歐玉侖 鄺國平 周小平

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥[1]，超過1/3的糖尿病患者有DR，并且增加其他系統(tǒng)性血管并發(fā)癥的風險[2]。臨床現(xiàn)有的DR治療方法療效不理想。研究表明，許多miRNAs在角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜和其他眼組織中都有表達[3]。其中miRNA let-7c參與糖脂代謝過程，是胰島素調(diào)節(jié)的信號途徑之一[4]，其在體內(nèi)的過表達導致DR的特征，包括曲折的視網(wǎng)膜血管和有缺陷的周細胞覆蓋[5]。而研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3依賴的方式可減弱病理性視網(wǎng)膜血管生成[6]，而miRNA let-7c的表達可抑制STAT3的磷酸化，使STAT3的表達明顯降低[7]。因此，STAT3是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜生理和病理信號通路的關(guān)鍵介質(zhì)[8]。目前，關(guān)于STAT3和miRNA let-7c在DR發(fā)病中的作用研究不多，而本研究旨在探討miRNA let-7c如何通過調(diào)節(jié)糖尿病大鼠模型中的STAT3表達影響DR的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料雄性Sprague Dawley(SD)大鼠56只，體質(zhì)量(200±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(合格證編號：2016-0005)。將動物飼養(yǎng)在溫度為(25±20)℃、濕度為(50±2)%、光照12 h/黑暗12 h的動物房中。所有動物均可自由飲水和進食。

293T細胞(美國模式培養(yǎng)物集存庫)；鏈脲佐菌素(STZ，溶于0.01 mol·L-1檸檬酸鹽，pH 4.4；美國Sigma公司)；戊巴比妥(國藥集團化學試劑有限公司)、熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司)；抗STAT3、miRNA-let-7c模擬物和Anti-miRNA-let-7c寡核苷酸序列(廣州市銳博生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒、PrimeScript RT試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex TaqII試劑盒、RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PVDF膜(美國Merck Millipore公司)；STAT3抗體(1500)、VEGFA抗體(1800)、BAX抗體(11000)、Bcl抗體(11000)及GAPDH抗體(12000)均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；二次抗體IgG(15000；美國Santa Cruz Biotechnology公司)；K801-200熒光素酶測定試劑盒(美國Biovision公司)；ABI Prism 7300系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)；一觸式血糖儀(美國Johnson Lifecan公司)；Micron-Ⅲ視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)(美國Phoenix Research Labs公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；miRNA let-7c、STAT3 mRNA和GAPDH的引物由日本TaKaRa公司合成。

1.2 DR大鼠模型的建立56只SD大鼠瞳孔大小形狀一致，屈光介質(zhì)清晰，光覺良好，無眼底異常。將大鼠分為DR組(n=48只)和正常組(n=8只)，DR組大鼠空腹注射鏈脲佐菌素(STZ，45 mg·kg-1)誘導糖尿病，正常組大鼠注射等量檸檬酸鹽緩沖液，所有大鼠自由飲水和進食。造模后每周稱一次體質(zhì)量，每3 d測一次血糖。大鼠尾部提取的靜脈血血糖濃度≥16.7 mmol·L-1的被視為糖尿病模型。常規(guī)喂養(yǎng)12周后，進行視網(wǎng)膜電生理檢查。此外，每組各取3只，釆用Micron-Ⅲ視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)對各組大鼠右眼進行眼底觀察和熒光造影檢查。如果F-ERG波和Ops波的潛伏期延長，波幅降低，視網(wǎng)膜血管顯影不清晰，則認為DR模型是成功建立的。

1.3 STAT3和miRNA-let-7c質(zhì)粒載體的建立在抗STAT3寡核苷酸序列的末端合成BamHI和XhoI酶切位點，將片段克隆到pRNA-Lenti-EGFP慢病毒載體中以形成相應的重組表達載體pRNA-Lenti-miR-let-7c-EGFP(miRNA-let-7c過表達質(zhì)粒)、pRNA-Lenti-anti-miRNA-let-7c-EGFP(miRNA-let-7c干擾表達質(zhì)粒)、pRNA-Lenti-anti-STAT3-EGFP(STAT3干擾表達質(zhì)粒)和pRNA-Lenti-vector-EGFP(空質(zhì)粒)。對大腸桿菌DH5α進行轉(zhuǎn)染，并采用PCR，雙酶切和測序等方法進行檢測。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對數(shù)生長的293T細胞，然后將細胞密度調(diào)整為106個·mL-1，并接種到96孔板中(每孔100 μL)。混合相應的質(zhì)粒和慢病毒包裝以轉(zhuǎn)染293T細胞。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，并使用RNA提取試劑盒提取總RNA。然后，進行qRT-PCR檢測細胞中miRNA-let-7c和STAT3的mRNA表達。

1.5 動物分組將DR組大鼠再次分組如下：空白模型組，8只未經(jīng)治療的DR大鼠；miRNA-let-7c模擬物組：8只DR大鼠，玻璃體內(nèi)注射4 μg miRNA-let-7c過表達質(zhì)粒；Anti-miRNA-let-7c組：8只DR大鼠，玻璃體內(nèi)注射4 μg miRNA-let-7c干擾表達質(zhì)粒；陰性對照(NC)組：8只DR大鼠，玻璃體內(nèi)注射4 μg空質(zhì)粒；Anti-miRNA-let-7c+Anti-STAT3組：8只DR大鼠，玻璃體內(nèi)注射4 μg miRNA-let-7c干擾表達質(zhì)粒和4 μg STAT3干擾表達質(zhì)粒；Anti-STAT3組：8只DR大鼠，玻璃體內(nèi)注射4 μg STAT3干擾表達質(zhì)粒。共注射兩次質(zhì)粒，2次注射間隔約10 d，最后一次注射后20 d大鼠采用腹腔內(nèi)注射30 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉(2 mL·kg-1)處死。取出大鼠眼球前段視網(wǎng)膜組織，用于后續(xù)研究。

1.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)采用RNA提取試劑盒，從每個轉(zhuǎn)染組的細胞以及大鼠視網(wǎng)膜組織中提取總RNA。隨后，根據(jù)廠家說明書使用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)體積為10 μL。反應條件如下：37 ℃，15 min×3次(逆轉(zhuǎn)錄反應)，85 ℃×5 s(逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應)。將反應溶液用于以GAPDH為內(nèi)部參照的定量熒光PCR，該反應按照SYBR Premix Ex TaqII試劑盒說明進行，反應系統(tǒng)的體積為50 μL，包含25 μL SYBR Premix Ex TaqII、2 μL PCR上游引物、2 μL PCR下游引物、1 μL ROX參考染料(50×)，4 μL DNA模板和16 μL雙蒸水，使用ABI Prism 7300系統(tǒng)進行定量熒光PCR，反應條件總共40個循環(huán)，在95 ℃預變性15 min，在95 ℃變性15 s，在60 ℃退火并延伸60 s。以GAPDH作為內(nèi)部參照，使用2-ΔΔCt計算miRNA let-7c和STAT3的mRNA表達。引物序列如下：miRNA let-7c正向引物為5’-ACCTGTCACTGTCTTGTACCCTTGT-3’，反向引物為5’-CGGCGTTTGGAGTGGTAGAA-3’；STAT3正向引物為5’-GATGCGCACAAGGTCCTG-3’，反向引物為5’-CAGGGTGCTGTCCACACTGGCTCGC-3’；GAPDH正向引物為5’-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3’，反向引物為5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’。

1.7 Western blot分析在大鼠視網(wǎng)膜組織中加入RIPA緩沖液以提取總蛋白質(zhì)，然后使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒進行蛋白定量。采用SDS-PAGE電泳對不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)進行等濃度分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用50 g·L-1脫脂奶粉封閉1.5 h后，加入STAT3抗體(1500)、VEGFA抗體(1800)、Bax抗體(11000)、Bcl抗體(11000)或GAPDH抗體(12000)孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶標記的二次抗體IgG(15000)反應2 h。最后用PBS洗膜3次。使用電化學發(fā)光(ECL)溶液進行曝光和顯影，并使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。以GAPDH為內(nèi)參照進行帶灰度分析。將目標帶與參考帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對表達水平。

1.8 HE染色在用Davidson’s溶液將視網(wǎng)膜組織固定24 h后，進行常規(guī)脫水，透明化，蠟填充和石蠟包埋。將切片切成3 μm厚，并在50 ℃下烘烤1 h。常規(guī)HE染色后在光學顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞。

1.9 雙熒光素酶報告基因檢測分析miRNA-let-7c與STAT3的直接作用通過miRNA生物信息學目標預測軟件預測了STAT3的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)中的miRNA-let-7c結(jié)合位點，并合成了包含miRNA-let-7c結(jié)合位點的STAT3 3’UTR的啟動子區(qū)序列。隨后，將它們插入pGL3 NC載體的5’末端的BglⅡ位點中，以構(gòu)建STAT3 3’UTR的野生型(WT)質(zhì)粒(命名為STAT3 3’UTR-WT)?；赟TAT3 3’UTR-WT，通過突變miRNA-let-7c結(jié)合位點，構(gòu)建STAT3 3’UTR的突變質(zhì)粒(命名為STAT3 3’UTR-MUT)。在本實驗中使用的報告載體是pcDNA3.1-LUC質(zhì)粒，其編碼螢火蟲熒光素酶。為了測量轉(zhuǎn)染效率，將pRL-TK轉(zhuǎn)染為內(nèi)部對照，其編碼海腎熒光素酶。分別單獨或與miRNA-let-7c mimic轉(zhuǎn)染293T細胞。在轉(zhuǎn)染后24 h，通過使用K801-200熒光素酶測定試劑盒測定熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學方法本研究利用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，測量結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。通過Pearson相關(guān)分析來分析測量數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DR大鼠模型的評價DR組和正常組大鼠的生存率為100%。在建立模型前，DR組和正常組大鼠的體質(zhì)量分別為(196±6)g和(200±7)g；血糖濃度為(6.3±0.5)mmol·L-1和(5.2±0.4)mmol·L-1，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。在建立模型后4周、8周和12周，DR組大鼠體質(zhì)量分別為(187±15)g、(179±19)g和(168±22)g，顯著低于正常組大鼠的(235±21)g、(281±19)g和(317±23)g；DR組血糖濃度分別為(21.7±3.6)mmol·L-1、(20.8±3.1)mmol·L-1和(21.5±2.9)mmol·L-1，顯著高于正常組的(5.3±0.6)mmol·L-1、(5.2±0.2)mmol·L-1和(5.3±0.4)mmol·L-1，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

2.2 miRNA let-7c與STAT3 mRNA表達的相關(guān)性空白模型組和NC組之間的miRNA-let-7c和STAT3的mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。miRNA let-7c組的miRNA-let-7c mRNA相對表達量為1.40±0.02，顯著高于空白模型組的0.62±0.01；miRNA let-7c組的STAT3 mRNA相對表達量為1.11±0.01，顯著低于空白模型組的2.22±0.04；而Anti-miRNA-let-7c組的miRNA-let-7c mRNA的表達顯著下降為0.21±0.01，Anti-miRNA-let-7c組的STAT3 mRNA表達顯著增加為3.84±0.40(P<0.05)。在四組之間進行miRNA-let-7c和STAT3 mRNA表達的相關(guān)分析，結(jié)果顯示：miRNA-let-7c與STAT3的mRNA表達呈負相關(guān)(r=-0.906，P<0.001)。見圖1。

圖1 miRNA-let-7c與STAT3 mRNA表達的相關(guān)性分析

2.3 DR組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化HE結(jié)果顯示，正常組大鼠具有清晰、連續(xù)的內(nèi)界膜，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜附近的玻璃體中只有少數(shù)切片可見血管內(nèi)皮細胞。空白模型組、NC組、miRNA-let-7c組和Anti-miRNA-let-7c+Anti-STAT3組大鼠視網(wǎng)膜表面呈現(xiàn)輕度水腫，輕度紊亂的細胞層，少量視網(wǎng)膜新生血管芽和略微不規(guī)則的擴張性血管腔。與NC組相比，Anti-STAT3組大鼠視網(wǎng)膜表面無明顯的細胞水腫；此外，細胞層排列有序，偶爾可見視網(wǎng)膜新生血管芽，血管腔切面規(guī)則，血管內(nèi)皮細胞核明顯減少。Anti-miRNA-let-7c組大鼠視網(wǎng)膜表面出現(xiàn)水腫，細胞層排列不規(guī)則，視網(wǎng)膜新生血管芽，血管腔切面不規(guī)則擴大，而血管內(nèi)皮細胞核顯著增加(圖2)。各組血管內(nèi)皮細胞計數(shù)均高于正常組[(3±0)個]；Anti-miRNA-let-7c組[(58±6)個]和Anti-miRNA-let-7c+Anti-STAT3組[(15±2)個]的血管內(nèi)皮細胞計數(shù)顯著高于空白模型組[(24±3)個]；miRNA-let-7c組[(16±3)個]和Anti-STAT3組的[(14±3)個]的血管內(nèi)皮細胞計數(shù)顯著低于空白模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×200)

2.4 miRNA let-7c和STAT3與DR發(fā)展的相關(guān)性qRT-PCR結(jié)果表明，與正常組大鼠視網(wǎng)膜組織中miRNA-let-7c mRNA表達(2.61±0.31)比較，除miRNA-let-7c組表達[(2.24±0.25)]無顯著差異(P>0.05)外，其他各組大鼠視網(wǎng)膜組織中的miRNA-let-7c mRNA表達均有明顯差異(均為P<0.05)。與空白模型組(1.43±0.23)、NC組(1.32±0.17)大鼠視網(wǎng)膜組織中miRNA-let-7c mRNA表達相比，除Anti-STAT3組(0.84±0.11)無差異(P>0.05)外，miRNA-let-7c組、Anti-miRNA-let-7c組(0.62±0.05)、Anti-miRNA-let-7c+ Anti-STAT3組(0.72±0.08)均有明顯差異(均為P<0.05)。

與正常組大鼠視網(wǎng)膜中的STAT3、VEGFA和Bax蛋白表達比較，除了Anti-STAT3組均無差異外(均為P>0.05)，其他各組均有明顯差異(均為P<0.05)。與空白模型組、NC組相比，miRNA-let-7c組和Anti-STAT3組大鼠視網(wǎng)膜中STAT3的VEGFA和Bax蛋白表達均顯著降低(均為P<0.05)；而Anti-miRNA-let-7c組大鼠視網(wǎng)膜中STAT3、VEGFA和Bax蛋白表達均顯著升高(均為P<0.05)。各組Bcl-2蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中各種蛋白的表達

2.5 STAT3是否為miRNA-let-7c的靶基因驗證結(jié)果根據(jù)microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/)在線預測miRNA靶基因的工具發(fā)現(xiàn)，STAT3為miRNA-let-7c的靶基因。該預測工具顯示STAT3的3’UTR與miRNA-let-7c的結(jié)合域中的高度保守性(圖3)。用miRNA-let-7c模擬物轉(zhuǎn)染后，雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，STAT3 3’UTR-WT的相對熒光素酶活性為0.55±0.03，低于WT+NC組的1.04±0.18(P<0.05)；MT+miRNA-let-7c模擬組(1.05±0.11)或MT+NC組(0.87±0.06)中未觀察到相對熒光素酶活性的差異。

圖3 miRNA-let-7c和STAT3 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的堿基配對

3 討論

DR是一種慢性微血管并發(fā)癥，嚴重威脅并最終影響糖尿病患者的視力[1]。盡管在DR的預防和治療方面取得了重大進展，但是DR的失明率并未見下降，這表明DR的預防和抑制仍然面臨多重挑戰(zhàn)，需要進一步研究。與傳統(tǒng)的臨床檢查和視網(wǎng)膜圖像分析相比，循環(huán)microRNAs可能在預防和治療DR進展中至關(guān)重要。因此，針對STAT3的miRNA-let-7c調(diào)控作用及其機制的見解可為治療DR提供新的方法。

本研究在DR大鼠造模實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，正常組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加且血糖保持基本不變，而DR組大鼠體質(zhì)量持續(xù)下降且血糖濃度從第4周顯著增加，然后維持在約21.0 mmol ·L-1。在對miRNA-let-7c、STAT3和DR之間相關(guān)性關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，DR大鼠的miRNA-let-7c表達降低，而STAT3的表達顯著增加，表明miRNA-let-7c和STAT3表達呈負相關(guān)。MicroRNA是非編碼的小分子RNA，可以調(diào)節(jié)植物、動物和原生動物的基因表達。其中，miRNA-let-7c靶標富含與2型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的基因，已被證明可調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和胰島素敏感性[5,9]。研究表明，miRNA-let-7c和糖尿病相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病有關(guān)，并且miRNA-let-7c-Tg小鼠顯示出DR特征，其中包括彎曲的視網(wǎng)膜血管和有缺陷的周細胞覆蓋[10]。MicroRNA可以影響胰島素的合成和分泌，改善胰島素抵抗性脂肪組織的代謝，從而影響糖尿病的發(fā)展和隨后的并發(fā)癥[11]。此外，視網(wǎng)膜組織中有大量的microRNA表達，與正常組織相比，病理性視網(wǎng)膜組織中某些microRNA的表達顯著降低[12]，解釋了本研究觀察到的DR大鼠中miRNA-let-7c表達減少。STAT3是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜生理和病理信號通路的關(guān)鍵介質(zhì)，因此為治療干預提供了主要靶點。對STAT3通路的直接和間接抑制在多種炎癥相關(guān)的眼病中具有保護作用[13]。此外，VEGF的抑制以STAT3依賴性方式減弱病理性視網(wǎng)膜血管生成[14]。多項研究將STAT3活性與DR疾病進展聯(lián)系在一起。首先，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的STAT3蛋白水平升高。其次，抑制STAT3可以降低糖尿病大鼠模型中視網(wǎng)膜細胞的死亡，并降低 1型糖尿病小鼠模型中的視網(wǎng)膜炎癥[15]。此外，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑和他汀類藥物通過滅活STAT3來防止與氧化應激相關(guān)的DR病理[16]。在這項研究中，STAT3被證明是miRNA-let-7c的靶基因，該結(jié)果與生物信息學預測一致，表明miRNA-let-7c可以與STAT3 mRNA的3’UTR種子區(qū)中的堿基結(jié)合，從而導致靶向抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-let-7c mRNA表達的增加和STAT3蛋白表達的減少可能會降低DR大鼠的微血管內(nèi)皮細胞的數(shù)量并抑制視網(wǎng)膜新血管芽的形成，這對于DR的治療具有重要意義。DR可以誘導多種血管生長因子的合成和釋放，并可以促進視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管生成。然而，未成熟的新生血管組織不能形成正常的視網(wǎng)膜屏障，這會導致眼底出血[17]。血管生成是DR的最重要特征之一，是在先前血管的基礎上生成新血管網(wǎng)絡的過程，可能會導致玻璃體出血或牽引性視網(wǎng)膜脫離，甚至導致嚴重的視力喪失。VEGFA是促血管生成因子，在促進內(nèi)皮細胞的存活、遷移和增殖以及增強血管通透性中發(fā)揮作用，并且VEGFA對于血管生長是必不可少的，特別是在血管受累和器官重塑的病理學中[18]。Arthur等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜和高糖處理的內(nèi)皮細胞中，VEGFA mRNA表達增加。本研究觀察到DR大鼠中VEGFA蛋白表達顯著升高，而miRNA-let-7c過表達和STAT3低表達均有助于降低DR大鼠的VEGFA蛋白表達，表明miRNA-let-7c可能通過STAT3對其下游靶基因VEGFA產(chǎn)生負調(diào)控。由于DR是微血管并發(fā)癥之一，因此可以推測，miRNA-let-7c過表達有助于降低微血管生成和內(nèi)皮細胞核數(shù)目，延緩DR的發(fā)展。

Bax是一種促凋亡蛋白，在人類糖尿病視網(wǎng)膜中觀察到Bax表達增強，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，下調(diào)Bcl-2表達后，糖尿病細胞凋亡增加[20]。Pastor-Idoate等[21]認為，STAT3的上調(diào)促進了Bax的易位，隨后增強了高葡萄糖誘導的線粒體功能障礙，并引發(fā)了過量的活性氧生成，從而導致了視網(wǎng)膜神經(jīng)元的氧化應激。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-let-7c過表達和STAT3低表達均降低了DR大鼠視網(wǎng)膜組織中的Bax蛋白表達，這有助于抑制細胞凋亡，并保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元。

總之，本研究表明，miRNA-let-7c的過表達可以下調(diào)STAT3的水平，降低DR大鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞核數(shù)目，并抑制視網(wǎng)膜組織中的VEGFA、Bax的蛋白表達。然而，由于本實驗使用的大鼠模型數(shù)量有限，未來需進行大樣本量的前瞻性研究，以提供更精確的估計，以證實miRNA-let-7c在DR中的作用，并最終為DR的治療開發(fā)新的遺傳治療策略的靶標。