姜遜渭， 王健怡， 肖婷婷， 謝利劍， 侯翠蘭， 張永為

（上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200062）

擴張型心肌病 （dilated cardiomyopathy, DCM）是一種原因未明的原發(fā)性、嚴重影響患兒健康的心肌疾病， 5 年病死率約為15%～50%[1]。 美國流行病學研究表明DCM 患病率為36.5/10 萬[2]。 2001—2002 年，我國調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DCM 患病率約為19/10 萬[3]，DCM 等心肌病給社會、 家庭均帶來沉重的經(jīng)濟負擔?；谶z傳學特點將DCM 分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類[4]。 DCM 的致病原因錯綜復雜，尤其是特發(fā)性DCM，無法判斷致病原因，難以有效控制病情進展。目前，除心臟移植術(shù)外，尚無根治方法。 其次，兒童DCM 的發(fā)病率暫無統(tǒng)計數(shù)據(jù)， 雖然DCM 總的發(fā)病率較低，但我國人口基數(shù)大，經(jīng)濟和醫(yī)療水平分布極其不均衡，推測兒童DCM 發(fā)病率不容樂觀，因此較早地精準診斷疾病的致病原因，顯得頗為重要。

DCM 遺傳學方面的發(fā)病機制取得了令人欣喜的成果，發(fā)現(xiàn)了如肌小節(jié)相關(guān)基因、細胞骨架基因、核膜相關(guān)基因等突變[5]。 對特發(fā)性DCM 患兒家系分析發(fā)現(xiàn)， 其中約5%～10%呈家族性，40%～50%DCM 與遺傳因素有關(guān)[6-7]。目前，對家族性DCM 連鎖分析，定位了26 個連鎖染色體區(qū)段，發(fā)現(xiàn)30 多個致病基因，如心肌肌節(jié)蛋白基因、細胞骨架蛋白基因、Z 盤蛋白基因、鈣調(diào)控蛋白基因等[8-9]。常見致病基因有核纖層蛋白A（lamin A，LMNA）、肌球蛋白重鏈7（myosin heavy chain 7，MYH7）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T type 2, TNNT2）、心臟鈉通道（cardiac sodium channel，SCN5A）、肌球蛋白結(jié)合蛋白C（myosin binding protein C 3，MYBPC3）等。其中伴有轉(zhuǎn)導障礙的絕大多數(shù)與LMNA 基因突變有關(guān)[5,10]。 橋粒斑蛋白（desmoplakin, DSP）基因是第一個被發(fā)現(xiàn)和常染色體顯性致心律失常性右心室心肌?。╝rrhythmic right ventricular cardiomyopathy,ARVC）相關(guān)的基因。研究表明DSP 突變導致PG 核轉(zhuǎn)位并抑制Wnt/p-聯(lián)蛋白（catenin）信號，導致ARVC，DSP 可以調(diào)控心臟內(nèi)的間隙連接和鈉離子通道，從而影響橋粒并致病。

最新美國心臟病學會基金會（American College of Cardiology Foundation，ACCF）/美 國 心 臟 協(xié) 會（American Heart Association，AHA）的診治指南，對于DCM 患者建議進行致病基因的全面篩查[11-12]。本研究利用全外顯子測序 （whole exome sequencing,WES），對一個DCM 家系行致病基因篩查，綜合分析WES 應用于DCM 遺傳檢測的可行性，并對篩查出的致病基因進行分析，功能預測，深入研究DCM的發(fā)病機制，對臨床醫(yī)師精準判斷、診治遺傳性心肌病提供理論依據(jù)。

資料和方法

一、研究對象

2018 年11 月，對我院就診患兒一核心家系進行分析。先證者是4 歲男性患兒，因發(fā)現(xiàn)“心臟超聲異常3 個月余”來本院就診，按照小兒DCM 的診斷流程[4,13]，初步診斷為DCM，患兒接受相關(guān)藥物治療。

二、一般臨床資料

收集該患兒的臨床資料，包括體格檢查、發(fā)病年齡、超聲心動圖及心電圖。 本研究獲我院倫理委員會批準（倫理號為：2017R047-E02）。 患兒父母簽署知情同意書。

三、全外顯子組測序

采集所有研究對象的外周血2 mL， 抽提血液基因組DNA， 使用Roche Nimblegen Seq Cap EZ Exome V3（羅氏）試劑盒，對患兒及其父母的樣本基因外顯子編碼區(qū)及其上下游捕獲并擴增， 建庫（此方法只適用于基因外顯子編碼區(qū)及其上下游5 bp 范圍內(nèi)的點突變和15 bp 以內(nèi)的微小插入/缺失檢測），利用Hiseq 2500 高通量平臺測序，每個樣品產(chǎn)生15 bp 的配對末端測序數(shù)據(jù)，樣本測序深度平均100×， 核心目標序列區(qū)域的測序深度不低于20×。

四、信息學分析

比對參考基因組， 獲得比對到基因組上的Unique mapped reads，并對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測、InDel 檢測、注釋。 測序完成后，利用自主開發(fā)的軟件分析過濾數(shù)據(jù)， 使用BWA-0.7.10 軟件與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對；GATK 軟件識別并過濾單堿基變異、插入缺失變異；利用數(shù)據(jù)庫如千人基因組、ExAC、HGMD、ClinVar、gnomAD、OMIM 和 本 院 的370 例樣本的WES 數(shù)據(jù)庫等進行注釋。 利用SIFT、Mutation Assessor、Polyphen2、Mutation Taster、HSF 等軟件預測候選基因的致病性。 利用NCBI 網(wǎng)站 （網(wǎng)址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene），比對突變位點氨基酸序列的同源性。根據(jù)數(shù)據(jù)庫注釋、軟件預測及其臨床表型，對致病突變位點進行篩選過濾。 得到候選基因突變列表（Candidates.xlsx），對基因突變列表按照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會的遺傳變異分類標準指南解釋[14]。 對遺傳變異經(jīng)過以下步驟進行篩選：優(yōu)先關(guān)注公共數(shù)據(jù)庫中收錄的可能與疾病相關(guān)的遺傳變異， 如小的插入/缺失（indel）、典型的剪切位點改變及錯義變異；根據(jù)正常人數(shù)據(jù)庫過濾＞5%的SNP 突變[已知的最小等位頻率 （minor allele frequency, MAF）≥5%的致病性變異除外]； 篩選過濾掉無義突變、 移碼突變、可變剪切及錯義突變等因素；再與HGMD、Clin-Var 等數(shù)據(jù)庫收錄的遺傳變異進行比對。

五、Sanger 測序

對患兒、 其父母相關(guān)基因突變所在區(qū)域進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物送蘇州泓迅生物科技有限公司進行Sanger 測序。 具體步驟為從NCBI 網(wǎng)站下載DSP 基因DNA 全序列（位點1：NM_004415.2，位點2：NM_004415.2, Genebank ID: 1832）；Primer 5 軟件設(shè)計PCR 引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；利用PCR 試劑盒（天根生化科技有限公司） 進行擴增。 位點1 引物序列：F: 5’-AACCTGCAGAGAACACCAG-3’；R: 5’-ACGATTAAGCCTAGTACCCAT-3’。 位點2 引物序列：F: 5’-CCACCATCAAGGAGATATCCA-3’；R: 5’-CTCTGTTCGCATCTGAGTGAC-3’。 反應條件均為：95 ℃預變性5 min； 然后94 ℃變性25 s，56.5 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。 膠回收、純化，采用正向測序，分析基因序列，然后與標準序列進行比對分析。

結(jié) 果

一、先證者臨床資料

先證者（Ⅲ-1）為男性患兒（見圖1），超聲心動圖檢查提示：左心房、左心室顯著增大，左心室壁無肥厚，左心室呈球樣擴張，室間隔及左心室后壁運動幅度減低，心肌收縮時間不協(xié)調(diào)；左心室舒張末期內(nèi)徑為4.61 cm，左心室收縮末期內(nèi)徑為4.25 cm，左心室收縮功能減低（左心室射血分數(shù)為15%，左心室縮短分數(shù)為7%）（見圖2A）。 二尖瓣瓣葉無明顯增厚卷曲，活動幅度減小，輕中度反流，三尖瓣輕度反流[壓差34 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）]。 左右冠狀動脈開口于左右冠狀動脈竇， 卵圓孔未閉，未見明顯心包積液，肺動脈高壓（見圖2B）。 心電圖提示：竇性心動過速，心房肥大，左、右心室肥大可能，T 波改變（Ⅰ、V6導聯(lián)T 波倒置）（見圖3）。 心肌標志物肌鈣蛋白I 0.53 μg/L （＜0.3 μg/L）， 肌紅蛋白45.90 μg/L（0～75 μg/L），N 末端腦鈉肽15 000.00 ng/L（0～250 ng/L），肌酸激酶117 U/L（20～180 U/L），肌酸激酶-MB 同工酶22 U/L（0～25 U/L）。

圖1 DCM 家系圖

二、致病基因檢測

通過WES 篩查出3 個致病基因， 分別是DSP（NM_004415.2）、DSP（NM_004415.2）、GALNS（NM_000512） 和CDH23 （NM_022124）（見表1）。 查閱OMIM 數(shù)據(jù)庫， 根據(jù)數(shù)據(jù)庫和臨床表型分析，僅DSP 基因突變與臨床表型關(guān)聯(lián)。 WES 測序發(fā)現(xiàn)先證者攜帶DSP 基因雜合突變c.939+1G＞A， 該突變位于DSP 基因第7 內(nèi)含子，患兒母親在該位點呈現(xiàn)雜合突變，父親無突變（見圖4A、B）；先證者同時攜帶DSP 基因雜合突變c.4198C＞T，該突變位于DSP第23 外顯子上，患兒父親在該位點呈現(xiàn)雜合突變，母親無突變（見圖4C）。 DSP 基因c.4198C＞T 突變導致精氨酸突變?yōu)槔i氨酸，Clustal X 分析DSP 基因1 400 位氨基酸殘基的保守性， 發(fā)現(xiàn)其在不同物種之間具有高度保守性（見圖4D）。

圖2 DCM 患兒M 型超聲心動圖

圖3 患兒12 導聯(lián)心電圖

表1 WES 檢測中發(fā)現(xiàn)的與臨床表現(xiàn)無明確關(guān)聯(lián)的基因突變情況

圖4 DCM 患兒及其家系Sanger 測序圖

討 論

DCM 是一種常染色體顯性遺傳病， 主要由編碼肌小節(jié)蛋白的基因發(fā)生突變。 明確DSP 基因突變所致DCM 的臨床特點， 對于此類患兒的早期精準判斷和提高其預后具有重要意義。 DCM 致病基因較多，Sanger 測序等傳統(tǒng)的篩查方法耗時長并且費用較高，存在一定的缺陷。 另外，DCM 的遺傳異質(zhì)性限制了基因篩查在判斷DCM 預后和危險分層中的應用。本研究中通過生物信息學分析，數(shù)據(jù)庫注釋，軟件預測和臨床表型分析，對一個DCM家系進行致病基因的篩查， 發(fā)現(xiàn)患兒的表型可能與DSP 基 因c.939+1G＞A 和c.4198C＞T 突 變 有關(guān)。 OMIM 數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)收錄DSP 基因的c.939+1G＞A 和c.4198C＞T 為有害突變，DSP 可能是DCM的致病基因。

心臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性主要依靠橋粒的支持作用，5 種主要的橋粒蛋白分別為橋粒珠蛋白、血小板親和蛋白2（plakophilin 2，PKP2）、橋粒芯糖蛋白-2、DSP 和橋粒芯膠蛋白。 其中DSP 的N 末端與PG 及PKP2 連接，C 末端與結(jié)蛋白中間纖維絲連接[15]。 近年來有報道DSP 基因第23 外顯子發(fā)生純合子無義突變， 截斷了DSP 的C 末端與結(jié)蛋白相結(jié)合的較大片段，引起DCM、皮膚角化和頭發(fā)逢亂等臨床綜合征[16]。 DSP 基因中導致氨基酸鏈合成提前終止的突變更多，這類突變患者多表現(xiàn)為顯著的左心室射血分數(shù)降低，影像學上有更大范圍的左心室延遲增強，心電圖表現(xiàn)為頻發(fā)的側(cè)壁T 波倒置和右束支傳導阻滯型室性心動過速[17]。 盡管已有文獻報道DSP 基因的c.939+1G＞A 發(fā)生突變與疾病有關(guān)， c.4198C＞T 突變與早發(fā)性心力衰竭、 脫發(fā)和皮膚異常有關(guān)，但是本例患兒DSP 基因突變與全心增大、左心功能降低的疾病表型緊密相關(guān)。

本研究通過外顯子捕獲技術(shù)富集基因組DNA，同時應用SIFT、HSF、Poly Phen 軟件，預測基因突變的致病性，分析臨床表型的同時，能夠較準確地找出相關(guān)的致病基因。 WES 提示與心肌病緊密相關(guān)的DSP 基因突變， 同時也提示GALNS（NM_000512）c.1462G＞A 突變與黏多糖貯積癥，CDH23 （NM_022124） c.4762C＞T 與耳聾/Usher 綜合征有關(guān)， 高通量測序提示該患兒潛在的風險。WES 發(fā)現(xiàn)先證者攜帶DSP 基因雜合突變c.939+1G＞A，患兒母親在該位點呈現(xiàn)雜合突變，父親無突變； 先證者同時攜帶DSP 基因雜合突變c.4198C＞T，患兒父親在該位點呈現(xiàn)雜合突變，母親無突變。該突變導致精氨酸突變?yōu)槔i氨酸，Clustal X 分析DSP 基因1 400 位氨基酸殘基的保守性發(fā)現(xiàn)，其在不同物種之間具有高度保守性。 WES 等二代測序能快速地、準確地捕獲基因序列信息，快速精準地了解遺傳性疾病，通過對家族相關(guān)基因和數(shù)據(jù)庫基因比對分析，能夠較準確地發(fā)現(xiàn)致病基因。 深入分析DCM 的發(fā)病機制，提供新的治療靶點，對患者進行早診斷、早治療，將大大改善DCM 患者的預后。

以上研究體現(xiàn)心肌病遺傳的異質(zhì)性，對致病基因突變進行分析， 深入研究心肌病的發(fā)病機制，為臨床醫(yī)師精準判斷、診治遺傳性心肌病提供理論依據(jù)。 精準醫(yī)學前景廣闊，在心血管領(lǐng)域大有可為[18]。通過WES 二代測序，發(fā)現(xiàn)患者基因突變的位置，并通過后續(xù)的生物信息學分析，對于精準治療心肌病具有重要意義。 其次，基因檢測有益于家族性DCM患兒明確疾病的遺傳機制，對于家系其他成員的早期診斷具有重要意義，對于突變攜帶者，有針對性早期干預、治療、生育前的遺傳咨詢。 因此，對于家系中的攜帶者，應告知其本人及家屬存在的潛在風險，預防并定期隨訪，針對心功能出現(xiàn)的異常情況及時給予干預。