王 寧， 朱瑩瑩， 張姣姣， 周羅成， 康 健， 王海嶸

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，上海 200092）

血管內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管內(nèi)壁， 不僅可以調(diào)節(jié)物質(zhì)交換，還具有分泌、免疫、調(diào)節(jié)周圍器官反應(yīng)等功能，其損傷見于感染、腫瘤等多種疾病中[1]。膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染的失調(diào)性宿主反應(yīng)引起的危及生命的器官功能障礙， 而內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是膿毒癥導(dǎo)致器官損傷的重要原因之一[2]。關(guān)于膿毒癥發(fā)生時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的機(jī)制尚不明確， 研究表明， 細(xì)胞的炎癥損傷和凋亡在其中起到重要作用[2]。 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、 建立膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型[3-4]，因此本研究應(yīng)用LPS 誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）損傷。

氯喹（chloroquine，CQ）是一種抗瘧疾藥，不僅由于抗炎、免疫調(diào)節(jié)等特性用于治療自身免疫性疾病[5]，還通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡應(yīng)用于癌癥治療中[6-7]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，CQ 可以通過抑制炎癥因子降低膿毒癥小鼠的死亡率[8]，但CQ 對(duì)膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制尚不明確。 本實(shí)驗(yàn)旨在研究CQ對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HUVEC 損傷的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

細(xì)胞株HUVEC 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。 LPS[大腸桿菌（Escherichia coli）055:B5]購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，CQ 購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司， 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白Ⅴ（annexin Ⅴ）、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、BCL-2、BAX、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 標(biāo)記山羊抗小鼠、HRP 標(biāo)記山羊抗兔抗體購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、 裂解的胱天蛋白酶3 （cleaved caspase 3） 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1. 細(xì)胞分組與處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，計(jì)數(shù)后用90%DMEM 高糖培養(yǎng)基和10%胎牛血清組成的完全培養(yǎng)基配置成濃度為1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。根據(jù)不同處理將細(xì)胞分為對(duì)照組，LPS 組，低、中、高濃度CQ 組，對(duì)照組即不經(jīng)藥物處理的細(xì)胞，LPS 組即用濃度為10 μg/mL 的LPS 作用細(xì)胞， 低、 中、 高濃度CQ 組即在LPS 作用基礎(chǔ)上分別加入濃度為0.1、1 和10 μmol/L 的CQ 作用細(xì)胞；各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行細(xì)胞活力、凋亡檢測(cè)。

2. CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力： 將HUVEC 接種在96 孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞過夜后按實(shí)驗(yàn)分組分別加入LPS、CQ 作用細(xì)胞24 h，然后加入CCK-8 10 μL/孔，在37℃培養(yǎng)箱共同孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（A 值）， 細(xì)胞活力=[（實(shí)驗(yàn)組A 值-空白組A 值）/（對(duì)照組A 值-空白組A 值）]×100%。

3. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將HUVEC 接種在6 孔板中，按上述處理24 h 后，收集細(xì)胞上清液及用無(wú)乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化下來的細(xì)胞至離心管中，1 000 轉(zhuǎn)/min 離心3 min 后棄上清，再用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2 次，1 000 轉(zhuǎn)/min 離心3 min 后棄上清，然后加入1×膜聯(lián)蛋白Ⅴ結(jié)合液，制成終濃度為1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。取100 μL 細(xì)胞懸液至流式管中，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白Ⅴ, FITC 結(jié)合物和5 μL 碘化丙啶 （propidium iodide，PI）溶液，室溫避光培養(yǎng)15 min 后加入400 μL 1×膜聯(lián)蛋白Ⅴ結(jié)合液，上機(jī)檢測(cè)。

4. 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)蛋白的表達(dá)：將HUVEC 接種在6 孔板中，按上述處理24 h后， 用放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，然后用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳120 min，300 mA 橫流轉(zhuǎn)膜80 min 及快速封閉液封閉15 min 后，與BCL-2（1∶1 000）、BAX（1∶1 000）、裂解的胱天蛋白酶3 （1∶1 000）、LC3 （1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜。 次日用TBST洗滌5 min×4 次， 加入HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，再用TBST洗滌5 min×4 次后進(jìn)行曝光顯影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 及Graphpad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪制。 計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD法。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CQ 對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響

通過CCK-8 法分析細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組比較，10 μg/mL LPS 能明顯降低細(xì)胞活力 （P＜0.05）；加入CQ 作用后，與LPS 組比較，低、中濃度CQ 組能一定程度上減輕LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低（P＜0.05）， 高濃度CQ 作用后細(xì)胞活力與LPS 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但低于低、中濃度CQ 作用組（P＜0.05）（見表1）。

二、CQ 對(duì)HUVEC 細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比， LPS 組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS 組相比，用低、中濃度CQ處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），高濃度CQ作用后細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化（P＞0.05），但高濃度CQ 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率較低、 中濃度CQ 組有所升高（P＜0.05）（見表1）。

表1 不同濃度CQ 對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡的影響（均n=5，±s/%）

表1 不同濃度CQ 對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡的影響（均n=5，±s/%）

1）：與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）：與LPS 組比較，P＜0.05；3）：與低濃度CQ組比較，P＜0.05；4）：與中濃度CQ 組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞活力 細(xì)胞凋亡對(duì)照組 97.5±3.85 8.17±2.07 LPS 組 71.23±3.491） 25.47±2.281）低濃度CQ 組 82.57±4.102） 18.73±2.052）中濃度CQ 組 85.13±2.462） 14.77±1.932）高濃度CQ 組 65.87±3.983）4） 29.05±2.343）4）

三、CQ 對(duì)HUVEC 凋亡相關(guān)蛋白的影響

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，LPS 刺激后BAX、 裂解的胱天蛋白酶3 蛋白的表達(dá)升高，BCL-2 蛋白的表達(dá)有所降低，BCL-2/BAX 蛋白比值明顯降低（P＜0.05）；給予CQ處理后，低、中濃度CQ 逆轉(zhuǎn)了LPS 對(duì)上述蛋白的作用，導(dǎo)致BCL-2/BAX 蛋白比值升高（P＜0.05），裂解的胱天蛋白酶3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），但高濃度CQ 作用后，BCL-2/BAX 蛋白比值較LPS 組升高（P＞0.05），裂解的胱天蛋白酶3 蛋白表達(dá)較LPS 組升高（P＜0.05）（見圖1、表2）。

圖1 不同濃度CQ 對(duì)BCL-2、BAX、裂解的胱天蛋白酶3表達(dá)的影響

表2 不同濃度CQ 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響（均n=5，±s）

表2 不同濃度CQ 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響（均n=5，±s）

1）：與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）：與LPS 組比較，P＜0.05；3）：與低濃度CQ組比較，P＜0.05；4）：與中濃度CQ 組比較，P＜0.05

組別 BCL-2/BAX 裂解胱天蛋白酶3 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ對(duì)照組 1.73±0.08 0.94±0.11 0.79±0.11 LPS 組 0.61±0.061） 1.45±0.041） 0.89±0.16低濃度CQ 組 1.52±0.072） 1.13±0.082） 0.81±0.07中濃度CQ 組 1.42±0.062） 1.03±0.072） 1.00±0.17高濃度CQ 組 0.79±0.04 1.59±0.052）3）4） 2.13±0.142）3）4）

四、CQ 對(duì)HUVEC 自噬相關(guān)蛋白LC3 的影響

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3 蛋白發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，LPS 刺激后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與LPS 組相比，低、中濃度CQ 對(duì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也無(wú)明顯作用，而高濃度CQ 作用后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高（見圖2、表2）。

圖2 不同濃度CQ 對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3 表達(dá)的影響

討 論

膿毒癥是急危重癥醫(yī)學(xué)常見病，其發(fā)病率高、致死率高，是全球主要的衛(wèi)生健康問題[9]。 研究發(fā)現(xiàn)， 內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生器官功能障礙的中心環(huán)節(jié)， 而細(xì)胞凋亡是其中的重要機(jī)制之一[2]。 本研究以LPS 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡， 結(jié)果表明LPS 可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞活力， 增加內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，與之前的一些研究結(jié)果[10-11]一致，因此調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能對(duì)改善膿毒癥導(dǎo)致的重要器官損傷具有一定的重要意義。

CQ 是一種經(jīng)典的抗瘧疾藥，由于其抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等特性不斷被挖掘，逐漸應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腫瘤等疾病治療中[12]。近年來一些研究表明，CQ 通過抑制炎癥因子的釋放在膿毒癥相關(guān)的體內(nèi)和體外試驗(yàn)中有一定的療效，但CQ 對(duì)膿毒癥所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用并不明確[13]。

本研究應(yīng)用CQ 干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，觀察不同濃度CQ 對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，CQ 在低、中濃度時(shí)提高細(xì)胞活性，同時(shí)降低LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；在高濃度時(shí)則降低細(xì)胞活性即抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 在百草枯誘導(dǎo)肺損傷的體外模型中， 研究結(jié)果與本研究類似，在較低濃度時(shí)CQ 的應(yīng)用能夠抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡，隨著CQ 濃度增高，細(xì)胞凋亡增多[14]。此外，在癌癥治療中，高濃度CQ 常用來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 因此CQ 對(duì)細(xì)胞凋亡的作用與其應(yīng)用劑量有關(guān)。

細(xì)胞凋亡主要有外源性死亡受體途徑、內(nèi)源性線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[15]。 研究表明，CQ 能夠改變?nèi)苊阁w的通透性參與線粒體凋亡途徑[16]，因此本研究進(jìn)一步研究了CQ 對(duì)線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中濃度CQ 能夠提高BCL/BAX 比值，降低裂解的胱天蛋白酶3 的表達(dá)，表明CQ 在低、 中濃度時(shí)通過線粒體途徑來拮抗LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而CQ 在高濃度時(shí)BCL/BAX比值升高不明顯， 裂解的胱天蛋白酶3 的表達(dá)升高，表明高濃度時(shí)CQ 主要通過非線粒體途徑激活胱天蛋白酶3 途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

LC3 是常用的自噬標(biāo)志物， 存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ2 種蛋白狀態(tài)[17]。 研究顯示CQ 可以影響LC3 蛋白的表達(dá)而影響自噬[18]。 本研究進(jìn)一步研究了CQ 在膿毒癥狀態(tài)下對(duì)于自噬的影響， 發(fā)現(xiàn)低、中濃度CQ 作用時(shí)，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白無(wú)明顯變化， 高濃度CQ 作用時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，LC3-Ⅱ蛋白有明顯的累積，表明CQ 在較低濃度時(shí)不影響自噬，而高濃度時(shí)CQ 提高LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)基礎(chǔ)水平自噬的功能。 綜合本研究結(jié)果提示，引起自噬激活的CQ 濃度高于對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用的CQ 濃度，因此，CQ 在低、中濃度時(shí)改善LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要通過抑制凋亡途徑實(shí)現(xiàn)，與自噬無(wú)關(guān)；本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[19]類似，膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡增加， 而非自噬增加。 CQ 在高濃度時(shí)加重LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能和促進(jìn)細(xì)胞自噬、激活凋亡途徑有關(guān)。

綜上所述, 不同濃度的CQ 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有不同的作用：低濃度時(shí)CQ 能抑制凋亡途徑減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；高濃度時(shí)促進(jìn)自噬，激活凋亡途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 當(dāng)然CQ 在不同濃度時(shí)產(chǎn)生不同作用的機(jī)制仍不是很明確，有待進(jìn)一步研究。