胡琪瑤 ，范曉聰，楊 麗，阮 曉，章建紅，王 強(qiáng)，鄭炳松

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙大寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100）

近百年來，人類使用化學(xué)除草劑有效控制了多種雜草危害，但化學(xué)合成除草劑的大量使用也引發(fā)了環(huán)境污染、雜草耐藥性增強(qiáng)、對非目標(biāo)生物毒害等一系列嚴(yán)重環(huán)境問題。天然生物除草劑具有生產(chǎn)原料來源廣泛，對非靶標(biāo)生物安全、毒副作用小、環(huán)境兼容性好等特點(diǎn)，已成為全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢。4-8-二羥基-1-四氫萘酮（4,8-DHT）作為一種天然產(chǎn)物最初由Findlay等[1]從小柱孢屬Scytalidium物種中分離出來，隨后又從多種真菌以及植物中分離純化。Eduardo等[2]通過理論計(jì)算發(fā)現(xiàn)其具有兩種不同的構(gòu)型，分別為R-(-)-(4R)-4,8-DHT（Regiolone）和S-(+)-(4S)-4,8-DHT（Isosclerone）。生物學(xué)活性研究表明，4,8-DHT對肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有一定的體外增殖抑制作用[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)山核桃外果皮水提取物對雙子葉植物萵苣Lactuca sativa，蘿卜Raphanus sativus，黃瓜Cucumis sativus和單子葉植物洋蔥Allium cepa，稻Oryza sativa，普通小麥Triticum aestivum的種子萌發(fā)和幼苗生長存在抑制作用。其外果皮水提取物經(jīng)X-5大孔樹脂分離，乙醇水溶液梯度洗脫，利用萵苣種子萌發(fā)與幼苗生長指標(biāo)作為除草活性篩選參數(shù)，發(fā)現(xiàn)11個洗脫組分中以6:4，5:5，4:6，3:7的洗脫相活性最強(qiáng)，硅膠柱層析和葡聚糖凝膠色譜組合分離純化目標(biāo)組分，利用UPLC，NMR，GC-MS等技術(shù)手段組合解析活性組分結(jié)構(gòu)為4,8-DHT[4]。目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)Chiral OD-H手性色譜柱拆分，獲得消旋體S-(+)-Isosclerone和R-(-)-Regiolone，S-(+)-Isosclerone對測試植物反枝莧Amaranthus retroflexus，牛筋草Eleusine indica，百喜草Paspalum notatum，香附子Cyperus rotundus和西伯利亞剪股穎Agrostis stolonifera抑制活性高于R-(-)-Regiolone[5-7]。Zhang等建立了以1,5-二羥基萘為原料，五步法合成4,8-DHT外消旋體及結(jié)構(gòu)改造物5-羥基-4-氧代-1,2,3,4-四氫萘-1-苯甲酸乙酯、8-羥基-4-(3-羥基丙氧基)-1-四氫萘酮、8-羥基-4-(2,3-二羥基丙氧基)-1-四氫萘酮、5-羥基-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-苯甲酸乙酯、4-羥基-8-(3-羥基丙氧基)-1-四氫萘酮和4-羥基-8-(2,3-二羥基丙氧基)-1-四氫萘酮的化學(xué)合成方法[7-8]，并分別在實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證了這些新結(jié)構(gòu)化合物的除草活性。

除草劑室內(nèi)生物測定方法普遍采用培養(yǎng)皿法（種子萌發(fā)法），目標(biāo)除草劑處理雜草種子，通過發(fā)芽率、鮮質(zhì)量、根或莖的抑制情況計(jì)算抑制中濃度，判斷目標(biāo)除草劑的生物活性。除草劑田間生物測定方法則根據(jù)《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）》[9]在特定田地間對靶標(biāo)生物施用目標(biāo)除草劑，在不同時期分別測量靶標(biāo)生物的株防效、鮮質(zhì)量防效等參數(shù)來判斷田間試驗(yàn)的藥效。本試驗(yàn)依據(jù)《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）中除草劑防除林地雜草》（GB／T17980.48-2000）設(shè)置試驗(yàn)處理，以覆蓋率、株防效為評價指標(biāo)，研究4,8-DHT對東京櫻花Cerasus yedoensis及紫薇Lagerstroemia indica林地中雜草的防除效果，以期為潛在除草活性物質(zhì)4,8-DHT的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)并可提高山核桃外果皮的附加值。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑4,8-DHT（純度＞97%）為實(shí)驗(yàn)室制備，配置濃度分別為9，18，36 mmol·L-1；對照藥劑41%草甘膦異丙胺鹽由河北廊坊中國農(nóng)科院研究基地提供。

2.2 試驗(yàn)地概況

4,8-DHT田間試驗(yàn)在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院林科所實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。該基地位于浙江省寧波市橫溪鎮(zhèn)大岙村，地理坐標(biāo)為121°35′ E，29°40′ N，試驗(yàn)地總面積為10.67 hm2。年均氣溫為16.2℃，年均降水量為1 538.8 mm，年均雨日為174 d，年均日照為2 070 h，無霜期為238 d。土壤表層（0～ 15 cm）的基本理化性質(zhì)為：pH 6.0，電導(dǎo)率88.5 μs·cm-1，有機(jī)質(zhì)43.8 g·kg-1，全氮1.3 g·kg-1，全磷0.7 g·kg-1，全鉀22.8 g·kg-1，堿解氮131.0 mg·kg-1，速效磷62.6 mg·kg-1，速效鉀128.0 mg·kg-1。

試驗(yàn)地為含8科11屬14種雜草的東京櫻花（下文簡稱櫻花）林地（面積1 258.8 m2，郁閉度0.69）及含7科7屬8種雜草的紫薇林地（面積1 080 m2，郁閉度0.26）。其中，櫻花林地雜草主要以牛筋草，香附子，水虱草Fimbristylis littoralis，母草Lindernia crustacea，耳草Hedyotis auricularia，碎米薺Cardamine hirsuta，陌上菜Lindernia procumbens，擬鼠麴草Pseudognaphalium affine，車前Plantago asiatica，通泉草Mazus pumilus，小蓬草Conyza canadensis，匙葉合冠鼠麴草Gamochaeta pensylvanica，球序卷耳Cerastium viscosum，泥花草Lindernia antipoda為主；紫薇林地主要以牛筋草，香附子，水虱草，母草，耳草，馬松子Melochia corchorifolia，馬唐Digitaria sanguinalis，丁香蓼Ludwigia prostrata為主。

2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)《農(nóng)藥田間藥效準(zhǔn)則（一）中除草劑防治林地雜草》（GB/T17980.48-2000）設(shè)計(jì)試驗(yàn)。對照藥劑為41%草甘膦異丙胺鹽（以下簡稱草甘膦），濃度為18 mmol·L-1（A）；供試藥劑4,8-DHT濃度分別為9 mmol·L-1（B），18 mmol·L-1（C），36 mmol·L-1（D），以清水為對照（CK）。櫻花林地小區(qū)面積為50 m2，小區(qū)間隔0.5 m，紫薇林地小區(qū)面積為50 m2，小區(qū)間隔0.5 m，4次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。每小區(qū)用藥（水）量為0.225 L·m-2。

2.4 施藥方法

4,8-DHT林地除草試驗(yàn)時間為2018年6-9月，試驗(yàn)前期調(diào)查雜草種類及株數(shù)，并進(jìn)行施藥前人工松土，于2018年7月12日雜草萌芽前對土壤施藥一次，于8月2日對雜草幼苗莖葉噴施藥一次。試驗(yàn)期間不施用其他任何藥劑。

雜草萌芽前土壤施藥方法：施藥前人工松土，土壤地面噴霧，施藥當(dāng)天（7月12日）晴，施藥后3 d無雨。

雜草幼苗莖葉噴施藥方法：人工松土20 d后，對雜草2～ 3葉期的幼苗莖葉噴霧施藥，施藥當(dāng)天（8月2日）晴，施藥后3 d無雨。

2.5 調(diào)查及統(tǒng)計(jì)方法

在櫻花林地及紫薇林地每個試驗(yàn)小區(qū)固定3個調(diào)查樣方，每個樣方面積1 m×1 m，施藥后8，12，16，20 d時觀察雜草生長情況，用佳能EOS 80D相機(jī)分區(qū)拍照；施藥后8，20 d統(tǒng)計(jì)林地雜草殘存種類及株數(shù)。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，利用Excel及SPSS軟件計(jì)算雜草株防治效果（以下簡稱株防效），并進(jìn)行方差分析及多重比較，通過雜草覆蓋率大小可判斷雜草防除效果。計(jì)算方法如下：

圖像計(jì)算雜草覆蓋率：根據(jù)拍攝的調(diào)查樣方，Ecognition分類軟件提取雜草面積，計(jì)算雜草的覆蓋率。

3 結(jié)果與分析

3.1 4,8-DHT對櫻花林地雜草覆蓋率的影響

根據(jù)拍攝的4,8-DHT處理櫻花林地雜草調(diào)查樣方（圖1），計(jì)算櫻花林地雜草覆蓋率，結(jié)果如圖2。4,8-DHT處理后，櫻花林地雜草覆蓋率均有所降低，且具有濃度依賴性，4,8-DHT處理濃度越高，雜草覆蓋率越低。雜草萌芽前對土壤施藥的雜草覆蓋率明顯低于雜草幼苗莖葉噴施處理，36 mmol·L-14,8-DHT藥后8 d雜草的覆蓋率僅為0.15%，其雜草防除效果優(yōu)于草甘膦。對雜草幼苗莖葉噴施藥后，雜草覆蓋率降低，但防除效果不明顯（圖2 B）。

圖1 4,8-DHT與草甘膦處理下櫻花林地雜草生長情況Figure 1 Growth of weeds in C.yedoensis stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

圖2 不同施藥處理下櫻花林地的雜草覆蓋率Figure 2 Weeds coverage in C.yedoensis stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

3.2 4,8-DHT對櫻花林地雜草防除的影響

4,8-DHT對櫻花林地雜草株數(shù)、株防效的調(diào)查結(jié)果如表1。由表1可知，雜草萌芽前對土壤施藥后，4,8-DHT對櫻花林地雜草除香附子外均有較高的株防效。藥后8 d，36 mmol·L-14,8-DHT對陌上菜、擬鼠麴草、車前、碎米薺、匙葉合冠鼠麴草的防除效果顯著（P＜0.05），株防效均高達(dá)100%；藥后20 d，株防效仍為78%以上。對雜草幼苗莖葉噴施處理藥后8 d，36 mmol·L-14,8-DHT對碎米薺、匙葉合冠鼠麴草、陌上菜的株防效作用顯著（P＜0.05），分別達(dá)100%，100%，93.8%；藥后20 d時，株防效仍能保持在87%以上。

3.3 4,8-DHT對紫薇林地雜草覆蓋率的影響

根據(jù)拍攝的4,8-DHT處理紫薇林地雜草調(diào)查樣方圖（圖3），計(jì)算紫薇林地雜草覆蓋率，結(jié)果如圖4。由圖4可知，在雜草萌芽前進(jìn)行4,8-DHT土壤施藥可降低雜草的覆蓋率，36 mmol·L-14,8-DHT藥后8 d，雜草覆蓋率為0.32%；藥后20 d，雜草覆蓋率僅增長0.68%；與其余處理相比，36 mmol·L-14,8-DHT施藥后雜草的覆蓋率更低。雜草幼苗莖葉噴施處理20 d后，草甘膦處理的雜草覆蓋率最低，為1.5%；其次為36 mmol·L-14,8-DHT處理，其雜草覆蓋率為2.5%。

圖3 4,8-DHT與草甘膦處理下紫薇林地雜草生長情況Figure 3 Growth of weeds in L.indica stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

3.4 4,8-DHT對紫薇林地雜草防除的影響

4,8-DHT處理紫薇林地雜草株數(shù)及株防效調(diào)查結(jié)果如表2。從表2可看出，雜草萌芽前土壤施藥，藥后8 d，4,8-DHT抑制紫薇林地內(nèi)母草、耳草的生長，且隨著處理濃度的增加，防效呈明顯上升的趨勢，36 mmol·L-14,8-DHT處理的株防效達(dá)到100%。藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT對耳草、牛筋草有顯著（P＜0.05）的抑制作用，株防效為100%；其次為水虱草、母草、香附子，株防效分別為66.7%，65.0%，40%，對馬松子無防除效果。幼苗莖葉噴施藥后，4,8-DHT各濃度處理對林地雜草的防除效果較差，藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT處理對耳草、牛筋草、母草、馬松子的株防效僅為61.9%，50.0%，48.3%，33.3%，對香附子和水虱草無防除效果。不同施藥方法對紫薇林地雜草的防除效果分析表明，4,8-DHT對雜草種子萌發(fā)期的抑制作用強(qiáng)于幼苗期，因此4,8-DHT適用于土壤施藥。

3.5 4,8-DHT林地雜草防除效果比較

櫻花及紫薇林地內(nèi)雜草總數(shù)及總株防效調(diào)查結(jié)果如表3。從表3可看出，土壤施藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT對櫻花林地中雜草的總株防效為78.5%；與莖葉噴施藥處理相比，總株防效增加13.5%，雜草防除效果顯著。對紫薇林地雜草莖葉噴施4,8-DHT 20 d后防除效果較差，其中36 mmol·L-14,8-DHT處理雜草的總株防效最高僅為34.6%，而36 mmol·L-14,8-DHT土壤施藥后的總株防效為65.9%。4,8-DHT對林地雜草防除效果比較可知，4,8-DHT最佳施藥方法為雜草萌芽前土壤施藥。

表3 4,8-DH T與草甘膦處理下櫻花和紫薇林地雜草總數(shù)及總株防效Table 3 Total number and control effect of weed in C.yedoensis and L.indica stands treated by 4,8-DHT and glyphosate

4 小結(jié)與討論

化感物質(zhì)作為除草劑應(yīng)用的一個顯著特點(diǎn)是具有選擇性和專一性。由天然產(chǎn)物莎草茵為先導(dǎo)化合物開發(fā)的三氟羧草醚田間試驗(yàn)對一年生雙子葉雜草反枝莧、藜Chenopodium album、狗尾草Setaria viridis具有良好的防除效果[10]；以芳香油纖精酮（leptospermone）為先導(dǎo)化合物開發(fā)的硝磺草酮能有效防除玉蜀黍Zea mays田內(nèi)牛筋草、馬唐、反枝莧等雜草，對馬齒莧Portulaca oleracea無防除效應(yīng)[11]；由菊科Compositae植物豬毛蒿Artemisia scoparia全草提取的豬毛蒿精油能顯著防除香附子[12]。本實(shí)驗(yàn)中，高濃度4,8-DHT土壤施藥對櫻花林地陌上菜、碎米薺、匙葉合冠鼠麴草和紫薇林地耳草的防除效果顯著，中低濃度4,8-DHT莖葉施藥對香附子、碎米薺、馬松子無防除效果，本文驗(yàn)證目標(biāo)活性物質(zhì)雜草防除選擇性的同時獲得了除草劑目標(biāo)作用譜。

除草劑作用于雜草，可抑制雜草的營養(yǎng)吸收、物質(zhì)合成、能量代謝、酶活性、光合作用等生理過程[13]。因抑制生理過程的不同，除草劑施用方法主要包括土壤施藥法和莖葉噴施法。草甘膦為廣譜型內(nèi)吸滅生型除草劑，遇土鈍化失去活性，適于雜草莖葉噴施[14]；乙草胺為選擇性芽前處理除草劑，主要通過阻礙蛋白質(zhì)合成來抑制細(xì)胞生長，適用于土壤施藥[15]；環(huán)庚草醚土壤施藥與莖葉噴施法均能發(fā)揮其藥效[16]。本試驗(yàn)中，36 mmol·L-14,8-DHT櫻花林地藥后20 d，與莖葉噴施除草效果相比，土壤施藥雜草總株防效增加13.5%；紫薇林地藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT土壤施藥總株防效為65.9%，比莖葉噴施總株防效增加31.3%。4,8-DHT最高濃度。4,8-DHT對林地雜草防除效果比較可知，4,8-DHT最佳施藥方法為雜草萌芽前土壤施藥。研究結(jié)果表明，4,8-DHT作為除草劑，施用方法以土壤施藥法為宜。

化感作用強(qiáng)弱不僅取決于植物本身的內(nèi)在因素，環(huán)境因子對化感作用也具有一定的影響，這可能是解釋以化感物質(zhì)為基礎(chǔ)開發(fā)的生物除草劑在不同林地間除草效應(yīng)存在差異的原因。以天然產(chǎn)物莎草茵所開發(fā)的二苯醚類除草劑氟磺胺草醚對綠豆Vigna radiata，赤小豆Vigna umbellata及大豆Glycine max田間的鐵莧菜Acalypha australis的防除效果不同，大豆田間鐵莧菜的株防效為84.31%，而綠豆、赤小豆田的鐵莧菜的株防效僅為73.6%[17-18]。本研究中4,8-DHT對櫻花及紫薇林地內(nèi)雜草的株防效有顯著差異，推測可能是4,8-DHT從噴施到發(fā)揮除草效果的過程中多種因素的綜合影響而導(dǎo)致株防效存在差異。環(huán)境因子主要有土壤因素、氣候因素等，影響所施藥劑的吸收及在雜草內(nèi)的轉(zhuǎn)移；生物因素包括林地郁閉度、雜草種類及密度差異也可導(dǎo)致株防效出現(xiàn)差異。本研究僅為特定地域內(nèi)單次試驗(yàn)研究結(jié)果，可能影響到試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，故仍需后續(xù)試驗(yàn)的再次驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果可為4,8-DHT作為生物型除草劑推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，同時也在以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)開發(fā)新型生物農(nóng)藥上起到積極推動作用。