陳蒙恩，韓素娜，侯建光，李建民，陳偉平，李華，鄧杰，胡曉龍

1(河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南 三門峽，472400) 2(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢，643000) 3(鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450002)

大曲是一種富含微生物菌群、菌系及復(fù)合曲香的微生態(tài)制品，具有糖化、發(fā)酵、生香等功能，是中國曲酒的主要糖化發(fā)酵劑和生香劑，其質(zhì)量優(yōu)劣會對白酒釀造過程中的出酒率、酒質(zhì)、風格等造成直接影響[1-3]。優(yōu)質(zhì)大曲曲香味突出，功能微生物數(shù)量能達到曲酒工藝生產(chǎn)所需的數(shù)量級，且具有適宜的理化指標。目前，對大曲的研究多趨向于某些特定指標，如感官指標、理化指標以及微生物指標等[4]，而對微生物與相關(guān)指標間的相關(guān)性以及如何在制曲工藝中全面提升大曲品質(zhì)的研究較少。

陶融型大曲是在仰韶地區(qū)自然環(huán)境、生產(chǎn)原料、釀造工藝等因素的前提下，以小麥、大麥、豌豆為原料，經(jīng)自然接種、陶屋培養(yǎng)發(fā)酵而成的陶融型白酒專用大曲[5]。大曲中所富含的細菌、霉菌、酵母菌等是釀造陶融型白酒不可缺少的微生物資源，這些微生物能夠利用原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)進行繁殖代謝，分泌陶融型白酒釀造過程中所需的糖化酶、淀粉酶等各種酶系。釀酒原料中的淀粉等大分子物質(zhì)在生物酶和特定條件下，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)而產(chǎn)生種類眾多的芳香類物質(zhì)，這些芳香類物質(zhì)對大曲酒特有香味成分起著重要貢獻作用[6-7]。本研究以陶融型白酒釀造專用大曲為樣本，對不同階段的大曲微生物指標及理化指標進行系統(tǒng)分析[8-9]，對大曲不同生化指標間的相關(guān)性進行研究，為制定陶融型大曲的質(zhì)量標準，改良制曲工藝，提高優(yōu)質(zhì)曲率提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 樣品

樣品取自河南仰韶酒業(yè)有限公司制曲車間。

1.1.2 主要試劑

HCl、甲醛，洛陽昊華化學試劑有限公司；KH2PO4，成都市科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；NaOH、MgSO4·7H2O、Na2HPO4、無水乙醇、葡萄糖，天津市凱通化學試劑有限公司。以上各試劑均為分析純。干酪素(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

細菌培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，胰蛋白胨5，牛肉膏5，NaCl 5，納他霉素1，瓊脂粉12，pH 7.0；酵母培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，豆芽200，氨芐青霉素1，瓊脂粉12，pH 6.0；霉菌培養(yǎng)基(g/L)：去皮馬鈴薯200，葡萄糖20，蛋白胨0.5，KH2PO45，MgSO4·7H2O 3，VB10.1，瓊脂粉12，氨芐青霉素1，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-VS2型超凈工作臺，無錫易純凈化設(shè)備有限公司；DHP 9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、MJ-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱、DHG-9123A型鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；HYG-B型全溫搖瓶柜，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；LPZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠； HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市晶玻實驗儀器廠；UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣方法

選取河南仰韶酒業(yè)有限公司夏季同時入房的5房曲，安曲后在第1、3、5、7、9、15、30天取樣，大曲培養(yǎng)時間為30 d，將成品大曲放置于通風、干燥、常溫環(huán)境中貯存，同時對貯存期60、90、120 d的5房曲進行跟蹤取樣。每房大曲所選樣品事先用紅布條進行標記，在大曲翻曲、并房、打攏、貯存階段仍將其放入指定位置，以便樣品能代表整房曲；每房曲均采用四點中心法進行取樣，樣品粉碎后過40目篩，四分法濃縮至150 g，裝于無菌袋內(nèi)，4 ℃貯存?zhèn)溆?。大曲培養(yǎng)過程和貯存過程溫度的采集：將溫度計事先插入成型后大曲的曲心處，采用四點中心法測量大曲溫度。

1.3.2 水分、酸度測定

水分、酸度的測定方法參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[10-11]。水分含量及酸度分別按公式(1)、(2)計算：

(1)

式中：X，含水質(zhì)量分數(shù)，g/100 g；m1，烘干前稱量瓶加試樣的質(zhì)量，g；m2，烘干后稱量瓶加試樣的質(zhì)量，g；m，稱量瓶的質(zhì)量，g。

(2)

式中：Y，酸度，mmol/10 g；c，NaOH標準溶液的濃度，mo1/L；V1，滴定試樣時，消耗NaOH標準溶液的體積，mL；V0，空白試驗時，消耗NaOH標準溶液的體積，mL；200，試樣稀釋體積，mL；20，取樣液進行滴定的體積，mL。

1.3.3 氨態(tài)氮、還原糖、淀粉含量測定

通過NaOH滴定法對氨態(tài)氮含量進行測定[12-13]；通過3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)比色法對大曲中還原糖含量進行測定[14-15]；采用體積比1∶4的 HCl 進行加熱回流水解，用斐林試劑測定生成的糖[16]。

1.3.4 糖化力、液化力測定

采用DNS法對大曲糖化力進行測定，糖化酶活力定義：1 g大曲在35 ℃、pH 4.6條件下，1 h水解淀粉生成1 mg葡萄糖為1個糖化力單位，以U/g表示[16]。參照QB/T 4257—2011對大曲液化力進行測定，液化酶活力定義：1 g大曲在35 ℃、pH 4.6條件下1 h能液化淀粉1g為1個液化力單位，以U/g表示[17-18]。

1.3.5 發(fā)酵力、酯化力測定

發(fā)酵力以1 g曲樣在25 ℃糖化液中發(fā)酵48 h失去的質(zhì)量(U/g)計算[19]；酯化力以1 g絕干曲在30 ℃條件下反應(yīng)72 h催化己酸和乙醇合成己酸乙酯質(zhì)量計算(U/g)[14]。

1.3.6 蛋白酶活力測定

蛋白酶酶活力測定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[20]。酶活定義：1 g大曲在40 ℃，pH 3.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酸性蛋白酶活力單位，以U/g表示；1 g大曲在40 ℃，pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個中性蛋白酶活力單位，以U/g表示。

1.3.7 大曲微生物含量檢測

采用傳統(tǒng)平板計數(shù)法對不同大曲樣品的細菌、霉菌、酵母、芽孢的含量進行測定。稱粉碎后的樣品1 g溶于99 mL無菌生理鹽水中，搖床振蕩30 min使曲粉充分振蕩均勻。采用梯度稀釋法，將預(yù)培養(yǎng)樣品分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，吸取10-5梯度樣品200 μL涂布于霉菌培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后計數(shù)[25]；分別吸取10-7梯度樣品200 μL涂布于酵母和細菌培養(yǎng)基，酵母培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后計數(shù)[24-25]，細菌培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d后計數(shù)[21-22]；芽孢桿菌要先在80 ℃水浴30 min，對非芽孢桿菌進行預(yù)處理，再選擇牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37 ℃下培養(yǎng)1～2 d后計數(shù)[23]。

1.3.8 理化指標與微生物指標相關(guān)性分析[9,26]

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件和Origin 9.0進行統(tǒng)計分析、繪圖和相關(guān)性分析，顯著性水平設(shè)定在5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標分析結(jié)果

對大曲培養(yǎng)及貯存過程中溫度、水分等理化指標進行測定，結(jié)果見圖1～圖2。隨著安曲時間的增長，氨態(tài)氮、酯化力呈上升趨勢，且隨著時間的增長其上升幅度逐漸減??；糖化力、發(fā)酵力、蛋白酶活力呈先增后降趨勢，最后又略微上升直至恒定狀態(tài)；水分、淀粉含量隨時間的增長呈遞減趨勢，且遞減幅度逐漸減小；酸度呈先升后降趨勢。這主要是因為隨著發(fā)酵時間的增長，微生物數(shù)量快速增長，致使氨態(tài)氮等指標呈上升趨勢，隨著微生物繁殖代謝的持續(xù)進行，大曲溫度急劇上升，低溫微生物大量死亡，糖化力等指標快速下降；隨后一些耐熱芽孢桿菌大量繁殖，造成酸度等指標的波動性變化。

圖1 發(fā)酵時間與溫度的關(guān)系

由圖2可知，大曲培養(yǎng)結(jié)束出房時(30 d),酸度在0.3～1.5 mmol/10 g，水分含量<14%，貯存至120 d時糖化力仍在700 U/g以上，滿足我國輕工行業(yè)標準QB/T 4259—2011對優(yōu)質(zhì)大曲理化指標的要求。大曲的糖化力與溫度變化成一定的負相關(guān)性，在曲溫較低時酶活力較高，說明大曲中淀粉酶主要靠低溫微生物產(chǎn)生，這與傳統(tǒng)研究結(jié)果相一致。蛋白酶活力呈先增后降再增趨勢，這與大曲培養(yǎng)過程中品溫變化有關(guān)。溫度過高使已形成的蛋白酶失活，在后期品溫降低過程中，部分產(chǎn)蛋白酶的微生物再次復(fù)活，致使最終蛋白酶活力達到一定高度。在120 d時，大曲蛋白酶活力仍保持在35 U/g左右，滿足優(yōu)質(zhì)大曲標準。蛋白酶能通過美拉德反應(yīng)，將大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)換為曲香形成的前體物質(zhì)[27]，因此，蛋白酶活力的高低往往決定了大曲風味物質(zhì)的含量。

圖2 時間與理化指標的關(guān)系

2.2 大曲培養(yǎng)及貯存過程微生物指標變化

采用平板分離法對大曲微生物進行研究，結(jié)果見圖3和圖4。入房前3 d，細菌、霉菌、酵母、芽孢數(shù)量都急劇增加,隨著發(fā)酵時間增長、曲溫升高，低溫微生物數(shù)量下降,曲溫升至50 ℃左右時，大部分真菌已死亡，耐高溫芽孢桿菌大量繁殖。細菌數(shù)量在5 d時處于最大值，可能此時品溫最適合高溫細菌生長；5 d后細菌數(shù)量開始下降，可能是由于溫度過高，一些芽孢桿菌開始進入芽孢休眠狀態(tài)。大曲培養(yǎng)過程中酵母菌數(shù)量一直變化不大，可能是由于大曲入房溫度過高，且培養(yǎng)過程中升溫過快，超過了酵母菌生長繁殖的最佳溫度所致。成品大曲入庫后，由于大曲水分較低，無法滿足微生物生長代謝對水分的需求，致使各種微生物含量基本處于恒定狀態(tài)。從整個大曲微生物區(qū)系分析，在培菌期(0～10 d)，大曲微生物以細菌和霉菌為主；培菌期后以耐熱芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌和芽孢為主；成品大曲中，細菌、霉菌、芽孢含量相差不大，酵母含量較低。

圖3和圖4結(jié)果表明，在大曲培養(yǎng)初期(0～7d)酵母含量略有上升，之后迅速下降至培養(yǎng)初期數(shù)量，120 d時其含量在1.9×105CFU/g左右。大曲中的有益霉菌，如曲霉、根霉，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種復(fù)合酶類，在白酒釀造過程中主要起糖化水解作用。霉菌數(shù)量在培菌后期雖然有下降，但在大曲中仍占一定比例，在貯存至120 d時其含量在1.6×105CFU/g左右，這也是成品大曲糖化力最終保持在700 U/g以上的原因。細菌是白酒釀造微生物的重要組成部分，芽孢桿菌在一定程度上對白酒的風味和質(zhì)量起關(guān)鍵作用。大曲在培養(yǎng)至第10天時，芽孢數(shù)量有所下降，可能是因為第10天翻曲，曲房及大曲品溫下降，致使部分芽孢從休眠中復(fù)蘇所致。在大曲貯存至120 d時，細菌含量保持在1.4×107CFU/g左右，芽孢含量在5.6×107CFU/g左右，芽孢含量仍處于較高數(shù)量級，可滿足生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)白酒所需。

圖3 時間與微生物指標的關(guān)系

圖4 大曲培養(yǎng)及貯存過程不同類型微生物數(shù)量占比

2.3 相關(guān)性分析

大曲發(fā)酵和貯存過程中，其生化指標之間存在一定的相關(guān)性。如表1所示，酸度與細菌數(shù)量、糖化力與霉菌數(shù)量、發(fā)酵力與酵母數(shù)量、蛋白酶活力與酯化力、還原糖與水分含量、水分含量與淀粉含量等指標之間呈顯著正相關(guān)性，水分含量與時間、淀粉含量與時間、水分含量與氨態(tài)氮、液化力與還原糖、氨態(tài)氮與淀粉含量等指標之間呈顯著負相關(guān)性，這與楊勇等[9]對中高溫大曲指標的研究結(jié)果一致。表1結(jié)果表明，隨著發(fā)酵的進行，大曲中淀粉含量逐漸被消耗，水分含量逐漸降低；發(fā)酵初期糖化力和發(fā)酵力呈快速上升趨勢，這與霉菌和酵母數(shù)量的變化呈一致性，說明此時的曲溫處在霉菌及酵母菌最佳的生長范圍內(nèi)；隨著曲溫的進一步升高，霉菌和酵母數(shù)量的增殖受到影響，致使糖化力和發(fā)酵力總體呈下降趨勢，說明發(fā)酵力主要由酵母提供，糖化力主要霉菌提供，這與王世寬等[28]的研究結(jié)果一致；酯化力和酸性蛋白酶活力顯著正相關(guān)，說明大曲中相關(guān)微生物新陳代謝所產(chǎn)生的有機酸促進了蛋白酶的合成[29]，同時，有機酸的產(chǎn)生也為后續(xù)的酯化反應(yīng)提供了前體物質(zhì)。

表1 大曲生化指標的相關(guān)性

3 結(jié)論

本文以陶融型大曲為研究對象，對其培養(yǎng)及貯存過程中生化指標變化規(guī)律及相關(guān)性進行深入分析，結(jié)果表明，陶融型大曲生化指標在其培養(yǎng)及貯存過程中呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，且不同指標之間具有一定的相關(guān)性。在發(fā)酵初期(0～7 d)，酵母、霉菌、細菌大量繁殖，發(fā)酵力、糖化力、蛋白酶活力、酸度等指標急劇上升，水分、淀粉含量則快速下降；發(fā)酵中期(8～15 d)，霉菌、酵母數(shù)量速降，一些耐熱的芽孢桿菌占據(jù)優(yōu)勢，糖化力、發(fā)酵力等指標急速下降，酸度持續(xù)上升，且酸度、蛋白酶活力在發(fā)酵中期達到峰值；發(fā)酵末期(16～30 d)，大曲中微生物以細菌、芽孢桿菌占主導(dǎo)地位，酸度、淀粉含量、酯化力、蛋白酶活力等指標下降至穩(wěn)定狀態(tài)。貯存至120 d時，大曲糖化力保持在700 U/g以上，液化力在0.8 U/g左右，發(fā)酵力在0.8 U/g左右，蛋白酶活力在40 U/g以上，酯化力在20 U/g以上，細菌數(shù)量在1.4×107CFU/g左右，酵母數(shù)量在1.9×105CFU/g左右，霉菌數(shù)量在1.6×105CFU/g左右，芽孢數(shù)量在5.6×107CFU/g左右。相關(guān)性分析結(jié)果表明，酸度與細菌數(shù)量、糖化力與霉菌數(shù)量、發(fā)酵力與酵母數(shù)量、蛋白酶活力與酯化力、還原糖與水分含量、水分含量與淀粉含量等指標之間呈顯著正相關(guān)性，水分含量與時間、淀粉含量與時間、水分含量與氨態(tài)氮、液化力與還原糖、氨態(tài)氮與淀粉含量等指標之間呈顯著負相關(guān)性。

陶融型白酒在生產(chǎn)中采用陳曲釀酒，大曲貯存時間為3～6個月。隨著貯存期的增加，雖然大曲的一些生化指標會有所下降，但貯存期的延長，卻使得大曲曲香更加濃郁，釀出的酒質(zhì)也更加柔和。本文雖然對陶融型大曲相關(guān)指標進行了多方位多因素研究，但大曲微生物群落及其多酶體系的演變機理尚不清楚，后續(xù)將通過現(xiàn)代分子生物學與代謝組學相結(jié)合，對陶融型大曲生化功能的形成進行解析，為改良制曲工藝及指導(dǎo)后期釀酒提供理論參考。