裴緒澤，李益民，杜聰，袁文杰

(大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116024)

谷氨酰胺因其在人體血漿和肌肉中含量都較高，并且在人體的生理生化過程中起到重要的作用，一直是一種重要的氨基酸產(chǎn)品。但谷氨酰胺在使用、保存等方面存在著種種問題，因此需要尋找替代品來發(fā)揮它的功效。二肽是最簡單的含酰胺鍵的組分，存在許多特殊而有趣的生物學(xué)活性[1]。丙谷二肽作為重要的二肽之一，具有溶解性好，熱穩(wěn)定性高以及進入人體可以快速降解成谷氨酰胺等優(yōu)點[2-4]，在許多功能性食品、保健品和藥品中被廣泛使用[5-7]。丙谷二肽的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成與生物酶法2種[8]。人們對化學(xué)合成丙谷二肽研究較早，有氨基保護法、羧基內(nèi)酸酐法等[9-10],但存在著生產(chǎn)步驟較多，有毒害物質(zhì)參與生產(chǎn)過程等缺點。采用生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽，具有生產(chǎn)過程中無毒無害，反應(yīng)速率較快，專一性較強，副產(chǎn)物少等優(yōu)點，被廣泛研究[11-12]。2005年，YOKOZEKI 等[13]首先發(fā)現(xiàn)了一種可以用作生產(chǎn)二肽的L-氨基酸連接酶。但α-酯?；D(zhuǎn)移酶比L-氨基酸連接酶具有更好的底物選擇性和更快的生產(chǎn)丙谷二肽速率[14]。本實驗前期通過采用氨基酸突變與密碼子優(yōu)化等策略分別實現(xiàn)了α-酯?；D(zhuǎn)移酶在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達，完成了丙谷二肽的高效合成[15-16]。

高密度發(fā)酵策略是一種可以顯著提高微生物產(chǎn)率的方法，被廣泛應(yīng)用到原核微生物、真核微生物以及藻類發(fā)酵過程的優(yōu)化中[17-19]。在微生物高密度發(fā)酵過程優(yōu)化中，影響因素主要有培養(yǎng)基構(gòu)成、補料方式、溶氧、pH、代謝產(chǎn)物、外源蛋白的誘導(dǎo)方式等[20]。

為進一步降低培養(yǎng)過程成本，本文以實驗室構(gòu)建的表達α-酯?；D(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌為出發(fā)菌株[15]，研究其高密度培養(yǎng)策略。實現(xiàn)了該菌株的高密度發(fā)酵，并且在高密度培養(yǎng)下的重組菌株表達的酯酰基轉(zhuǎn)移酶具有較好的活性，為采用生物法制備丙谷二肽的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

本實驗中，發(fā)酵使用試劑均為分析純或以上水平，實驗所用的液相色譜相關(guān)試劑均為色譜純級別。高密度發(fā)酵過程中使用的葡萄糖為工業(yè)純。O2，純度99%。

實驗菌株為本實驗室構(gòu)建的E.coliBL21-pET29a-SsAET菌株。

分析儀器主要包括S6000高效液相色譜儀，華譜公司；Muitigo酶標儀，Thermo公司；Bio-3L發(fā)酵罐，上海百侖公司。

1.2 實驗流程

本實驗流程如圖1所示。以生物量和丙谷二肽產(chǎn)率作為優(yōu)化主要參考因素，通過搖瓶條件和發(fā)酵罐條件對菌株培養(yǎng)方法進行選擇，最終確定該菌株高密度、高酶活力的發(fā)酵方式。

圖1 實驗流程圖

1.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

重組菌株在活化之后，以1%體積分數(shù)的接種量接入到含有50 μg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基中，在37 ℃, 200 r/min的條件培養(yǎng)6～8 h后，加入0.05 mol/L的 IPTG，在18 ℃，180 r/min 的條件下培養(yǎng)過夜。之后對菌體進行收集，通過底物轉(zhuǎn)化率以及菌體生物量篩選最佳培養(yǎng)基。

首先選取LB 培養(yǎng)基、TB 培養(yǎng)基、M9 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，之后在選定培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對其碳源、氮源以及無機鹽的種類進行優(yōu)化。其中碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖。氮源包括酵母浸粉、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉膏、酵母浸粉與胰蛋白胨混合物。

確定碳源、氮源種類后，以培養(yǎng)基中的碳源、氮源以及無機鹽含量作為主要因素，以最終菌體的OD620值和丙谷二肽生成率作為響應(yīng)值，利用Box-Behnken Design 方法建立響應(yīng)面模型[22-23]，從而模擬出最佳的培養(yǎng)基組成。響應(yīng)面設(shè)計情況如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計

1.4 高密度條件優(yōu)化

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在3 L發(fā)酵罐中對于高密度發(fā)酵中的影響因素進行研究。發(fā)酵參數(shù)為溫度37 ℃，pH 7.1，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，溶氧通過O2和空氣混合氣通氣來調(diào)節(jié)[24]。菌體培養(yǎng)過程結(jié)束后向發(fā)酵罐中加入0.05 mol/L的 IPTG，在18 ℃，180 r/min 的條件下誘導(dǎo)外源蛋白表達。誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體，檢測底物轉(zhuǎn)化率。

首先研究pH對于發(fā)酵罐培養(yǎng)的影響，通過使用體積分數(shù)為50%的NH3·H2O調(diào)節(jié)pH值為7，另一組不調(diào)節(jié)pH。之后比較了補料種類對于發(fā)酵的影響，一組使用600 g/L的葡萄糖作為補料培養(yǎng)基，另外一組使用含有600 g/L的葡萄糖為碳源，48 g/L 的m(酵母浸粉)∶m(胰蛋白胨)=2∶1的混合氮源作為補料培養(yǎng)基。發(fā)酵5 h左右開始進行補料處理，補料速率為10 mL/h。實驗中除變量外其他發(fā)酵條件相同，檢測發(fā)酵過程中生物量與殘?zhí)橇俊?/p>

補料方式對于高密度發(fā)酵有著很大的影響。發(fā)酵后5 h左右開始進行補料處理，分別使用2種方式：溶氧控制的補料，當(dāng)溶氧>20%時開始補料，通過溶氧反饋級聯(lián)調(diào)節(jié)方式進行[25-26]；pH反饋控制補料，當(dāng)pH>7.1時開始補料，通過pH反饋級聯(lián)調(diào)節(jié)方式進行[26-28]。其他發(fā)酵條件相同，檢測發(fā)酵過程中生物量與殘?zhí)橇俊?/p>

1.5 丙谷二肽合成

取培養(yǎng)好的重組大腸桿菌，離心細胞，去上清液后重懸細胞，根據(jù)之前測出的OD620值稀釋，使得反應(yīng)液中生物量相同，在7～10之間。在反應(yīng)罐內(nèi)加入1.46 g谷氨酰胺和2.79 g丙氨酸甲酯鹽酸鹽，加入90 mL 硼酸-硼砂緩沖液。在25 ℃下使用6 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，加入10 mL 的重懸菌液開始反應(yīng)。反應(yīng)5 min 后取樣，離心取上清液，于4 ℃保存進行下一步檢測。

1.6 分析方法

產(chǎn)物有丙谷二肽、2種底物是丙氨酸甲酯鹽酸鹽、谷氨酰胺。首先對3種物質(zhì)進行衍生化處理，之后進行高效液相色譜分析。通過紫外檢測器配C18色譜柱檢測。流動相A:V(乙酸鈉溶液)∶V(乙腈溶液)=93∶7,流動相B:純乙腈溶液,采用梯度洗脫的方式檢測丙谷二肽。流速1 mL/min，檢測器溫度40 ℃，檢測時間40 min，檢測波長254 nm。采用外標法測定樣品中丙谷二肽和谷氨酰胺的濃度，從而計算出丙谷二肽的濃度和底物的轉(zhuǎn)化率。

發(fā)酵過程中溶液的溶氧以及pH通過發(fā)酵罐自帶溶氧電極和pH電極進行檢測。每次使用前對電極進行校準。發(fā)酵過程中的殘?zhí)橇客ㄟ^二硝基水楊酸法檢測。

菌株的生物量通過酶標儀進行檢測，檢測波長620 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為常用于培養(yǎng)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基。3種培養(yǎng)基對于菌體生物量和底物轉(zhuǎn)化率的影響如圖2所示。在相同培養(yǎng)條件下，TB培養(yǎng)基的生物量>其他2種培養(yǎng)基的生物量，并且其底物轉(zhuǎn)化率也是最高的。因此選取TB 培養(yǎng)基為基礎(chǔ),對培養(yǎng)基進行進一步的優(yōu)化。

圖2 不同培養(yǎng)基下菌體的生物量和底物轉(zhuǎn)化率

2.1.2 TB培養(yǎng)基中碳源和氮源優(yōu)化

在選定的TB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，僅改變培養(yǎng)基碳源種類，對菌體生物量和底物轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果見圖3。不同碳源對相同培養(yǎng)條件下菌體生物量與底物轉(zhuǎn)化率存在著一定影響。葡萄糖與果糖作為培養(yǎng)基碳源是較優(yōu)的選擇。通過經(jīng)濟性比較，最終選擇葡萄糖作為最終的培養(yǎng)基碳源。

A-乳糖；B-果糖；C-葡萄糖；D-甘油；E-半乳糖

保持其他培養(yǎng)基成分不變，僅改變氮源種類、菌體生物量和底物轉(zhuǎn)化率的變化見圖4。如圖4-a所示，不同氮源對相同培養(yǎng)條件下菌體生物量與底物轉(zhuǎn)化率存在著影響。單純使用酵母浸粉時，菌體生物量積累最明顯，但是底物轉(zhuǎn)化率較低；玉米漿作為氮源時，底物轉(zhuǎn)化率較高，但是生物量只有其他組的50%左右。綜合考慮，最終選擇同時具有較好的菌體生物量與底物轉(zhuǎn)化率的酵母浸粉與蛋白胨混合使用的氮源作為培養(yǎng)基氮源。圖4-b顯示混合氮源中2種物質(zhì)的配比情況，發(fā)現(xiàn)m(酵母浸粉)∶m(胰蛋白胨)=2∶1時效果最好。

a-氮源對菌體的影響;b-混合氮源比例對菌體的影響

2.1.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

響應(yīng)面分析根據(jù)表1設(shè)計的因素與水平進行實驗。最終實驗擬合模型如圖5所示?？偰Ｐ头讲铒@著(P<0.05)，模型擬合相關(guān)度為95.26%，方差失擬項F值不顯著(P=0.131 4>0.05)。該模型與實際實驗擬合較好，可以用來模擬不同培養(yǎng)基配方對于菌體的生物量與底物轉(zhuǎn)化率的影響。

如圖5所示，任意2個因素之間均存在明顯的交互作用, 并且最優(yōu)值落點均在試驗考察的區(qū)域范圍之內(nèi)。最終確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L，混合氮源[m(酵母浸粉)∶m(胰蛋白胨)=2∶1]質(zhì)量濃度為24 g/L，無機鹽質(zhì)量濃度為4.62 g/L KH2PO4和25.08 g/L K2HPO4。

圖5 響應(yīng)面實驗各組三維圖與等高線圖

2.2 高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 pH的影響

搖瓶實驗中無法及時調(diào)控pH，而在發(fā)酵罐發(fā)酵過程中，pH調(diào)節(jié)是重要的一步[29]。pH調(diào)節(jié)實驗結(jié)果如圖6所示?？刂瓢l(fā)酵罐中pH在7左右，菌體在發(fā)酵至5 h左右可以消耗完原始培養(yǎng)基中的葡萄糖，此時生物量也可以快速地達到較高水平，OD620最高可以達到6.3左右，菌體徹底烘干后的質(zhì)量為5.34 g/L；未調(diào)節(jié)pH一組，菌體生長較緩慢，生物量也相對較差，最高OD620值僅為4.7，菌體徹底烘干后的質(zhì)量為4.42 g/L。收集誘導(dǎo)后的細胞進行酶活性測試，沒有控制pH的重組細胞酶活性較低。pH對于菌體的生長速率和整體活性都具有重要的影響。因此在后續(xù)實驗中，都使用體積分數(shù)為50%的NH3·H2O調(diào)節(jié)pH至7。

圖6 pH對于菌體生物量與殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.2.2 補料種類的影響

為進一步提高菌體密度，需要在培養(yǎng)過程中補料培養(yǎng)。由圖6可知，初始葡萄糖在發(fā)酵開始5 h左右?guī)缀跬耆?，因此選擇5 h左右開始進行補料。補料分為只補碳源和按比例補充碳源和氮源2種情況，實驗結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯?，補料培養(yǎng)基為碳源或者碳源-氮源混合物對于生物量的影響不是很明顯。但補加碳源-氮源混合液可以促使菌體耗糖速率增加，推測補加氮源可以促進生物體合成一些物質(zhì)，并且加快微生物對碳源的吸收[30]。通過重組菌的酶活力測定，也證明了我們的假設(shè)。因此補料培養(yǎng)基為碳源-氮源混合液更有利于菌體實現(xiàn)高密度水平以及表達蛋白。

圖7 補料方式對于菌體生物量與殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.2.3 反饋補料方式的優(yōu)化

發(fā)酵過程中基質(zhì)濃度的變化對發(fā)酵過程存在重要影響。因為菌體的生長處于動態(tài)變化中，勻速補料的方式很難滿足需求。我們采用了溶氧反饋補料和pH反饋補料2種動態(tài)補料的方式來進行補料方式的優(yōu)化，實驗結(jié)果如圖8所示。從實驗結(jié)果來看，采用2種不同反饋方式補料時，發(fā)酵過程中葡萄糖量一直處在較低水平，而菌體持續(xù)生長。對比恒溶氧反饋補料和恒pH反饋補料，可以看出恒溶氧反饋補料，碳源的利用速度更快，而生物量生長更多。接種后培養(yǎng)了27 h，恒溶氧反饋補料的生物量OD620達到58左右，而pH反饋補料的OD620值為43左右。在此基礎(chǔ)上加入IPTG進行外源蛋白的誘導(dǎo)表達。采用溶氧反饋補料時，誘導(dǎo)之后，菌體的生物量繼續(xù)增長，誘導(dǎo)3 h后，OD620值達到了67。而采用pH反饋補料時，添加誘導(dǎo)劑之后繼續(xù)培養(yǎng)3 h，菌體量基本維持不變，甚至出現(xiàn)了下降。因此，控制溶氧在20%的恒溶氧反饋補料更適于表達α-酯酰基轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)。

圖8 反饋補料對于菌體生物量與殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.3 高密度培養(yǎng)的重組菌用于丙谷二肽的生產(chǎn)

在大腸桿菌高密度發(fā)酵過程中，通過采取溶氧反饋補料的方式可以達到較高密度生物量。對高密度培養(yǎng)出的重組菌催化活性進行了測定。由表達轉(zhuǎn)酯酶的重組菌催化的反應(yīng)如圖9所示。

圖9 丙谷二肽合成反應(yīng)式

用溶氧反饋補料培養(yǎng)后的菌體作為全細胞催化劑，進行丙谷二肽的酶催化合成。2種底物丙氨酸甲酯鹽酸鹽和谷氨酰胺，濃度分別為400與300 mmol/L，在重組菌體濃度OD620為0.7時，反應(yīng)5 min，丙谷二肽的生成率達到34.56 g/L，生產(chǎn)效率約為7 g/(L·min)，說明高密度條件下的重組大腸桿菌仍然保持了高活性，可保障該重組大腸桿菌在丙谷二肽的工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用，且能大幅度降低生產(chǎn)成本。為生物發(fā)酵法進行丙谷二肽制備的產(chǎn)業(yè)化提供了技術(shù)支持。

3 結(jié)論

國外市場上，丙谷二肽常被加入到保健品、飲品中，應(yīng)用廣泛，而目前國內(nèi)丙谷二肽的產(chǎn)品則較為單一。隨著中國對醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的重視程度加大以及老齡化現(xiàn)狀的加劇，近些年人們對于丙谷二肽產(chǎn)品興趣增大，如何實現(xiàn)微生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽的工業(yè)化生產(chǎn)成了急需解決的問題。有關(guān)高密度培養(yǎng)重組菌生產(chǎn)丙谷二肽的方法尚未見報道。本實驗先對搖瓶培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的種類、碳源、氮源進行篩選，最終通過響應(yīng)面水平優(yōu)化，確定了表達α-酯?；D(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，在3 L發(fā)酵罐中考察對于發(fā)酵中的補料類型、補料方式等，建立了溶氧反饋補料培養(yǎng)工藝。最終高密度條件下培養(yǎng)的重組菌株，其細胞密度達到搖瓶水平的14倍；同時，高密度條件下培養(yǎng)的重組菌株，丙谷二肽的質(zhì)量濃度達到34.56 g/L，生產(chǎn)效率為7 g/(L·min)，為目前文獻報道最高水平。本研究為進一步工藝放大，實現(xiàn)丙谷二肽工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。