李長江, 李晴, 張莉艷, 鄭玉船, 潘樂, 柯仲成, 李博文

1(黃山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山，245041) 2(黃山學(xué)院 無機(jī)功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 黃山，245041) 3(安徽工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，安徽 馬鞍山，243032) 4(浙江大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州，310058)

鐵是維持生命和生長發(fā)育所必需的微量元素之一，占人體體重的0.006%，人體內(nèi)的鐵主要來源于食物，如豆類、蔬菜、水果、瘦肉、蛋黃、魚類、動(dòng)物的肝臟和腎臟等[1]。鐵在人體內(nèi)許多生理過程中扮演著非常重要的角色，其中最重要的生物學(xué)功能是參與氧的運(yùn)輸和造血過程[2]。機(jī)體內(nèi)鐵含量偏少或過量均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，引起生命體系的紊亂，有研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病的產(chǎn)生與鐵含量正常與否有著密切關(guān)系，如阿爾茲海默癥、帕金森病和亨廷頓病等[3]。缺乏鐵會(huì)引起貧血，降低對(duì)抗感染的能力，損害精神活動(dòng)和智力發(fā)展，但過量攝入鐵也會(huì)引起癌癥、心臟病、肝硬化、糖尿病以及腎衰竭等其他嚴(yán)重疾病，甚至死亡[4-6]。因此，快速準(zhǔn)確地檢測出食品及生物體內(nèi)的Fe3+含量具有重要意義。然而，對(duì)于金屬離子的檢測，普遍使用的是傳統(tǒng)檢測方法，主要有電子耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法、電子耦合等離子體-質(zhì)譜法、原子吸收光譜法、循環(huán)伏安法以及分光光度測定方法等[7-10]。這些傳統(tǒng)檢測方法往往操作繁瑣、成本高，不易于應(yīng)用在大批量和實(shí)時(shí)檢測中。熒光探針具有合成簡單、選擇性好、靈敏度高以及操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，是一種簡易且高效的金屬離子檢測方法[11-12]。

羅丹明類熒光染料具有優(yōu)異的光學(xué)性能，其內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有“開-閉”環(huán)的特性，在處于螺環(huán)狀態(tài)時(shí)，表現(xiàn)為無色和無熒光的性質(zhì)，當(dāng)其與特定的金屬離子結(jié)合后，便會(huì)處于開環(huán)狀態(tài)，從而表現(xiàn)出顏色變化和熒光特性，是一種非常好的金屬離子熒光探針的母體結(jié)構(gòu)，因而備受關(guān)注[13-14]。目前，已有不少羅丹明類探針分子被用于識(shí)別Cu2+、Al3+、Hg2+等，但用于識(shí)別Fe3+的報(bào)道較少，而且存在不足,例如靈敏度低、易受其他金屬離子的干擾等[15-20]。本文以羅丹明B、乙二胺和鄰香蘭素為原料，通過?；腿┌房s合反應(yīng)，合成了一種新型的羅丹明B類金屬離子探針R1。研究表明，R1對(duì)Fe3+具有很好的選擇識(shí)別能力，受其他金屬離子的干擾較小，靈敏度高，能高效地檢測出食品及環(huán)境中Fe3+的含量。同時(shí)其發(fā)光波長能有效的降低生物體自身的熒光干擾，生物相容性好，細(xì)胞毒性低，本研究為進(jìn)一步進(jìn)行生物體內(nèi)Fe3+的檢測提供了一種新方法。

1 材料與儀器

羅丹明B、乙二胺、鄰香蘭素、金屬鹽(除AgNO3外，其他的鹽均為氯化物),阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他試劑,國藥集團(tuán)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。乙醇經(jīng)過除水處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

AM-400 MHz核磁共振儀，德國Brucker公司；LCT Premier XE質(zhì)譜儀，美國Waters公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)、RF-5301PC熒光光譜儀，日本Shimadzu公司；MK3酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；IX71倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 探針R1的合成

探針R1的合成路線如圖1所示。

圖1 探針R1的合成路線

根據(jù)參考文獻(xiàn)[21]合成N-氨乙基-羅丹明B酰亞胺，稱取3.057 5 g羅丹明B于100 mL茄形燒瓶中，加入45 mL無水乙醇，加熱攪拌使其完全溶解，滴加4 mL乙二胺后115 ℃回流，薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將蒸餾濃縮后的反應(yīng)液滴入劇烈攪拌的冰水中，有大量固體析出，抽濾并用乙醇洗滌，得淡粉色偏白的固體，干燥后得產(chǎn)物2.031 5 g，產(chǎn)率66%。柱層析進(jìn)行純化，用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1的洗脫液洗脫，得N-氨乙基-羅丹明B酰亞胺白色粉末。

稱取N-氨乙基-羅丹明B酰亞胺0.524 2 g于50 mL茄型瓶中，加入20 mL無水乙醇，常溫?cái)嚢枋蛊淙芙?。再稱取鄰香蘭素0.154 1 g加入上述溶液中。110 ℃加熱回流，TLC跟蹤反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后濃縮反應(yīng)液，抽濾并用少量無水乙醇洗滌，得亮黃色固體，用無水乙醇進(jìn)行重結(jié)晶最終得針狀黃色晶體0.553 4 g，產(chǎn)率為83%。根據(jù)核磁共振譜圖(圖S1、圖S2)和質(zhì)譜圖(圖S3)可知：1H NMR(400 MHz，CDCl3，TMS)δ：13.55(1H，s)，8.06(1H, s)，7.93～7.91(1H，J=7.3，3.6 Hz，dd)，7.45～7.42(2H，J=5.8，3.0 Hz，dd)，7.1～7.08(1H，J=5.7，3.1 Hz，dd)，6.87～6.85(1H，J=7.6，1.5 Hz，dt)，6.77～6.71(2H，m)，6.45～6.43(2H，J=8.0 Hz，d)，6.40(2H，s)，6.27～6.24(2H，J=8.8，2.6 Hz，dd)，3.85(3H，s)，3.42～3.36(4H，m)，3.35～3.30(8H，J=16.7，9.6 Hz，dd)，1.18～1.14(12H，J=7.0 Hz，t)。13C NMR(100 MHz, CDCl3, TMS)δ：168.21，166.05，153.51，153.37，152.16，148.85，148.47，132.48，131.10，128.82，128.06，123.83，122.96，122.87，118.54，117.58，114.04，108.14，105.44，97.82，64.97，56.64，56.12，56.09，44.36，40.90，12.62。MS，m/z：619.328 9[M]+，理論計(jì)算值619.328 4。

2.2 溶液的配制

分別稱取NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2、CuCl2、ZnCl2、CrCl3、FeCl3、NiCl2、PbCl2、BaCl2、CoCl2、HgCl2、AgNO3、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)，用2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES)緩沖溶液 (1 mol/L, pH 7.3)溶解配制成3 mmol/L的溶液，避光處放置備用。再用乙腈配制濃度為3 mmol/L的探針R1溶液。

2.3 探針離子選擇性的研究[22]

用移液槍分別往15根7 mL的離心管中加入2.9 mL乙腈水溶液[V(水)∶V(乙腈)=1∶4]和30 μL R1溶液，然后再向其中1根離心管中加入70 μL去離子水作為比對(duì)樣，剩下的14根離心管中分別加入70 μL配制好的3 mmol/L上述含有不同金屬離子的溶液。反應(yīng)片刻后，觀察記錄溶液顏色和熒光的變化。并用紫外可見分光光度計(jì)和熒光光譜儀分別測量可見吸收和熒光發(fā)射光譜。

2.4 探針離子干擾性的研究[23]

通過離子選擇性的研究，得出R1對(duì)Fe3+具有較好的選擇性。在離子選擇性研究中，除含F(xiàn)e3+以外其余14根離心管中，用移液槍分別加入70 μL的FeCl3溶液，反應(yīng)片刻，用紫外可見分光光度計(jì)和熒光光譜儀分別測量可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

2.5 探針靈敏度的研究[24]

取16根離心管，用移液槍分別加入30 μL的R1溶液，并以10 μL為梯度，分別加入從0到150 μL的FeCl3溶液，為保證總體積為3 mL，乙腈水溶液相對(duì)應(yīng)的從2.97 mL調(diào)整到2.82 mL，反應(yīng)片刻，分別測量可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

2.6 探針與Fe3+反應(yīng)機(jī)理的研究[25]

在2.4中加入FeCl3溶液的離心管里，滴加2倍體積EDTA溶液，并用紫外可見分光光度計(jì)測量溶液于530 nm處的吸光度。接著用移液槍分別向11根離心管中加入2.7 mL的乙腈水溶液，然后同時(shí)加入R1溶液和FeCl3溶液，保持R1和FeCl3溶液的體積之和為300 μL，以30 μL為1個(gè)梯度，F(xiàn)eCl3溶液加入體積從0 μL到300 μL，R1的體積則相反，從300 μL到0 μL。反應(yīng)片刻，用紫外可見分光光度計(jì)分別測量530 nm處的吸光度。

2.7 探針細(xì)胞毒性的研究[26]

在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的氣氛下，待96孔板中HeLa細(xì)胞密度達(dá)到5 000個(gè)/孔時(shí)，加入不同濃度的R1、Fe3+或R1+Fe3+進(jìn)行孵育，以未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。孵育48 h后，取出培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖溶液(phesphate buffer saline, PBS)洗滌3次，然后加入含有0.5 mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT)的改良依格爾培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)孵育4 h。待孵育完畢，96孔板中每個(gè)孔加入150 μL的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)并用酶標(biāo)儀在530 nm處記錄吸光度。

2.8 探針細(xì)胞成像的研究[26]

在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的氣氛下，在6孔板上用添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)(80 000個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h，直到細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%。然后用5 μmol/L探針孵育6 h，取出培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后，再將探針處理過的細(xì)胞與10 μmol/L Fe3+進(jìn)行孵育，孵育2 h后取出培養(yǎng)基并用PBS洗滌孵育后的細(xì)胞3次，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針的離子選擇性

加入不同離子的R1溶液出現(xiàn)了肉眼可見的變化，如圖2-a所示，加入Fe3+的R1溶液顏色出現(xiàn)了橘紅色，其他離子均未使R1溶液的顏色發(fā)生改變。如圖2-b所示，在365 nm紫外光照射下，加入Fe3+的R1溶液呈現(xiàn)出明亮的橘黃色熒光信號(hào)。加入其他離子的R1溶液均未發(fā)生明顯的熒光信號(hào)變化。

a-在可見光下；b-在365 nm紫外光照射下

通過光譜的測量分析，加入Fe3+的R1溶液在530 nm出現(xiàn)最強(qiáng)吸收峰，在550 nm出現(xiàn)了最大熒光發(fā)射峰，而其他離子在530 nm(圖3-a)和550 nm(圖3-b)處沒有出現(xiàn)明顯的吸收峰。表明R1對(duì)Fe3+表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)，對(duì)其他離子沒有響應(yīng)，說明其對(duì)Fe3+具有高效的選擇性和專一性。

a-可見吸收光譜；b-熒光發(fā)射光譜

3.2 探針的離子干擾性

為進(jìn)一步說明R1對(duì)Fe3+具有高效的選擇性和專一性，在離子選擇性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，往含有不同離子的體系中加入等量的Fe3+，反應(yīng)片刻后，各體系均呈現(xiàn)出明顯的顏色和熒光變化。由圖4可以看出，在其他離子共存的情況下，混合體系在530和555 nm處均出現(xiàn)相近的峰值，說明其他離子的存在不影響R1對(duì)Fe3+的響應(yīng)，探針具有很好的抗干擾性。

圖4 R1在Fe3+與其他金屬離子共存情況下的可見吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)。

3.3 探針的靈敏度

如圖5所示，當(dāng)Fe3+濃度從0 μmol/L逐漸增加至150 μmol/L時(shí)，530 nm處的可見吸收峰也逐漸增高，通過最高點(diǎn)峰值圖的繪制，可以看出當(dāng)Fe3+濃度在60～150 μmol/L的范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，對(duì)此區(qū)間進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程Y=1.037×10-2X-0.587，R2值為0.998 73。

圖5 R1在不同F(xiàn)e3+濃度下的可見吸收光譜(a)和R1在530 nm處吸光度的線性擬合(b)

從圖6可以看出，隨著Fe3+濃度逐漸增大(0～150 μmol/L)，555 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，繪制不同濃度下對(duì)應(yīng)的最高點(diǎn)峰值圖，可以看出在50～140 μmol/L的Fe3+濃度范圍內(nèi)，圖線具有良好的線性關(guān)系，對(duì)此區(qū)間進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程Y=9.64X-403.063，R2值為0.998 98。

圖6 R1在不同F(xiàn)e3+濃度下的熒光光譜(a)和R1在555 nm處熒光發(fā)射的線性擬合(b)

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)所得的線性回歸方程，根據(jù)公式(1)計(jì)算Fe3+檢出限：

LOD=3σ/k

(1)

式中：σ,空白樣測量的標(biāo)準(zhǔn)差;k,線性回歸方程的斜率。

該體系中Fe3+的LOD分別為146 nmol/L(可見分光光度法)和129 nmol/L(熒光光譜法)，遠(yuǎn)低于中國飲用水標(biāo)準(zhǔn)中Fe3+的含量值0.3 mg/L[27](535 7 nmol/L)，說明R1可以很好地應(yīng)用于食品安全等領(lǐng)域中Fe3+含量的檢測。

3.4 探針與Fe3+反應(yīng)機(jī)理

一般來說，探針對(duì)金屬離子的選擇性，取決于探針結(jié)構(gòu)中具有孤對(duì)電子如N、O等的配體與金屬離子的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。因此為了探討R1與Fe3+之間的相互作用，選擇了EDTA作為絡(luò)合劑,如圖7所示。

圖7 R1在Fe3+以及含EDTA的Fe3+存在下的可見吸收光譜

當(dāng)R1和Fe3+發(fā)生作用，溶液出現(xiàn)顏色，530 nm處出現(xiàn)紫外吸收峰，由于EDTA對(duì)金屬離子的結(jié)合能力強(qiáng)于其他絡(luò)合劑，所以加入EDTA溶液后，溶液顏色逐漸褪去，530 nm處的紫外吸收峰也隨之消失，并且這一過程是可逆的?？梢酝茢郣1與Fe3+之間的作用與羅丹明母體結(jié)構(gòu)中酰亞胺環(huán)的“開-閉”有密切聯(lián)系。R1具有螺環(huán)和開環(huán)形式，當(dāng)處于螺環(huán)形式時(shí)為無色，但當(dāng)Fe3+加入后，由于配位作用，螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開，伴隨著明顯的顏色和熒光變化，從而達(dá)到檢測Fe3+的目的。

為進(jìn)一步確定R1與Fe3+之間的結(jié)合系數(shù)，采用等物質(zhì)的量連續(xù)變化法(Job’s plot)來測試，由圖8可知，當(dāng)Fe3+的摩爾分?jǐn)?shù)接近0.5時(shí)(即加入的Fe3+和R1等量)，溶液在530 nm處出現(xiàn)最大的可見吸收峰，表明R1和Fe3+是以1∶1的絡(luò)合比進(jìn)行作用的，推斷R1與Fe3+作用的反應(yīng)機(jī)理如圖9所示。

圖8 R1與Fe3+作用的結(jié)合比例

圖9 R1與Fe3+的反應(yīng)機(jī)理

3.5 探針的細(xì)胞毒性

為評(píng)價(jià)R1、Fe3+以及R1+ Fe3+的生物相容性，采用MTT法來考察其對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響。如圖10所示，R1、Fe3+以及R1+ Fe3+加入HeLa細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)濃度低于10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率達(dá)到90%以上；待濃度提高至100 μmol/L，細(xì)胞仍然保持了較高的存活率，其IC50>100 μmol/L。表明R1具有較低的細(xì)胞毒性，體現(xiàn)出良好的生物相容性，為其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效檢測提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖10 R1、Fe3+和R1+Fe3+對(duì)細(xì)胞活力的影響

3.6 探針的細(xì)胞成像

為了證明熒光探針R1能夠在細(xì)胞中檢測 Fe3+， 采用熒光成像技術(shù)對(duì)所制備的熒光探針R1在細(xì)胞內(nèi)的檢測能力進(jìn)行了考察。如圖11所示， 以HeLa細(xì)胞作為研究對(duì)象， 當(dāng)5 μmol/L R1加入到細(xì)胞中培養(yǎng)6 h，再加入10 μmol/L Fe3+處理2 h后，可以明顯地觀察到R1與Fe3+作用所產(chǎn)生的紅色熒光，這直接說明了R1可以迅速被HeLa細(xì)胞攝取，同時(shí)在HeLa細(xì)胞內(nèi)被Fe3+激活，并釋放出具有熒光信號(hào)的配合物R1-Fe3+。

a-R1相位對(duì)比圖像；b-R1熒光顯微圖像；c-a與b重疊圖像；d-R1+Fe3+相位對(duì)比圖像；e-R1+Fe3+熒光顯微圖像；f-d與e重疊圖像

4 結(jié)論

本文用羅丹明B、乙二胺和鄰香蘭素合成了化合物R1，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和離子選擇性、反應(yīng)絡(luò)合比、靈敏度等探針性能的表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R1對(duì)Fe3+具有很好的響應(yīng)，當(dāng)加入Fe3+時(shí)，溶液出現(xiàn)明顯的顏色變化，同時(shí)產(chǎn)生熒光，LOD分別為146 nmol/L(分光光度法)和129 nmol/L(熒光光譜法)，證明R1是一種可視化的Fe3+熒光探針。R1與Fe3+通過絡(luò)合，使得結(jié)構(gòu)中的酰亞胺發(fā)生了“開-閉”環(huán)，Job’s plot曲線顯示絡(luò)合比為1∶1。R1具有良好的生物相容性，可以在活細(xì)胞中成像。因此探針R1在檢測食品、環(huán)境、生物等領(lǐng)域中Fe3+含量有潛在的應(yīng)用前景。