杉和其原始種西藏紅豆杉，而無法對紅豆杉屬其他種進(jìn)行區(qū)分[17]。而本研究基于真核生物的核糖體基因rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的高保守性選取ITS序列進(jìn)行植物物種的分子鑒定，通過DNA條形碼技術(shù)可對未知植物樣品進(jìn)行篩選，可快速將物種范圍鎖定至紅豆杉屬，彌補(bǔ)了南方紅豆杉特異性引物探針局限性的缺陷。我國紅豆杉屬植物大部分位列于瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約（CITES）附錄Ⅱ中[18]。所以此法可建立快速、簡便、準(zhǔn)確、適合于口岸查驗(yàn)的鑒定方法，有效保護(hù)和利用生物資源。后期可進(jìn)一步研究探索，在初篩結(jié)果上結(jié)合紅豆杉屬不同種間的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定或設(shè)計(jì)紅豆杉屬不同種的特異性引物探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒別。

圖3 基于ITS1-18S序列構(gòu)建紅豆杉科間的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of Taxaceae by ITS1-18S sequences