許雲(yún) 陳澤君 權(quán)卓婭 張瑞雪 何蓓蕾 何媛

老年性黃斑變性(AMD)是老年人視力喪失的主要原因，在亞洲發(fā)展中國家中，40歲以上人群AMD的患病率約為7%[1]。研究表明，氧化應(yīng)激損傷會導(dǎo)致大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)在視網(wǎng)膜組織堆積，引起視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)層吞噬功能障礙最終導(dǎo)致RPE細(xì)胞死亡[2-3]。體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷會引起RPE細(xì)胞一系列結(jié)構(gòu)和功能改變，最終導(dǎo)致凋亡[4]。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，程序性壞死是RPE細(xì)胞在氧化應(yīng)激情況下死亡的主要機(jī)制[5-6]。線粒體靶向肽SS31(H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)是一種新型線粒體靶向小分子短肽，具有內(nèi)在抗氧化活性。它具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化應(yīng)激[7-9]、神經(jīng)保護(hù)[10-11]及抗凋亡等[12-13]。程序性壞死參與氧化應(yīng)激會引起RPE細(xì)胞損傷，SS31能否通過對抗氧化應(yīng)激引起的ARPE-19細(xì)胞程序性壞死發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究探討線粒體靶向肽SS31 及RIP抑制劑Necrostatin-1 (Nec-1)對H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑ARPE-19細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；SS31(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)，抗RIP3抗體、Nec-1、MTT、H2O2(美國Sigma 公司)，胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Annexin V/PI 試劑盒(江蘇凱基公司)，JC-1熒光探針、雙氯熒光素(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將 ARPE-19細(xì)胞放入含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長融合到80%時(shí)，用2.5 g·L-1EDTA-胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞生長、融合至80%～90%再次傳代。取增殖旺盛、狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

根據(jù)前期對H2O2作用細(xì)胞半數(shù)致死量濃度篩選，選擇400 μmol·L-1H2O2作為氧化應(yīng)激損傷濃度；根據(jù)MTT結(jié)果篩選出1 μmol·L-1SS31、40 μmol·L-1Nec-1作為實(shí)驗(yàn)最佳濃度。將細(xì)胞分為6組：(1)對照組：用DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h；(2)SS31+Nec-1組：用1 μmol·L-1SS31預(yù)處理細(xì)胞2 h，更換培養(yǎng)液并加入40 μmol·L-1Nec-1共處理細(xì)胞24 h;(3)H2O2組：用400 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞24 h；(4)SS31+H2O2組：用1 μmol·L-1SS31預(yù)處理細(xì)胞2 h，吸出后加入400 μmol·L-1H2O2作用24 h；(5)SS31+Nec-1+ H2O2組：用1 μmol·L-1SS31預(yù)處理細(xì)胞2 h，吸出后再用40 μmol·L-1Nec-1與400 μmol·L-1H2O2共處理細(xì)胞24 h；(6)Nec-1+H2O2組：40 μmol·L-1Nec-1與400 μmol·L-1H2O2共處理細(xì)胞24 h。

1.2.2 MTT測定細(xì)胞存活率當(dāng)ARPE-19細(xì)胞生長、融合到80%時(shí)，用EDTA-胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，將ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL，置于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜，按1.2.1實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，每孔加入20 μL MTT溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩器上微振10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 雙氯熒光素染色測定細(xì)胞ROS水平將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔200×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加藥處理，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次，加入用無血清培養(yǎng)基11000稀釋的雙氯熒光素探針，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，棄培養(yǎng)基后用無血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 JC-1染色測定線粒體膜電位將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔200×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加藥處理，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次，用胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，離心，棄上清，將配制好的JC-1染色工作液加入各管，吹打混勻，37 ℃避光孵育20 min。孵育結(jié)束后離心，棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2遍，每管加300 μL PBS重懸細(xì)胞，放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 AnnexinV/PI雙染色檢測細(xì)胞PI陽性率取出培養(yǎng)完畢的細(xì)胞，PBS漂洗2遍，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，吹打混勻成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液移至2 mL EP管內(nèi)，1000 r·min-1離心 5 min，棄上清；預(yù)冷PBS洗滌2次，輕輕混勻，離心后棄上清，然后每組EP管加入500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮沉淀細(xì)胞，再加入5 μL FITC染色液和5 μL PI染色液，混勻，避光室溫孵育15 min，放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.6 Western blot 檢測RIP3蛋白表達(dá)水平將ARPE-19細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長、融合到80%時(shí)，按1.2.1實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞后，用預(yù)冷的 PBS沖洗3次，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用50 g·L-1脫脂奶粉封閉60 min，隨后加入抗 RIP3抗體(11000)，4 ℃ 搖床孵育過夜，然后用TBST 洗5次，每次7 min，與相應(yīng)的 2抗(14000)在室溫下共孵育1 h，用TBST洗5次，每次7 min。將 PVDF 膜用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影后進(jìn)行拍照并保存，以 β-actin為內(nèi)參，使用Image Lab軟件對其進(jìn)行灰度掃描分析，計(jì)算各樣本條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組APRE-19細(xì)胞存活率情況和形態(tài)變化與對照組相比，H2O2組細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；與H2O2組相比，SS31+H2O2組、Nec-1 + H2O2組細(xì)胞存活率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；見表1。在倒置相差顯微鏡下觀察各組APRE-19細(xì)胞形態(tài)變化：對照組細(xì)胞生長良好，H2O2組細(xì)胞形態(tài)皺縮，細(xì)胞間隙明顯增大，且細(xì)胞數(shù)目明顯減少，SS31+ H2O2組、Nec-1+ H2O2組細(xì)胞形態(tài)較 H2O2組明顯好轉(zhuǎn)，死亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖1)。

圖1 倒置相差顯微鏡下各組APRE-19細(xì)胞形態(tài)變化 A：對照組；B：SS31+Nec-1 組；C：H2O2 組；D：SS31+H2O2 組；E：SS31+Nec-1+H2O2 組；F：Nec-1+H2O2 組(×400)

2.2 熒光顯微鏡下雙氯熒光素染色結(jié)果熒光顯微鏡下雙氯熒光素染色結(jié)果顯示：對照組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)僅見微弱綠色熒光；與對照組相比，H2O2組綠色熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯增多；與H2O2組相比，SS31+H2O2組、Nec-1+H2O2組綠色熒光明顯減弱，細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯減少(圖2)。說明SS31和Nec-1能抑制H2O2引起的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖2 各組熒光顯微鏡下雙氯熒光素染色結(jié)果 A：對照組；B：SS31+Nec-1 組；C：H2O2 組；D：SS31+H2O2 組；E：SS31+Nec-1+H2O2 組；F：Nec-1+H2O2 組(×400)

2.3 各組細(xì)胞線粒體膜電位和PI陽性率變化線粒體膜電位的變化可以反映早期線粒體的功能狀態(tài)。JC-1在正常線粒體聚集呈現(xiàn)紅色熒光，而在線粒體損傷、膜電位降低時(shí)呈現(xiàn)綠色熒光，該膜電位降低的細(xì)胞比例以百分率來表示。流式細(xì)胞儀結(jié)果分析得出：與對照組相比，H2O2組線粒體膜電位降低的細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組相比，SS31+H2O2組線粒體膜電位降低的細(xì)胞比例降低(P<0.05)。與SS31作用相類似，Nec-1+H2O2組線粒體膜電位降低的細(xì)胞比例亦降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AnnexinV/PI雙染色結(jié)果顯示：與對照組相比，H2O2組PI陽性率增加；與H2O2組相比，SS31+ H2O2組、Nec-1+H2O2組PI陽性率均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。具體數(shù)據(jù)見表1。這些結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞程序性壞死中，線粒體功能障礙可能參與了這一過程，而SS31和Nec-1都可降低H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞線粒體損傷及程序性壞死。

表1 各組細(xì)胞存活率、膜電位降低的細(xì)胞比例、PI陽性率、RIP3 蛋白相對表達(dá)量

2.4 各組細(xì)胞RIP3蛋白表達(dá)情況Western blot檢測結(jié)果顯示，H2O2處理ARPE-19細(xì)胞6 h后，RIP3蛋白的表達(dá)開始升高，24 h時(shí)RIP3 蛋白表達(dá)水平最高(P<0.05)。與對照組相比，H2O2組RIP3 蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組相比，SS31+ H2O2組、Nec-1+H2O2組RIP3 蛋白表達(dá)上調(diào)作用顯著減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見表1。

3 討論

AMD的發(fā)病機(jī)制與補(bǔ)體系統(tǒng)、炎癥通路及氧化應(yīng)激等因素密切相關(guān)。RPE細(xì)胞是維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要細(xì)胞，氧化應(yīng)激損傷RPE細(xì)胞在AMD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷會導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡[14-15]。最近的研究表明，程序性壞死是RPE細(xì)胞在氧化應(yīng)激下死亡的主要機(jī)制[5-6,16]。程序性壞死是近年來發(fā)現(xiàn)的一類受死亡信號的調(diào)控、非依賴Caspase的新型細(xì)胞死亡方式[17]，在此過程中，受體相互作用蛋白RIP發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用，是反映程序性壞死的重要指標(biāo)。程序性壞死的特異性阻斷劑Nec-1正是通過作用于RIP1和RIP3的激酶部分而發(fā)揮作用。Hanus等[6]證實(shí)，在氧化應(yīng)激作用下，RPE細(xì)胞出現(xiàn)ATP耗竭、RIPK3聚集，核膜和質(zhì)膜滲漏及破壞，這是RPE細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的主要特征；應(yīng)用RIP的抑制劑Nec-1或敲除RIPK3都可挽救氧化應(yīng)激引起的RPE細(xì)胞死亡。這表明RIPK3對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞程序性壞死至關(guān)重要。與他們的研究結(jié)果相類似，本研究觀察到H2O2引起RPE細(xì)胞損傷的同時(shí)，可上調(diào)RPE細(xì)胞RIP3蛋白的表達(dá)水平，從細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)一步證實(shí)，H2O2可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。為了進(jìn)一步證實(shí)程序性壞死在H2O2損傷RPE細(xì)胞中的作用，我們觀察了程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1對H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷的影響；結(jié)果表明，Nec-1不僅能抑制RIP3蛋白表達(dá)上調(diào)，還能減輕H2O2引起的RPE細(xì)胞多種損傷，使細(xì)胞存活率升高，ROS生成和線粒體膜電位的下降均減少，降低H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞壞死。

SS31是一種線粒體靶向性小分子短肽[18]，具有內(nèi)在抗氧化活性。研究表明，SS31能消除H2O2、羥基自由基和過氧亞硝酸根離子的活性，SS31還能夠降低生理及病理?xiàng)l件下細(xì)胞及線粒體中ROS的含量，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換，防止線粒體腫脹[19-20]，SS31能保護(hù)661W細(xì)胞、小梁網(wǎng)細(xì)胞及人晶狀體上皮細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激損傷、線粒體損傷、凋亡等一系列的損傷過程[21-22]。本研究探討SS31對H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞程序性壞死是否具有保護(hù)作用，為 SS31的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。我們研究發(fā)現(xiàn)，線粒體靶向肽SS31可通過抑制RIP3激酶的激活，從而抑制程序性壞死通路的下游事件，具有抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的程序性壞死的能力。SS31對ARPE-19細(xì)胞有明顯的抗氧化應(yīng)激損傷作用，也能抑制線粒體膜電位的下降、減少壞死率、提高細(xì)胞的存活率。此外，SS31與Nec-1共處理氧化應(yīng)激損傷的ARPE-19細(xì)胞也產(chǎn)生類似的保護(hù)作用。

綜上所述，SS31對氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)程序性壞死和線粒體功能障礙有明顯的抑制作用。SS31作為靶向抗氧化肽為AMD治療提供了基礎(chǔ)證據(jù)。但是，SS31對細(xì)胞的保護(hù)作用是否涉及其他未知的分子機(jī)制及程序性壞死相關(guān)信號通路，還有待進(jìn)一步研究。