劉浩凱 ，張 輝，陳玲芳，仇輝康，王宗琪，劉衛(wèi)榮，李 麗，路媛媛

（1.景寧畬族自治縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 景寧 323500；2.景寧畬族自治縣生態(tài)林業(yè)發(fā)展中心，浙江 景寧 323500；3.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西 太谷 030801）

云錦杜鵑Rhododendron fortunei為杜鵑花科Ericaceae杜鵑屬Rhododendron常綠杜鵑亞屬Subgen.Hymenanthes常綠灌木或小喬木，高3～12 m，在我國浙江、江西、福建、湖南、安徽、廣東、廣西等?。▍^(qū)）均有分布，生長于海拔600～2 000 m的山脊陽處或林下。景寧上山頭海拔1 689 m，是景寧畬族自治縣第一高峰，該地保存著以云錦杜鵑和猴頭杜鵑Rh.simiarum為主的千畝天然杜鵑林，是當?shù)貙氋F的自然資源，近年來病蟲害的頻繁發(fā)生嚴重影響了杜鵑林的健康生長和景觀效果。

近幾年，我國對云錦杜鵑開展了許多基礎性研究[1]，內(nèi)容涉及資源分布、生態(tài)研究[2-6]、遺傳多樣性[7]等，但關于病蟲害方面的報道甚少。目前，對杜鵑病害的研究多以葉部病害為主，主要有葉斑病Cercospora rhododendri，灰霉病Sclerotinia fuckeliana，煤污病Capnodiumsp.等[8-12]，其中，汪梅蓉[8]、何香等[9]和林高峰等[10]發(fā)現(xiàn)葉斑病主要癥狀為發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)紅褐色小斑點，逐漸擴展成為圓形或不規(guī)則的多角形病斑，呈黑褐色，后期病斑中央組織變?yōu)榛野咨?，并將杜鵑葉斑病病原鑒定為杜鵑尾孢菌C.rhododendri。2017年，景寧畬族自治縣上山頭天然杜鵑林中的云錦杜鵑發(fā)生了嚴重的葉斑病，侵染初期，葉片上出現(xiàn)褐色小斑點，逐漸擴展成為圓形或不規(guī)則病斑，呈黑褐色，直徑1～5 mm，后期病斑周圍出現(xiàn)黃色暈圈，導致葉片枯黃、早落，此次在云錦杜鵑上發(fā)現(xiàn)的葉斑病與以往報道的葉斑病癥狀有所不同。為明確該云錦杜鵑葉斑病的病原菌種類，作者對發(fā)病葉片進行了病原分離和致病性測定，結合病原形態(tài)學及rDNA-ITS序列分析鑒定了病原菌種類；同時開展了該病原菌生物學特性研究，探討了不同培養(yǎng)條件對病原菌生長的影響，以期為該病害的深入研究及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

13395H2X光學顯微鏡（德國Leica公司）、XB-K-25血球計數(shù)器（上海醫(yī)用光學儀器廠）、LRH-250-G光照培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、TC-4000 PCR擴增儀（北京德力萊科技發(fā)展有限公司）、BG-1520凝膠成像系統(tǒng)儀（上海歐翔科學儀器有限公司）。

無水乙醇（分析純）、無菌水、0.1%升汞、0.5 mol·L-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1 mol·L-1Tris-HCl、3% CTAB提取緩沖液、TAE緩沖液、氯仿-異戊醇、異丙醇、Taq酶。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯（陽芋Solanum tuberosum）200 g，葡萄糖20 g；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g；燕麥瓊脂培養(yǎng)基（oat meal agar，OMA）：燕麥片30 g；察氏培養(yǎng)基：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g；霉菌培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g。以上固體培養(yǎng)基均需加入瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。

1.3 病樣采集及柯赫氏法則驗證

2017-2018年，在浙江省麗水市景寧畬族自治縣上山頭天然杜鵑林采集云錦杜鵑葉斑病癥狀典型葉片，根據(jù)癥狀進行描述。病原菌分離采用常規(guī)組織分離法[13]，共分離出9株菌株，經(jīng)單孢分離技術[14]純化后獲得菌落形態(tài)一致的病原菌，供試菌株DJ-1保存于4℃冰箱中。

柯赫氏法則驗證：選用現(xiàn)采的無病害帶枝新葉，采用噴霧法進行接種，將PDA平板培養(yǎng)7 d后的病原菌菌落用無菌水配制成濃度為1×107個·mL-1的孢子懸浮液，噴霧接種于20片上述云錦杜鵑葉片上，每片葉片接種2 mL孢子懸浮液，在25～28℃、相對濕度85%的條件下進行保濕培養(yǎng)；以噴施清水為對照。

1.4 病原菌rDNA-ITS測定

采用常規(guī)CTAB法進行病原菌基因組總DNA提取。核糖體rDNA序列擴增引物為ITS1：（5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′）和ITS4：（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[15]。

反應體系20 μL：10.0 μL 2×Taq PCR Mix，0.5 μL上游引物（10 μM），0.5 μL下游引物（10 μM），1.0 μL模板DNA，8.0 μL ddH2O（擴增所用試劑購于TaKaRa）。

擴增程序：94℃變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

將PCR回收產(chǎn)物委托寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）進行測序，將所測結果在GenBank中利用Blast N軟件進行序列分析。

1.5 病原菌生物學特征測定

1.5.1 不同培養(yǎng)基對DJ-1菌株生物學特征的影響 在25℃條件下，選取云錦杜鵑葉斑病病菌菌株DJ-1在PDA上培養(yǎng)3～4 d后，從菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，將其轉移至新的PDA，PSA，OMA，察氏，霉菌5種不同的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從第2天開始，采用十字交叉法逐日測量菌落直徑，計算菌絲生長速率，每個處理重復5次。利用紐鮑爾（Neubauer）氏血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量，每個處理重復10次。

1.5.2 不同碳源對DJ-1菌株生物學特征的影響 供試碳源有5種：蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露醇，用量2%（100 mL培養(yǎng)基中加入2 g碳源物質），以PDA為基礎培養(yǎng)基，將其配制成不同碳源培養(yǎng)基。待菌落生長成熟，移植直徑為9 mm的菌餅于培養(yǎng)基平板中央，于25℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復5次。測量方法同上。

1.5.3 不同氮源對DJ-1菌株生物學特征的影響 供試氮源有6種：KNO3，(NH4)2SO4，蛋白胨，脲，苯丙氨酸，甘氨酸，用量2%（100 mL培養(yǎng)基中加入2 g氮源物質），以察氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，將其配制成不同氮源培養(yǎng)基。待菌落生長成熟，移植直徑為9 mm的菌餅于培養(yǎng)基平板中央，于25℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復5次。測量方法同上。

1.5.4 不同pH對DJ-1菌株生物學特征的影響 采用PDA平板培養(yǎng)基。用1 mol·L-1和0.1 mol·L-1的HCl，1 mol·L-1和0.1 mol·L-1的NaOH溶液進行調(diào)配，間隔為1設置pH梯度，范圍為3.0～12.0。移植直徑為9 mm的菌餅于培養(yǎng)基平板中央，于25℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復5次。測量方法同上。

1.5.5 不同光照條件對DJ-1菌株生物學特征的影響 分別設置全光照、全黑暗和光照12 h+黑暗12 h交替3個處理。采用PDA平板培養(yǎng)基。移植直徑為9 mm的菌餅于培養(yǎng)基平板中央，于25℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復5次。測量方法同上。

1.5.6 菌絲致死溫度測定 將直徑為9 mm的病原菌菌餅移入裝有10 mL無菌水的試管中，每管3個菌餅，塞好棉塞，將不同試管分別置于50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65℃恒溫水浴鍋中處理10 min（預熱1 min），測定菌絲的致死溫度范圍。每個處理重復5次，于25℃下恒溫培養(yǎng)。測量方法同上。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 病癥描述

根據(jù)野外調(diào)查結果顯示，云錦杜鵑葉斑病主要危害葉片，侵染初期，葉片上出現(xiàn)褐色小斑點，后逐漸擴展成為圓形病斑，或不規(guī)則病斑，黑褐色，直徑1～5 mm。后期病斑周圍出現(xiàn)黃色暈圈，導致葉片枯黃、早落。在潮濕環(huán)境條件下，葉斑下面著生許多褐色的小霉點，即病原菌的分生孢子及分生孢子器（圖1A）。

圖1 云錦杜鵑葉斑病發(fā)病癥狀Figure 1 Symptom of leaf spot on R.fortunei

2.2 病原菌分離及柯赫氏法則驗證

本試驗經(jīng)分離純化后獲得9株菌株（DJ-1，DJ-2，DJ-3，DJ-4，DJ-5，DJ-6，DJ-7，DJ-8，DJ-9），經(jīng)形態(tài)學鑒定為同一種病原菌，選取DJ-1為供試菌株，經(jīng)噴霧法接種于現(xiàn)采的無病害帶枝新葉，7 d后葉片發(fā)病。發(fā)病初期葉片出現(xiàn)褪綠斑點，隨后，擴展為褐色病斑（圖1B）。人工接種后癥狀與野外癥狀相一致。經(jīng)重新分離后，獲得與野外自然發(fā)病同一種病原菌，證明DJ-1菌株是引起云錦杜鵑葉斑病的病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)特征

在PDA上形成的菌落特征：培養(yǎng)初期，病原菌在培養(yǎng)基上形成白色的菌絲，菌落稀疏；隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落顏色呈灰白色，均勻致密，菌絲為絨毛狀或棉絮狀，20 d后菌落上形成黑色小點（圖2A）。

分生孢子為單細胞、無色、紡錘形至橢圓形，兩端有1～2個油滴，平均大小為（7.0～10.0）μm×（2.7～3.3）μm（圖2B），未觀察到乙型（β型）分生孢子。分生孢子器呈黑褐色，扁球形，大小為82 μm×178 μm（圖2C）。

圖2 云錦杜鵑葉斑病病原菌形態(tài)Figure 2 Morphology of pathogen of leaf spot on R.fortunei

依據(jù)《真菌鑒定手冊》[16]等對擬莖點霉屬Phomopsis的描述及鑒定標準，本實驗分離獲得的云錦杜鵑葉斑病病原菌，形態(tài)特征與其完全相符，初步鑒定該菌為蘆筍擬莖點霉Phomopsis asparagi。

2.4 病原菌分子鑒定

采用ITS1和ITS4引物對擴增病原菌的rDNA-ITS區(qū)序列，獲得片段長度為531 bp（圖3），將該序列與GenBank中相關菌株的ITS序列進行同源性比較。結果顯示，待測菌株與蘆筍擬莖點霉（登錄號HM145960.1）的同源性達到99%，由此根據(jù)形態(tài)學及分子生物學鑒定待測的云錦杜鵑葉斑病病原菌菌株為蘆筍擬莖點霉。

圖3 病原菌的PCR擴增產(chǎn)物Figure 3 PCR amplification of pathogen

2.5 環(huán)境條件對病原菌菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的影響

2.5.1 不同培養(yǎng)基對DJ-1菌株生長速率及產(chǎn)孢量的影響 由表1表明，DJ-1菌株菌絲生長速率在供試的5種培養(yǎng)基上均表現(xiàn)出明顯差異（P＜0.05），其中以PDA培養(yǎng)基上菌絲生長速率最快（13.93 mm·d-1），其次為PSA，OMA和霉菌培養(yǎng)基，其生長速率分別為12.13 mm·d-1，12.83 mm·d-1和12.63 mm·d-1，在察氏培養(yǎng)基上生長速率最慢（8.9 mm·d-1）；不同的培養(yǎng)基上病原菌產(chǎn)孢量同樣具有顯著差異（P＜0.05），病原菌在PDA和PSA上產(chǎn)孢量最大，分別達到4.83×106和4.78×106個，其次為OMA，霉菌培養(yǎng)基，在察氏培養(yǎng)基上病原菌產(chǎn)孢量最小僅為0.83×106個（表1）。從菌落形態(tài)和顏色來看，DJ-1菌落除在察氏培養(yǎng)基上分布稀疏、顏色較淺外，在其他培養(yǎng)基上均菌落分布致密并呈輪紋狀（圖4）。

2.5.2 不同碳源對DJ-1菌株生長速率及產(chǎn)孢量的影響 由測定結果表明，病原菌可以利用多種碳源，但在不同碳源培養(yǎng)基之間菌落直徑差異顯著（P＜0.05）（圖5），其中，以甘露醇最適宜生長，其病原菌生長速率為13.67 mm·d-1；其次為葡萄糖和蔗糖，在這2種碳源培養(yǎng)基上菌絲的生長速率相差不大，差異不顯著，其病原菌的生長速率分別為12.20 mm·d-1和12.13 mm·d-1；果糖和木糖的利用率較差，在其培養(yǎng)基上病原菌的生長速率分別為11.70 mm·d-1和10.00 mm·d-1；由產(chǎn)孢量測定結果表明，不同碳源對DJ-1菌株的產(chǎn)孢量存在顯著影響（P＜0.05），DJ-1菌株在葡萄糖和果糖培養(yǎng)基碳源中產(chǎn)孢量最大，分別為4.83×106，4.72×106個，其次為蔗糖和木糖，在甘露醇中產(chǎn)孢量最少，僅為0.95×106個（表2）。

表1 不同培養(yǎng)基對DJ-1菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的影響Table 1 Effect of different medium on mycelium growth and sporulation quantity of DJ-1

表2 不同碳源對DJ-1菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的影響Table 2 Effect of different carbon sources on mycelium growth and sporulation quantity of DJ-1 bacterium

圖4 不同培養(yǎng)基上的病原菌菌落形態(tài)Figure 4 Colonial morphology of pathogen on different media

圖5 不同碳源培養(yǎng)基上的病原菌菌落形態(tài)Figure 5 Colonial morphology of pathogen on different carbon source media

圖6 不同氮源培養(yǎng)基上的病原菌菌落形態(tài)Figure 6 Colonial morphology of pathogen on different nitrogen source media

2.5.3 不同氮源對DJ-1菌株生長速度及產(chǎn)孢量的影響 由測定結果表明，病原菌可以在多種氮源中生長（圖6），但在不同氮源培養(yǎng)基中，病原菌菌落的直徑差異較顯著（P＜0.05），其中，在甘氨酸中的生長最快，其生長速率為12.22 mm·d-1，在脲中其次，其生長速率為10.61 mm·d-1，在硫酸銨、蛋白胨和KNO3中生長速率差異并不明顯，苯丙氨酸中不適宜該病原菌生長，其生長速率僅為6.09 mm·d-1；由產(chǎn)孢量測定結果顯示，病原菌產(chǎn)孢量在不同的氮源培養(yǎng)基下差異顯著（P＜0.05），甘氨酸培養(yǎng)基有利于病原菌產(chǎn)孢，其產(chǎn)孢量達到8.26×106個，其次為硫酸銨、蛋白胨、苯丙氨酸培養(yǎng)基，而脲和KNO3培養(yǎng)基不利于產(chǎn)孢（表3）。

表3 不同氮源對DJ-1菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的影響Table 3 Effect of different nitrogen source medium on mycelium growth and sporulation quantity of DJ-1

2.5.4 不同pH對DJ-1菌株生長速率及產(chǎn)孢量的影響 由圖7可知，不同pH對病原菌菌絲生長速率影響顯著（P＜0.05），病原菌菌絲在pH 3.0～ 12.0范圍內(nèi)均可以生長，其中，以pH在 8.0～10.0時菌絲的生長速率最快（pH8.0，9.0，10.0時的菌絲生長速率分別為10.79 mm·d-1，10.31 mm·d-1，10.60 mm·d-1），最適宜該病原菌的生長；當pH在3.0～7.0時，隨著pH的升高，菌絲生長速率加快；當pH在8.0～12.0時，隨著pH的增高，菌絲生長速率逐漸減慢；對產(chǎn)孢量的測定結果表明，pH對于病原菌產(chǎn)孢量的影響顯著（P＜0.05），pH在3.0～8.0范圍，病原菌產(chǎn)孢量隨著pH的增高逐漸增多，在pH為8.0時產(chǎn)孢量達到最大，為3.15 ×106個，但pH在10.0～12.0時病原菌的產(chǎn)孢量隨著pH的升高逐漸減少。由表4可知，強酸和強堿條件下均不利于病原菌孢子的產(chǎn)生。

圖7 不同pH培養(yǎng)基上的病原菌菌落形態(tài)Figure 7 Colonial morphology of pathogen on media with different pH

表4 不同pH對DJ-1菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的影響Table 4 Effect of pH on mycelium growth and sporulation quantity of DJ-1

2.5.5 不同光照條件對DJ-1菌株生長速率及產(chǎn)孢量的影響 根據(jù)試驗測定結果表明（圖8），全光照、全黑暗、光照12 h+黑暗12 h交替條件下菌絲均可以生長，但不同光照處理下DJ-1菌絲平均生長速率存在明顯差異（P＜0.05），病原菌菌絲在光照12 h+黑暗12 h交替條件下生長最好，菌絲平均生長速率達到12.08 mm·d-1，顯著高于（P＜0.05）全光照和全黑暗處理（10.36 mm·d-1，11.33 mm·d-1）；由產(chǎn)孢測定結果表明，全光照、全黑暗、光照12 h+黑暗12 h交替都有利于病原菌產(chǎn)孢，但以光照12 h+黑暗12 h交替處理最利于病原菌孢子的產(chǎn)生，其產(chǎn)孢量為3.10 ×106個，其次為全光照及全黑暗條件，其產(chǎn)孢量分別為2.25×106個和2.17×106個（表5）。

表5 不同光照條件對DJ-1菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的影響Table 5 Effect of different illumination on mycelium growth and sporulation quantity of DJ-1

圖8 不同光照條件下病原菌菌落形態(tài)Figure 8 Colonial morphology of pathogen under different light conditions

2.5.6 DJ-1菌絲及分生孢子致死溫度測定 由表6可知，在50～59℃，將病原菌菌絲處理10 min，菌絲均能正常生長；當處理溫度≥60℃時，菌絲均不再生長，因此該病原菌致死溫度為60℃。在50～54℃，將該致病菌分生孢子處理10 min后，分生孢子均能萌發(fā)，然而當溫度≥55℃時，分生孢子不再萌發(fā)，由此可認定該病原菌分生孢子的致死溫度為55℃。

表6 DJ-1菌絲和分生孢子致死溫度測定Table 6 Lethal temperature for mycelium and conidium of DJ-1

3 結論與討論

本研究對采集于浙江省景寧縣上山頭云錦杜鵑葉斑病樣本進行了病原菌分離、形態(tài)學觀察，采用柯赫氏法則驗證及DNA序列分析，最終確定云錦杜鵑葉斑病的致病病菌為蘆筍擬莖點霉。

蘆筍莖枯病菌隸屬于擬莖點霉屬，該屬種類多，分布廣，為重要的植物致病真菌，屬中大多數(shù)種可導致作物、水果及樹木等植物病害，如擬莖點霉屬真菌引起的油棕葉斑病Elaeis guineensis[17]，葡萄擬莖點藤葉斑病P.viticola[18]；筒鳳擬莖點霉P.spectabilis引起的廣東鳳梨科Bromeliaceae觀賞植物葉斑病[19]等。尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)，一些寄生性和致病性較強的種類，會引起嚴重病害而導致農(nóng)作物和花卉等的產(chǎn)量大大減少，如：橘子樹脂病P.cytospore，茄子褐紋病P.vexans，芒果樹脂病P.cytospore和大豆莖潰瘍病Diaporthe phaseolorum等[20]。有報道，在美國愛荷華發(fā)現(xiàn)蘆筍莖枯病菌可引發(fā)多種大豆Glycine max病害[21]，其中包括根腐病。目前該病菌已經(jīng)傳到其他植物上，且在中國、日本和葡萄牙等國家也均有發(fā)現(xiàn)。

本研究形態(tài)學鑒定結果與前人在蘆筍莖枯病上的研究結果基本一致[22-26]。研究結果表明，不同培養(yǎng)基及環(huán)境條件對蘆筍擬莖點霉菌株菌絲生長速率及產(chǎn)孢量有著顯著的影響，其中，病原菌菌絲致死溫度為60℃，10 min，這與劉志恒等的研究結果相一致[27]。但2003年顧振芳[28]在蘆筍莖枯病菌生物學特性研究中發(fā)現(xiàn)，蘆筍擬莖點霉的適宜pH為6.0～10.0，然而本試驗中蘆筍擬莖點霉的適宜pH為8.0～10.0，偏堿性。存在這種差異的原因可能是由不同植物之間遺傳多樣性不同所產(chǎn)生的。該致病菌在供試的不同碳、氮源中都可以生長，能夠吸收利用多種碳源和氮源，說明該致病菌對營養(yǎng)條件要求不是很高，其中，菌絲生長時對甘露醇的利用效率最高，對木糖的利用率最低，所以醇類比糖類更易被病原菌吸收；而在氮源中吸收效果最好的是甘氨酸，最差的是硫酸銨。因此，在云錦杜鵑的管理過程中應該選擇恰當?shù)姆柿?。另外，該菌寄主范圍較廣，栽培上應避免種間的相互交叉感染，防止危害進一步擴大。本研究初步確定了云錦杜鵑葉斑病病原菌的生物學特性，為以后相關的防治研究提供了依據(jù)。